Name: Neuropathogenic的非侵入型大肠杆菌感染乳鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 了解利用大肠杆菌K1建立乳鼠全身感染模型的非侵入型方法，通过口服接种研究细菌定植、易位及中枢神经系统入侵机制。该模型可准确模拟人类新生儿败血症和脑膜炎的自然病程，为研究分子致病机制提供可靠平台。

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本工作得到了医学研究理事会的研究资助 G0400268 和 MR/K018396/1 以及行动医学研究（Action Medical Research）的支持。英国国家卫生研究院伦敦大学学院医院生物医学研究中心也提供了进一步资助。

本研究中进行的所有动物实验均符合国家和欧洲立法要求，并获得了伦敦大学学院药学院伦理委员会和英国政府内政部（HO）的批准。所有动物实验均在内政部项目许可证PPL 80/2243和PPL 70/7773的授权下进行。
1. 大鼠准备
<ol>
	<li>使用无病原体的Wistar新生大鼠进行所有体内实验。</li>
	<li>将所有大鼠窝仔（每窝12只新生大鼠）与其哺乳期母鼠（9–11周龄雌鼠）共同饲养在单独的笼具中，并置于最佳条件下（19–21 °C，45–55%湿度，每小时换气15–20次，12小时光照/黑暗循环）。</li>
</ol>
2. 细菌细胞制备
<ol>
	<li>储存 E. coli 在 -80 °C 条件下将 K1 菌种保存于 20% (v/v) 甘油中。每次实验时，将保存的菌种接种至 Mueller-Hinton (MH) 琼脂平板，37 °C 过夜培养。</li>
	<li>喂食前一天，用单个菌落接种10 ml MH肉汤 E. coli K1 菌落于 37 °C、200 rpm 条件下过夜培养。作为培养基污染的对照，准备 10 ml 未接种的 MH 肉汤，于 37 °C、200 rpm 条件下培养。</li>
	<li>将100 µl过夜培养的细菌悬液转移至9.9 ml MH肉汤中（体积比1:100），于37 °C、200 rpm条件下振荡培养，直至达到对数中期，此时在600 nm波长下测得的光密度值（OD600）为0.6600).</li>
</ol>
3. 新生大鼠的喂养 大肠杆菌 K1
<ol>
	<li>用一只手轻轻抓住动物颈背部，将其垂直固定，使其口腔张开。将无菌移液器吸头缓慢插入动物口腔内，并在30秒的时间内将20 µl接种物（约37 °C）滴入动物口腔中。喂食后立即将动物放回母鼠身边。</li>
	<li>通过将接种物在PBS中进行系列稀释，并点样至MH琼脂平板，验证每只幼鼠已摄入4 - 8 × 106个细菌。</li>
</ol>
4. 定植情况的评估 E. coli K1
<ol>
	<li>用一只手轻轻抓住动物颈部的皮肤。将无菌棉签浸入无菌 PBS 中，然后轻轻擦拭肛周区域。采样后立即将动物放回母体身边。</li>
	<li>将棉签头放入含有 300 µl 无菌 PBS 的离心管中，并置于冰上保存。</li>
	<li>通过在 PBS 中进行系列稀释，并接种至麦康凯琼脂平板，测定可存活细菌的数量。</li>
	<li>通过噬菌体敏感性试验确定有活性的 E. coli K1。使用无菌微生物接种环挑取单个菌落，浸入 200 μl 无菌 PBS 中，随后进行涡旋振荡混合。</li>
	<li>使用无菌微生物接种环，在 MH 琼脂平板上以直线方式划线接种。让平板干燥 30 秒，然后用移液器将 10 µl 噬菌体 K1E（109 噬斑形成单位/ml (PFU/ml)）加至划线中心。于 37 °C 过夜培养平板。</li>
	<li>次日，观察平板上是否出现噬菌体介导的裂解现象。</li>
</ol>
5. 疾病严重程度评估
<ol>
	<li>使用表1中所述的七分制评分系统，每天对每只动物的疾病严重程度进行4至5次评估。</li>
	<li>若动物评分达到或超过7分中的3分，应立即实施安乐死以尽量减少其痛苦，并记录该动物为死亡。</li>
</ol>
6. 新生大鼠的安乐死与血液采集
<ol>
	<li>用一只手轻轻握住动物，露出其头部和颈部。用酒精棉片擦拭动物颈部进行消毒&#160;。使用70%乙醇对一把较大的剪刀进行消毒&#160;，然后用无菌PBS冲洗以去除残留乙醇。</li>
	<li>将动物轻轻悬于培养皿正上方。使用锋利的手术剪剪断新生动物头部，确保血液滴入培养皿中。避免接触头部，以防皮肤菌群污染血液。</li>
	<li>立即用无菌移液管收集血液，并在0.5 ml微量离心管中加入肝素钠盐，使其终浓度为20–50单位/ml，混匀。</li>
	<li>通过在PBS中进行系列稀释并接种至MacConkey琼脂平板，测定活菌数量。通过检测活菌对噬菌体K1E的敏感性，确定活的E. coli K1菌的数量。</li>
</ol>
7. 解剖
<ol>
	<li>对新生大鼠进行断头后，在无菌条件下取出并收集目标组织。将所有器械（如图1所示）用70%乙醇和无菌PBS清洗。</li>
	<li>清洁解剖板，并用70%乙醇完全润湿腹部。将尸体仰卧放置，用无菌针头将其固定在解剖板上：(i) 将左后肢固定在操作台上，(ii) 拉伸尸体并将右前肢固定在操作台上，(iii) 将右后肢和左前肢分别固定在操作台上。</li>
	<li>用镊子夹住下腹部左侧的皮肤，然后使用小型解剖剪从下腹部沿尸体左侧向上剪至胸骨。</li>
	<li>继续用镊子和小型解剖剪将切口横向延伸至胸骨，再从胸骨沿尸体右侧向下剪至下腹部，注意避免损伤任何深层结构。</li>
	<li>最后，使用虹膜弯头解剖镊轻轻将皮肤瓣从胸骨向下牵拉，以暴露腹膜。</li>
	<li>用镊子轻轻提起腹膜，纵向剪开以暴露内脏器官，注意避免损伤任何深层器官。</li>
</ol>
8. 收集胃肠道
<ol>
	<li>辨认胃、小肠、盲肠、结肠及肠系膜淋巴系统。</li>
	<li>用无菌镊子轻轻横断胃的两侧，将其切除，然后放入含有1.6 ml无菌PBS的螺旋盖小瓶中。</li>
	<li>在直肠处横断结肠。用解剖镊子小心地将整个肠组织从尸体中拉出，并置于无菌培养皿中。操作过程中应轻柔进行，以确保肠结构和肠系膜淋巴结构不发生分离。</li>
</ol>
9. 分离胃肠道与肠系膜淋巴系统（图2）
<ol>
	<li>向培养皿中加入 30 ml 无菌 PBS，确保胃肠道完全浸没。</li>
	<li>识别肠系膜淋巴系统的中央团块，并用精细解剖镊夹住；识别小肠最靠近近端的部分，并用精细解剖镊夹住。</li>
	<li>缓慢将肠系膜淋巴系统的中央团块与远端小肠向相反方向牵拉，直至两部分组织完全分离。操作时应小心进行，避免拉伸小肠，以防影响近端、中段和远端小肠区域的可重复取样。将肠系膜淋巴系统置于 300 - 500 μl 无菌 PBS 中，并置于冰上。</li>
</ol>
10. 消化道的切片
<ol>
	<li>在盲肠处横切胃肠道，以分离小肠与结肠。</li>
	<li>将结肠置于 300 - 500 μl 无菌 PBS 中，并放置于冰上。</li>
	<li>从小肠的近端、中段和远端区域采集代表性组织。以小肠中点为基准对齐小肠。</li>
	<li>然后，(i) 采集中点以下 3 - 5 cm 处的组织作为中段小肠，(ii) 采集中点以上 5 - 7 cm 处的组织作为近端小肠，以及 (iii) 采集盲肠前最后 2 cm 的组织作为远端小肠。</li>
</ol>
11. 肝脏的采集
<ol>
	<li>在移除胃部后，辨认大鼠肝脏的三个叶。</li>
	<li>使用精细解剖镊将肝叶从腹腔中轻轻拉开。</li>
	<li>使用精细剪刀切断任何连接的韧带以取下肝脏。将肝脏置于 300 - 500 μl 无菌 PBS 中，并放置于冰上。</li>
</ol>
12. 脾脏的采集
<ol>
	<li>识别脾脏。</li>
	<li>将脾脏从胃部拉开，并使用精细剪刀剪断胃脾韧带。</li>
	<li>将脾脏置于 300 - 500 μl 无菌 PBS 中，并放置在冰上。</li>
</ol>
13. 收集肾脏
<ol>
	<li>移除胃肠道及其他器官后，辨认腹腔后部将显露的肾脏。</li>
	<li>使用精细解剖剪剪断输尿管及任何相连的韧带，并用精细镊子取出肾脏。若肾上腺及脂肪组织仍附着，使用精细镊子和解剖剪将其去除。</li>
	<li>将双侧肾脏置于 300–500 μl 无菌 PBS 中，并置于冰上。</li>
</ol>
14. 收集脑组织
<ol>
	<li>断头后，使用弯头镊子将头部保持直立位置。用另一把弯头镊子纵向夹住头顶的皮肤，并用精细解剖剪进行切口。再用精细解剖剪在靠近颈部的位置纵向剪开其余皮肤。</li>
	<li>用精细镊子从两侧向外牵拉皮肤，暴露颅骨，并用精细解剖剪去除皮肤瓣。将精细解剖剪插入脊髓开口处，沿颅骨向吻端方向剪开。</li>
	<li>用精细镊子将颅骨两侧向外牵拉，剪除颅骨片段。</li>
	<li>用宽头镊子从脊髓开口向吻端方向以向上铲动的动作取出脑组织。用 PBS 清洗脑组织两次，以去除断头过程中残留的血液。</li>
</ol>
15. 组织处理与匀浆化
<ol>
	<li>对于需要进行活力计数或DNA提取的实验，将组织放入含有无菌PBS的离心管中。通过在PBS中进行系列稀释并接种至麦康凯琼脂平板，立即测定活菌数量；或在-20 °C条件下以含20%甘油的溶液短期保存。如需进行DNA提取，应将组织在-20 °C下保存。</li>
	<li>对于需要进行RNA提取的实验，将组织放入适量体积的RNAlater溶液中（每1 mg组织使用10 μl），随后立即在-20 °C下短期保存，或在-80 °C下长期保存。</li>
	<li>对于需要进行成像的实验，将组织放入10 ml Methacarn溶液（60%甲醇、30%氯仿和10%乙酸）中，然后在室温（20 - 25 °C）下保存不超过3周。</li>
	<li>通过比较加入组织前后离心管的重量来计算组织重量。使用匀浆器对组织进行匀浆处理。每次样本匀浆之间，用70%乙醇清洗匀浆器一次，再用无菌PBS清洗两次。 
	注：为保留与黏蛋白相关的黏膜防御结构，肠道样本宜采用Methacarn固定；系统性组织可使用福尔马林固定。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述的动物模型是在先前研究基础上建立的，旨在重现人类自然感染的关键特征。由于满足感染模型所需的关键标准，新生大鼠最初被用于研究b型H. influenzae引起的婴儿脑膜炎。因此，相关病原体的入侵途径应与人类自然感染途径一致，并能稳定地引发相似的病理变化，且病程足够长，以便进行治疗干预。所采用的技术不应限制该方法的适用性，也不应影响疾病结局20。Moxon 及其同事建立的婴儿大鼠H. influenzae脑膜炎模型符合这些标准20；自然感染发生在病原体定植于上呼吸道黏膜之后，这一重要特征通过将细菌无创性地接种至幼鼠鼻腔黏膜得以复制。重要的是，该模型还重现了感染的年龄依赖性特征。
同一研究团队也是首个建立新生大鼠E. coli K1 NBM非侵入性模型的团队22。无病原Sprague-Dawley新生大鼠通过口服胃管喂食108至1010个细菌进行定植；因此，接种剂量明显高于我们所采用的剂量。在检测的三种K1菌株C94（O7:K1:H-）、EC3（O1:K1:H-）和LH（O75:K1:H3）中，喂食K1菌株的动物有相对较高比例（48–74%）实现了定植，但菌血症、脑膜炎和死亡的发生率则存在差异，且显著低于定植率。随后研究进一步证实了E. coli K1实验感染的克隆特性23，目前明确只有O18:K1以及在较小程度上的O7:K1血清型能够持续引起全身性感染。因此，这些关于神经致病性E. coli K1发病机制的研究均基于毒力增强的O18:K1菌株A192PP。比较通过胃管喂食E. coli K1（Glode及其同事所用方法22）与Achtman团队采用的液滴喂食法23发现，前一种方法导致过多死亡，几乎可以确定是由于胃管对黏膜表面造成损伤所致。由于两种方法的定植率相当，因此建议采用侵入性更小的方法，即使用带无菌吸头的移液器喂食细菌，如本文所述。
E. coli A192PP菌株在本研究中使用的是O18:K1血清型。它是临床分离株E. coli A192的一个更具毒力的衍生株，原始菌株最初从一名败血症患者中分离得到27。该菌株毒力的增强是通过在新生大鼠体内连续传代获得的26。该菌株引起的疾病严重程度具有年龄依赖性：给予2日龄动物后，可导致100%的菌血症和死亡率28。相比之下，9日龄动物则完全抵抗该疾病。可使用K1特异性裂解性噬菌体来区分E. coli K1与其他E. coli菌株29。在本研究中，应利用活细菌对K1E噬菌体的敏感性：（i）检测准备喂给动物的E. coli K1菌悬液的纯度；（ii）区分E. coli K1与其他肠杆菌，以便计算肛周拭子、血液及组织样本中的活菌数量。若菌落为E. coli K1，则会对K1E噬菌体裂解敏感，在噬菌体接种部位细菌生长将被抑制；若菌落不是E. coli K1，则对K1E噬菌体裂解具有抗性，在噬菌体接种部位应出现细菌生长区域。需要注意的是，动物模型无法反映自然发生疾病的全部特征。当前模型可进行修改，以研究除E. coli A192PP以外的神经致病菌的毒力特征，也可调整定植接种量的大小。该技术未来的应用可能包括评估治疗该疾病亟需的药物，以及揭示宿主对定植和组织侵袭反应的详细机制。
此处描述的方法简单而有效。采用每窝10至12只幼鼠作为实验组或对照组，这种窝内分组方法可确保高度的可重复性和统计学有效性。任何操作后必须尽快将幼鼠归还给亲生母鼠，因此不应在同一窝幼鼠中实施不同的干预措施。喂饲的接种物必须预先温热，否则幼鼠会拒食所提供的菌液。幼鼠肠道微生物群迅速建立，出生后两天内，胃肠道即被一系列细菌定植，这些菌群所属的门类正是在婴儿及成年肠道中丰度最高的微生物。未接受喂饲的幼鼠 E. coli A192PP 不携带 E. coli 胃肠道中的 K117 因此，定植率的测定相对直接。然而， neuS基于qPCR的定植检测方法 E. coli K1 比传统培养方法敏感得多，强烈推荐使用17.

全身性细菌感染对新生儿的健康和生存构成重大威胁，其中早产儿尤其易感。新生儿细菌性脑膜炎（NBM）常与细菌性败血症相关，在生命最初几周内仍是导致死亡和病患的重要原因，而抗菌药物耐药性的持续演变进一步加剧了这一问题1,2。NBM 属于医疗急症，带来沉重的医疗、社会和经济负担3；因此，迫切需要开发新的治疗方法，特别是创新的预防策略，以减轻感染负担。NBM 的某些特征较为特殊：在发达国家，Escherichia coli（大肠杆菌）和B族链球菌是绝大多数病例的致病原，这些菌株引发 NBM 的能力几乎总是与其具有的保护性多糖荚膜有关，该荚膜可使病原体逃避宿主免疫识别过程4。高达 80–85% 的神经侵袭性 E. coli 表达 K1 荚膜5,6，这是一种 α-2,8 连接的多聚唾液酸聚合物，其结构与宿主神经可塑性调节因子完全相同7。
评估针对新生儿脑膜炎（NBM）及相关菌血症和败血症的新疗法与预防措施，显然需要一种能够模拟人类新生儿疾病关键特征的稳健动物感染模型，特别是年龄依赖性强以及自然感染途径这两个方面。目前已有多种可用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌脑膜炎的模型8,9 这些研究极大地拓展了我们对这些感染性疾病发病机制、病理生理学以及治疗方案的认识。因此，研究人员已利用大鼠、小鼠、兔子和猴子的实验性感染来研究新生儿及成人的脑膜炎。然而，许多此类模型采用直接向小脑延髓池或皮下注射细菌的方式启动感染，通过绕过病原体从定植部位自然播散的过程，从而造成一种人为的发病机制。在某些情况下，这些接种方法导致病理学发生显著改变；例如，皮下给予细菌 大肠杆菌 K1菌株消除了自然感染中与年龄相关的依赖性，可在新生儿和成年个体中均引起菌血症及中枢神经系统（CNS）侵袭10. 易感性 E. coli NBM 的发生极为依赖于病原体在出生时或出生后不久由母亲向婴儿的垂直传播11母源性 大肠杆菌 K1型细菌定植于新生儿胃肠道（GI） tract11-13，出生时无菌，但会迅速定植复杂的微生物群14在定植的新生儿中， 大肠杆菌 K1型细菌能够从肠腔易位至全身循环系统，随后穿过血脑屏障或血-脑脊液屏障进入中枢神经系统9,15在设计可靠的实验感染模型时，应考虑这些细节。
尽管小鼠已被广泛用于某些类型细菌性脑膜炎的研究8，因此不适用于新生儿感染研究：它们会因全身性感染而迅速恶化，且不表现出人类婴儿感染中显著的年龄依赖性特征16。此外，α-防御素是胃肠道的关键肽，可提供针对全身侵袭的保护 E. coli K117在人类和大鼠的潘氏细胞和中性粒细胞中高表达，但在小鼠中不表达18小鼠防御素及相关隐素基因存在显著程度的重复、冗余和异质性，这在其他动物中未见。19新生大鼠最初由 Moxon 及其同事使用20 研究发病机制 流感嗜血杆菌 经鼻接种后发生脑膜炎，模拟该新生儿病原体在人体内的自然定植部位，随后针对年龄依赖性进行了优化 大肠杆菌 K1 菌血症和脑膜炎。Bortolussi 等21 采用腹腔注射细菌接种物以启动感染，但Glode及其同事的关键研究22 采用口服胃管喂养以模拟胃肠道定植后自然感染途径。由于胃管可能损伤黏膜表面，该操作已改进为将接种物喂饲新生鼠23本文描述了胃肠道定植的方法以及在易感幼鼠中追踪感染的实验步骤；此外，还讨论了该模型的治疗和预防应用。

<table><tbody><tr><td>无病原体Wistar大鼠（12只新生幼鼠，1只哺乳期母鼠）</td><td><a href="http://www.harlan.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Harlan, UK</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli K1 A192PP</td><td><a href="http://www.ucl.ac.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Taylor实验室</a></td><td></td><td>Mushtaq &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; 2004</td></tr><tr><td>噬菌体K1E</td><td><a href="http://www.ucl.ac.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Taylor实验室</a></td><td></td><td>Mushtaq &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; 2004</td></tr><tr><td>甘油</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma, UK</a></td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>穆勒-欣顿琼脂</td><td><a href="http://www.oxoid.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Oxoid, UK</a></td><td>CM0037</td><td></td></tr><tr><td>穆勒-欣顿肉汤</td><td><a href="http://www.oxoid.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Oxoid, UK</a></td><td>CM0405</td><td></td></tr><tr><td>麦康凯琼脂</td><td><a href="http://www.oxoid.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Oxoid, UK</a></td><td>CM0007</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma, UK</a></td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>100%乙醇</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma, UK</a></td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma, UK</a></td><td>84020</td><td>配制为20 - 50单位/毫升</td></tr><tr><td>RNA later溶液</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma, UK</a></td><td>R0901</td><td>每毫克组织使用10 &amp;mu;l</td></tr><tr><td>乙酸</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma, UK</a></td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma, UK</a></td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma, UK</a></td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific, UK</a></td><td>11542483</td><td></td></tr><tr><td>Alcotip拭子</td><td><a href="http://www.scientificlabs.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Scientific Laboratory Supplies, UK</a></td><td>SWA1000</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma, UK</a></td><td>P5856</td><td></td></tr><tr><td>30 ml通用管</td><td><a href="http://www.alphalabs.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AlphaLaboratories, UK</a></td><td>CW3890</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml微量离心管</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> StarLab, UK</a></td><td>I1405-1500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml微量离心管</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> StarLab, UK</a></td><td>I1415-1000</td><td></td></tr><tr><td>0.1 &amp;mu;l定量接种环</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> StarLab, UK</a></td><td>E1412-0112</td><td></td></tr><tr><td>L型涂布棒</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> StarLab, UK</a></td><td>E1412-1005</td><td></td></tr><tr><td>比色皿</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific, UK</a></td><td>10594175</td><td></td></tr><tr><td>直头尖头镊子</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12780036</td><td></td></tr><tr><td>直头钝头镊子</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12391369</td><td></td></tr><tr><td>钟表匠用弯头超细尖镊子</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12740926</td><td></td></tr><tr><td>直剪超细尖头剪刀</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12972055</td><td></td></tr><tr><td>实验室剪刀</td><td><a href="http://www.vwr.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VWR, UK</a></td><td>USBE4251</td><td></td></tr><tr><td>25G注射器针头</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One Ltd</a></td><td>N2525</td><td></td></tr><tr><td>LAMBDA 25紫外/可见光分光光度计</td><td><a href="http://www.perkinelmer.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> PerkinElmer, UK</a></td><td>L60000BB</td><td></td></tr><tr><td>Unitemp培养箱</td><td>B&amp;amp;T, UK</td><td>OP958</td><td></td></tr><tr><td>Multitron摇床培养箱</td><td><a href="http://www.infors-ht.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> INFORS HT, UK</a></td><td>AJ118</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Turrax T-10匀浆器</td><td><a href="http://www.ika.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> IKA Werke</a></td><td>0003737000</td><td></td></tr></tbody></table>

新生大鼠中神经致病性escherichia coli感染的非侵入性模型

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

只有当所采用的感染模型能够复制自然感染的主要特征时，对动物宿主与细菌病原体之间相互作用的研究才具有意义。本方案描述了建立和评估新生大鼠因神经致病性大肠杆菌（Escherichia coli）K1引起全身性感染的实验步骤。病原体首先定植于胃肠道，随后沿“肠-淋巴-血-脑”途径播散，该模型表现出显著的年龄依赖性。一株对新生大鼠具有增强毒力的 E. coli O18:K1 菌株，可导致极高的定植率、向血液系统的易位率以及经脉络丛进入后对脑膜的侵袭率。与人类感染相似，病原体侵入中枢神经系统伴随局部炎症反应，并 invariably 导致死亡结局。该模型已被证实可用于病原机制研究、治疗干预评估以及细菌毒力评价。

本文所述的 E. coli K1 全身感染模型复制了人类自然感染的多种特征。细菌经摄入后定植于胃肠道，通过肠系膜淋巴结易位进入血液，继而引发器官特异性疾病，并伴有脑部炎症24。重要的是，该模型表现出显著的年龄依赖性；如图3所示，出生两天（P2）的大鼠幼崽对侵袭性感染高度易感，但在随后的七天内，动物对感染的抵抗力逐渐增强，尽管其对胃肠道定植的易感性并未下降17。细菌从胃肠道定植部位转移至血液后，可通过荧光显微镜在血样中观察到细菌的存在（图4），随后细菌主要经脉络丛进入中枢神经系统25。在部分动物中，细菌还会广泛侵袭其他主要器官，如肺、脾和肾25。
不同幼崽组织中的细菌数量可能存在显著差异25 但当生物负荷被评定为存在或不存在时，关于器官侵袭的检测结果具有高度的可重复性。以每窝12只幼鼠作为一个独立的实验组，通过G*Power软件进行功效分析，结果表明，从该组中选取6只动物进行生存率评估时，该样本量可达到98.6%的效应检出概率。 &gt;综合考虑全部十二个因素时，概率为99%。因此，该模型适用于评估专门针对新生儿细菌感染治疗的新型药物，并已用于评估选择性去除细菌表面K1荚膜的胶囊裂解酶EndoE的治疗潜力24-26它也可用于研究影响细菌致病过程的宿主-细菌相互作用。 E. coli 神经病原体；在此背景下，它已被用于对以下方面的研究 E. coli A192PP 的定植与扩散。已有研究表明 E. coli A192PP细胞在P2、P5和P9幼鼠的胃肠道中大量持续存在；这三个组群在定植的时间特征上非常相似（图5）反映了细菌在肠道内复制并维持种群密度的能力。
为了确保动物使用的最小化或无冗余，临床分离株 A192 通过在新生大鼠体内连续传代以增强其毒力。E. coli A192 能以 100% 的效率定植于出生后第 2 天（P2）的新生大鼠，引发 35% 动物的菌血症，并在 25% 的动物中产生致死效应27。传代获得的衍生株 A192PP 能够定植胃肠道，引发菌血症，并导致所有 P2 幼鼠死亡。因此，该模型可用于研究不同 K1 菌株从定植部位侵入中枢神经系统及其他器官系统的毒力特性。在此背景下，Pluschke 及其同事23利用新生大鼠感染模型评估了 95 株来源于人类的 E. coli K1 菌株在肠道定植后引起菌血症的能力；他们观察到各菌株在定植效率和侵袭能力方面存在显著差异，这进一步支持了 E. coli K1 神经致病菌的克隆性特征。
<img alt="样本制备的实验室设置；可见移液器、小瓶、培养皿、天平。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 组织采集所需材料：(A) 天平，(B) 预先称重并装有必需培养基的离心管，(C) 手术台、直尺及用于固定动物的针具，(D) 70% (v/v) 乙醇和PBS，用于消毒组织采集器械，(E) 组织采集工具包，包括用于断头的大剪刀，以及不同尺寸和形状的剪刀、镊子和刀片，(F) 冰块，用于保存组织，(G) 70% (v/v) 乙醇，用于消毒手术台及周围环境。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="寄生蠕虫解剖；分步实验指南，通过三个图示展示器官提取过程。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 胃肠组织与肠系膜淋巴系统的分离。(A) 使用精细解剖镊夹住肠系膜淋巴系统的中央团块。(B) 夹住小肠的近端部分，并向相反方向牵拉。(C) 胃肠组织与肠系膜淋巴系统将完全分离。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Survival analysis graph; percent survival vs. days post-inoculation; multiple treatment groups." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 口服给药后2日龄（P2）至9日龄（P9）新生大鼠仔鼠的存活情况 E. coli A192PP，表明系统性感染具有显著的年龄依赖性。 每组包含24名新生儿。
<img alt="细胞的荧光显微镜图像；激发分析；带比例尺2μm的示意图。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 口服接种细菌后，从P2幼鼠血液涂片中获得的E. coli A192PP细胞的荧光图像。 细菌表面的脂多糖O抗原使用兔抗O18多克隆抗体及Alexa546标记的山羊抗兔二抗进行染色。K1荚膜使用EndoE-GFP试剂进行可视化。在血液样本中检测到的几乎所有细菌均表现出具有保护作用的K1荚膜。图像由Andrea Zelmer博士采集。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Bacterial growth chart, CFU vs. time; log scale analysis of inoculation post-hours, LOD indicated." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. E. coli 接种细菌后A192PP在肠道内的定植。 从整个肠道中提取了DNA E. coli K1 菌落形成单位/克（CFU/g）组织，通过以多聚唾液酸转移酶（polysialyltransferase）为靶标的定量聚合酶链式反应（qPCR）测定neuS 基因，如 elsewhere 所述17检测限（LOD）。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>特征</td>
			<td>健康</td>
			<td>不健康</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>皮肤颜色</td>
			<td>粉红色</td>
			<td>苍白/发黄</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>敏捷性（翻正反射）</td>
			<td>幼崽在仰卧放置后立即翻转</td>
			<td>翻转困难（> 3 秒）或无法完成</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>轻压腹部</td>
			<td>无声音</td>
			<td>出现躁动声</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胃部/乳线</td>
			<td>可见且呈白色</td>
			<td>不可见</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>体温</td>
			<td>温暖</td>
			<td>相对较冷*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>体重</td>
			<td>每日增重 1.5–2 g</td>
			<td>无体重增长或体重下降</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>放入笼中时的行为</td>
			<td>向母体移动并开始进食</td>
			<td>无法向母体移动且进食困难</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 七分评分系统： 所列前三个评分通常是最初观察到的体征。*患有全身性感染的新生动物体温会升高（&gt; 2 °C）。然而，由于动物活动能力差，无法靠近母体以维持体温，不健康的动物可能脱离仔群体，用手触摸时感觉发凉。

本文描述了一种利用大肠埃希菌 K1（Escherichia coli K1）培养物在新生大鼠中建立全身性感染的方法。该非侵入性操作可实现病原体在胃肠道的定植、向全身血液循环的转位，以及通过脉络丛侵入中枢神经系统。

新生大鼠中神经致病性Escherichia coli感染的非侵入性模型

动物宿主与细菌病原体之间相互作用的研究只有在所采用的感染模型能够复制主要……的情况下才有意义

本实验的目的是为研究大肠杆菌K1型在新生儿败血症和脑膜炎中的分子致病机制提供一种可靠的体内模型。该模型首先通过口服途径将大肠杆菌K1型接种于新生大鼠体内；第二步通过肛周拭子检测确认定植情况。接下来，在预定的时间点收集目标组织和器官，最后一步是将样品在适当的条件下进行处理和保存。最终，可通过多种技术（如活菌计数和定量PCR）对定植程度进行可视化观察和定量分析。与现有的胸骨内注射和皮下注射等方法相比，该技术的主要优势在于能够模拟感染个体中疾病自然进展的途径。演示该操作的是我实验室的博士生 Fat Margain。每个菌群保留12只新生大鼠，与哺乳期母鼠一起在单独的笼具中饲养，维持最佳条件直至实验终点。给予每只动物细菌时，用一只手轻轻垂直提起新生鼠的颈背部皮肤，使其张开嘴，然后缓慢将无菌移液器吸头插入其口腔，注入20 µL接种物。在30秒内完成操作，喂养后立即将动物放回母鼠身边，并每天4至5次使用表格中所述的七分制评分系统评估每只动物的疾病严重程度。若动物评分低于或等于七分中的三分，应立即实施安乐死以减少其痛苦。自喂食后第一个24小时起，每隔24小时记录动物是否死亡，以确认动物的定植情况。依次如前所示抓住动物颈背部皮肤提起，然后用PBS润湿的无菌棉签轻轻擦拭新生动物的肛周区域。将动物放回母体身边，并将拭子置于含有300 µL无菌PBS的冰上。随后通过连续稀释法，利用PBS确认大肠杆菌（如K-1型）的定植情况，接着将其接种至麦康凯琼脂平板上。为确定存活的大肠杆菌（如K-1型）数量，使用无菌微生物接种环从麦康凯平板中挑取单个菌落，然后将该菌落转移至200 µL无菌PBS中。通过涡旋振荡制备单细胞悬液，然后使用新的无菌微生物接种环将细胞以直线形式划线接种至Moula Hinton琼脂平板上。待平板干燥30秒后，用移液器在直线中心位置加入10 µL的细菌噬菌体K one E，于37°C培养过夜。次日，观察平板上由细菌噬菌体介导的裂解现象，以收集GI道样本。安乐死处理接种动物后，清洁其腹部，然后从下腹部沿中线切开至胸骨，切口延伸越过胸骨，并从胸骨沿右侧向下腹部切开。接着，使用虹膜弯头解剖镊轻轻向下牵拉皮肤瓣以暴露腹膜，再轻柔提起腹膜并垂直剪开，以暴露内脏，注意避免损伤任何深层器官。随后，轻轻在胃的两侧横断，将其放入预冷的 BijU 管中；在直肠处横断结肠，然后用解剖镊小心地将整个肠组织拉出，并将组织置于无菌的培养皿中。用 30 毫升 PBS 覆盖组织，然后识别肠系膜淋巴系统的中央团块。用精细解剖镊夹住该团块，再识别小肠最靠近近端的部分，并同样用精细解剖镊夹住。缓慢地将肠系膜淋巴系统的中央团块与远端小肠向相反方向牵拉，直至两部分组织完全分离。注意不要拉伸小肠。将肠系膜淋巴系统转移至预称重的离心管内的 300 至 500 微升无菌 PBS 中，置于冰上。随后在盲肠处横切消化道，以分离小肠与结肠。然后将结肠转移至另一冰上预冷的离心管中，管内含有 300 至 500 微升无菌 PBS，随后从小肠中点处开始分离。最后，在盲肠前取最后两厘米的组织作为远端小肠的代表性样本，从中点上方五至七厘米处取样作为近端小肠组织样本，从中点下方三至五厘米处取样作为中段小肠组织样本。将样品加入各管中。组织采集后，称量所有收集到的试管重量，通过比较加样前后试管的重量来计算组织重量。接着对组织进行匀浆处理，每处理一个样品之间需清洗匀浆器，然后立即将样品置于冰上保存，用于后续细菌载量平板测定的计算。将匀浆样品在Macon平板上进行系列稀释，于37摄氏度过夜培养，次日通过检测单个菌落对K1特异性细菌噬菌体的敏感性来确定大肠杆菌K1载量，方法如前所述。此处描述的大肠杆菌K1系统性感染模型再现了人类自然感染的多种特征。重要的是，该模型表现出显著的年龄依赖性，如图所示：出生两天的大鼠幼崽极易发生侵袭性疾病，但在七天期间内，动物对感染的抵抗能力逐渐增强，而胃肠道定植能力不受影响，这一点与人类情况相似。在进入中枢神经系统之前，以及从胃肠道定植部位转移至血液区室后，还可通过荧光显微镜在血样中观察到细菌。这些图像展示了经口服接种大肠杆菌（E. coli A192 PP）后，出生后第2天幼鼠血涂片中的细菌。E. coli A192 PP细胞在出生后第2、5和9天幼鼠的胃肠道中均以大量形式持续存在。因此，这三个组中细菌定植的时间特征非常相似，反映了该菌株在肠道内复制并维持种群密度的能力。因此，该模型可用于研究不同K1菌株从定植部位侵入中枢神经系统及其他器官系统的毒力特性。在此操作基础上，还可采用其他方法，如生物发光细菌成像、微型CT以及IVIS成像，以进一步回答诸如“疾病在实时过程中如何进展？”等科学问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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