Name: 记者的增长分析的蛋白质降解的系统分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学习利用酵母生长动力学定量分析蛋白质降解速率的方法。通过报告蛋白与代谢标记偶联，在液体培养中系统测定蛋白酶体降解效率，为泛素化研究提供简便可靠的实验方案。

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感谢 Yuval Reiss 博士和 William Breuer 博士对本文稿的审阅，以及 Omri Alfassy 在 Ura3-GFP 筛选实验开发过程中的帮助。同时感谢 M. Hochstrasser 博士和 R. Kulka 博士提供的质粒和菌株。本研究由以色列科学基金会（资助号 786/08）和美国-以色列双边科学基金会（资助号 2011253）提供资助。

1. 细胞培养
<ol>
	<li>使用含有（a）URA3-降解决定子（degron）融合基因和（b）用于质粒筛选与维持的额外代谢标记的质粒，转化相应的营养缺陷型酵母细胞（如 Try467，见表2）。 
	注：一种合适的质粒示例为YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) （Deg1-UV） 。该质粒是一种酵母整合型质粒，编码一个融合蛋白，包含Deg1——源自酵母转录因子Mat2的降解决定子17、FLAG表位（用于免疫印迹检测）、Vma12——一种稳定的内质网蛋白，以及Ura315,18（见图3A）。（本研究中所用质粒及其它合适质粒的更多示例见表3。）</li>
	<li>为进行质粒筛选与维持，将细胞培养于缺乏相应氨基酸筛选标记的合适合成定义（SD）琼脂平板中19（例如，Deg1-UV 质粒需在 SD-LYS 选择性培养基中进行筛选与维持）。</li>
	<li>在适宜的选择性 SD 培养基中，于 30 °C 过夜培养细胞，以维持质粒，直至进入稳定生长期。根据待检测样本数量，可在试管或 96 孔板中进行培养（见第 2 节）。</li>
</ol>
2. 分析用细胞的制备
<ol>
	<li>当待检测的样本数量较少（N≤15）时，按以下步骤稀释细胞并更换培养基：
	<ol>
		<li>取过夜培养（O/N）的细胞50 µl，加入150 µl SD培养基（透明底96孔板），每孔总体积为200 µl。注意：第一个样本设为空白对照，仅含培养基。</li>
		<li>使用酶标仪测定96孔板中各样本的OD600值。</li>
		<li>将测得的OD600值乘以稀释倍数（×4），再减去空白对照的读数，得到各孔的实际OD600值。随后将所得数值除以0.55进行归一化处理，以根据比尔-朗伯定律获得相当于1 cm光程的计算值。注意：当在标准96孔板中测定200 µl细胞悬液的OD600时，该系数为常数。</li>
		<li>计算获得OD600为0.25对应的酵母细胞量所需的精确体积，并将其转移至EP管中。</li>
		<li>以高速（12,000 × g）离心1分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞重悬于1 ml相应的选择性培养基中（见第3.1节），使最终OD600为0.25。</li>
		<li>将200 µl稀释后的菌液转移至新的96孔板中的一个新孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当待测样本数量较多（N&#62;15）时，无需预先测定OD600，直接按以下步骤稀释细胞并更换培养基：
	<ol>
		<li>将96孔板中过夜培养（O/N）的静止期细胞10 μl转移至另一新的96孔板中，该新板每孔已预先加入190 μl相应选择性培养基（稀释比例为1:20）（见第3.1节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 选择性条件下液体培养中的生长动力学（GiLS）
<ol>
	<li>使用 Ura3-降解决定子报告系统进行生长测量时，请采用以下培养基：
	<ol>
		<li>对于非限制性条件下酵母生长的阳性对照，使用质粒选择性 SD 培养基（见第 1.2 节）。若无需质粒筛选（例如使用整合型质粒如 Deg1-UV），可使用含所有必需氨基酸的 SD 完全培养基（SD complete）。</li>
		<li>对于在限制性条件下测量生长的实验样品，使用 SD-URA 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将多功能酶标仪设置为：30 °C 培养温度，每 15 分钟测量一次 OD600，每 7 分钟进行一次轨道和线性振荡，每次振荡持续 1 分钟。 
	注意：该双模式振荡程序已优化以实现细胞均匀分布；但其他振荡模式甚至不振荡也可能同样有效。</li>
	<li>在酶标仪中于 30 °C 培养过夜（O/N）或直至细胞进入稳定期（12–24 小时）。</li>
	<li>将原始数据导出为电子表格文件。</li>
	<li>使用 MDTcalc（一种定制软件程序）分析酵母生长动力学，该程序可计算细胞群体数量翻倍所需的最短时间（最小倍增时间，Minimal Doubling Time，MDT）；详细信息见第 4 节。</li>
</ol>
4. 最小倍增时间（MDT）的计算：MDTcalc 算法的原理

注意：MDTcalc 算法的原理使用在 SD 完全培养基中培养的 Try467 酵母细胞代表性样本（表 2）进行说明，分别在 表 1 和 图 1 中展示数据电子表格和生长曲线图。

<ol>
	<li>从样品孔中测得的每个读数中减去相应孔中获得的OD600空白值。将所得差值除以0.55（适用于96孔板），以校正光程长度。将最终数值（表1，Trans.）对时间作图，得到实际的酵母生长曲线（OD600/hr）（图1A）。</li>
	<li>对每个转换后的数值计算log2 (OD600)，以将对数生长期转化为线性曲线（图1B）。</li>
	<li>计算从时间0开始、包含10个时间点（N=10）的区间斜率，并逐个时间点向前移动，直到N&#60;10（表1，Slope；图1C）。</li>
	<li>计算每个斜率的倒数，得到细胞群体倍增所需的时间（表1，1/Slope；图1C）。计算最小的1/Slope值以确定MDT（表1，黑色矩形；图1C）。从选定的时间区间（表1，红色矩形框出，图1B、1D）中提取样品细胞的计算MDT值（表1，1/Slope，黑色矩形）。 
	注：细胞在SD-URA培养基上的生长速率与MDT成反比。</li>
</ol>
5. 使用 MDTcalc
<ol>
	<li>将补充的程序文件复制到计算机中的指定文件夹。</li>
	<li>确保包含生长数据的电子表格文件已保存并关闭。打开 MDTcalc 应用程序，查看起始界面是否出现。
	<ol>
		<li>输入所需信息，如图2所示：
		<ol>
			<li>在“文件路径”下，点击右侧矩形框以定位电子表格文件。</li>
			<li>在“工作表名称”下，填写包含原始数据的工作表名称。</li>
			<li>在“起始位置”下，输入第一个样本时间0点在电子表格中的坐标。</li>
			<li>在“时间列”下，输入表示时间点列所在位置的字母（时间应以秒为单位提供）。</li>
			<li>在“空白列”下，输入表示空白对照列所在位置的字母（通常但不一定位于96孔板的A1孔）。</li>
			<li>在“OD值”下，选择进行MDT计算所需的最小转换后OD600值（通常为0.15–0.25）。设置此值可防止因过度稀释而处于迟滞期的培养物被计算MDT，从而确保仅对达到或超过设定OD600值的样本进行MDT计算。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>输入最后一项数值后，点击屏幕底部的“计算”按钮。请确保右侧进度条逐渐变为绿色。在计算过程中请勿打开电子表格文件。</li>
		<li>MDT计算完成后，将屏幕上自动生成的两组数据导出至电子表格中。确保数据包括：(a) 通过最小OD值测试（如5.2.1.6节所设）的每个孔的MDT值；(b) 用于计算MDT的时间区间的起始时间点（起始时间）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li>
<li>Willems, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ubiquitin+protein+ligases+and+phosphorylation-dependent+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).</li>
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<li>Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT%CE%B12+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li>
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<li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator%3A+the+yeast+2+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li>
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<li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ubiquitin-ligase+complexes+define+convergent+pathways+for+the+degradation+of+ER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins.</a> Cell. 126, 361-373 (2006).</li>
<li>Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luminal+surveillance+complex+that+selects+misfolded+glycoproteins+for+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation.</a> Cell. 126, 349-359 (2006).</li>
<li>Wu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li>
<li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li>
<li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li>
<li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍一种基于细胞生长的检测方法，用于测定蛋白质相对降解速率，称为“选择性条件下液体培养中的生长动力学”（GiLS）。GiLS 检测具有多项优势：实验设置简便，数据采集与分析直接明了，且具备极高的模块化特性。因此，GiLS 可以以用户友好的多孔板形式同时应用于多个样本，并可适配自动化系统，适用于高通量应用。最重要的是，GiLS 能够提供高度可重复、定量且稳健的数据，相较于基于琼脂平板、仅筛选生长阳性/阴性结果的生长实验，具有更高的灵活性。此外，GiLS 具有高度敏感性，能够检测蛋白质降解速率或稳态水平的微小变化，从而反映相关泛素-蛋白酶体系统（UPS）组分或降解决定子（degrons）的活性。最后，与琼脂平板上的生长实验（通常需要 2–4 天）相比，GiLS 实验所需的生长周期显著缩短（&#60;12 小时）。
尽管GiLS检测法在研究蛋白质降解方面非常有用，但仍需考虑若干重要因素。例如，必须使用遗传背景一致的酵母菌株，以避免菌株特异性生长特征带来的影响。此外，为确保检测的有效性，每次检测应在相同条件下至少重复三次，其中最重要的是初始细胞密度（OD600）、...

泛素-蛋白酶体降解系统是一种主要的调控机制，在所有真核生物中均参与维持蛋白质稳态。泛素-蛋白酶体系统（UPS）首先将多个泛素分子共价连接至靶蛋白，随后由26S蛋白酶体降解带有聚泛素标记的蛋白。在大多数情况下，泛素介导的降解速率限制步骤是底物的泛素化，该过程由E2结合酶和E3连接酶（E3连接酶）1介导。因此，特定蛋白质在细胞内的稳定性反映了其对泛素化修饰的敏感性及其对应的泛素化酶的活性。
E3 连接酶是泛素-蛋白酶体系统（UPS）中主要的底物识别组分。因此，这些酶能够识别其底物中的降解子（degron），而这些降解子在其稳定的对应蛋白中要么不存在，要么未暴露2。例如，许多细胞周期调控因子必须以特定的时间顺序合成并被降解，以确保细胞周期的有序进行。这些蛋白的降解通常由细胞信号通路调控的激酶所介导的磷酸化来控制3,4。另一方面，错误折叠的蛋白则通过隐匿性降解子被识别，这些区域在天然结构中通常被隐藏，但在结构发生扰动时会暴露出来。此类降解子包括疏水结构域5-7和&#160;内在无序片段8。&#160;
自从在网织红细胞裂解液中首次发现泛素系统介导的蛋白质降解并阐明其基本机制以来9，酵母遗传学在鉴定泛素系统的众多组分方面发挥了关键作用10。酵母作为研究泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导蛋白质降解的模式生物之所以取得成功，主要归因于UPS在所有真核生物中高度保守4，同时酵母本身具有良好的实验可操作性。事实上，基于酵母的实验系统常被用于解析泛素化机制的作用原理。
通过生物化学方法研究蛋白质降解通常需要制备细胞提取物。虽然动物细胞的蛋白质可以在相对温和的条件下被提取，从而保持蛋白质相互作用和功能，但酵母具有坚固的细胞壁11，其破碎需要更为剧烈的条件，这可能影响蛋白质的回收效率。事实上，不同的酵母细胞破碎方法在回收完整蛋白质的能力方面存在显著差异，且所获得的蛋白质量未必能准确反映其在细胞内的相对丰度。此外，目前用于测定特定蛋白质降解速率的方法本身也存在固有的不准确性：基于代谢标记的“脉冲-追踪”实验结合免疫沉淀来分离特定蛋白质12，通常并非严格意义上的定量方法。因此，使用该方法比较蛋白质降解时，应对结果的解读格外谨慎。为克服这一局限，可采用另一种环己酰亚胺（CHX）追踪实验12。在此方法中，将翻译抑制剂加入细胞培养物中，随后监测目标蛋白质稳态水平随时间的变化。然而，CHX 的应用仅限于半衰期相对较短的蛋白质（&#60; 90 分钟），因为长期抑制蛋白质合成具有细胞毒性。值得注意的是，上述两种实验方法均依赖于特异性识别目标蛋白质的抗体，而这类抗体并不总是可获得的。
为了克服这些技术局限，研究人员已开发出多种无需细胞提取和直接蛋白质操作的方法。其中一种方法基于构建营养缺陷型酵母菌株，即通过删除编码必需代谢酶的基因获得此类菌株。这些基因包括编码氨基酸生物合成所需酶的 HIS3, LEU2、LYS2 和 TRP1，以及编码乳清酸单磷酸脱羧酶（Ura3）的 URA3，后者是嘧啶核糖核苷酸生物合成中的一种关键酶。Ura3 已被广泛应用于蛋白质降解研究中。在这些实验中，Ura3 的组成型表达可使 ura3 缺陷细胞在缺乏尿嘧啶的培养基中恢复生长13。因此，通过将降解决定子（degron）与 Ura3 融合以使其不稳定，可导致细胞在缺乏尿嘧啶的最低培养基上生长能力下降。该方法已被用于多项蛋白质降解研究，包括降解决定子的鉴定5、E3 连接酶14 和辅助泛素化因子的筛选15，以及新型泛素-蛋白酶体系统（UPS）降解决定子的发现16。上述所有方法均以细胞在琼脂平板上的生长情况作为检测读数。然而，尽管生长表型（生长/不生长）具有良好的稳健性和高效性，但主要是定性结果，无法提供评估降解决定子效力或各种辅助降解因子相对贡献所需的定量信息。
因此，我们开发并利用了酵母载体和筛选方法，以实现通过URA3-降解决定子融合系统对蛋白质降解进行系统性和定量分析。该实验方案基于一种易于操作的检测方法，即在选择性条件下测定液体培养中的生长动力学（GiLS），并生成标准生长曲线。酵母生长动力学具有三个主要阶段——延滞期、指数（对数）期和稳定期。在选择性条件下，通过对Ura3-降解决定子表达水平所决定的对数生长期酵母复制动力学进行计算，可获得对蛋白质降解的无偏定量测量结果。该方法可用于在多种菌株和不同条件下，同时测量和比较多个泛素-蛋白酶体系统（UPS）底物的降解速率。

<table><tbody><tr><td>不含氨基酸和硫酸铵的 Difco 酵母氮源基础培养基</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td>用于 SD 最小培养基上的酵母培养。&amp;nbsp; 需额外添加的氨基酸为：精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸</td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>尿嘧啶</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>氨基酸</td><td>可获得的最高纯度&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>可使用任何其他兼容品牌</td></tr><tr><td>放线菌酮&amp;nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C7698</td><td>工作浓度 0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO 系列</td><td>Tecan</td><td></td><td>用于酵母培养及 OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; 测定。可使用其他任何兼容的温控酶标仪。</td></tr><tr><td>MDTcalc</td><td></td><td></td><td>实验用软件</td></tr></tbody></table>

基于报告基因的生长分析法用于系统性研究蛋白质降解

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）进行蛋白质降解是所有真核生物中维持蛋白质稳态的主要调控机制。目前确定细胞内蛋白质降解的标准方法依赖于生物化学检测，以追踪蛋白质减少的动力学过程。这类方法通常耗时且劳动强度大，因此难以适用于需要评估多种底物和不同降解条件的实验。作为替代方案，已开发出基于细胞生长的检测方法，但其传统形式属于终点检测，无法对蛋白质水平的相对变化进行定量测定。
本文介绍一种将蛋白质降解速率的变化与酵母细胞生长动力学相偶联，从而准确测定其变化的方法。该方法基于一个已建立的筛选系统：通过表达一种报告蛋白来挽救因缺失URA3基因而无法合成尿嘧啶的酵母细胞的尿嘧啶营养缺陷型，该报告蛋白由必需的URA3基因与一个降解决定子（degron）融合而成。该报告蛋白的设计使其合成速率保持恒定，而其降解速率则由degron决定。由于在缺乏尿嘧啶的培养基中细胞生长与Ura3蛋白的相对含量成正比，因此生长动力学完全依赖于报告蛋白的降解速率。
该方法可准确测量细胞内蛋白质降解动力学的变化。其应用包括：（a）评估已知泛素结合因子在蛋白质降解中的相对作用；（b）E2结合酶的结构-功能分析；（c）新降解子（degrons）的鉴定与表征。基于降解子-URA3 系统的应用超越了蛋白质降解领域，还可被改造用于监测与其他细胞通路功能相关的蛋白质水平变化。

研究 Doa10 通路中酶在报告底物降解中的作用
为验证GiLS方法的有效性，将其与传统的降解实验进行了比较。该实验评估了定位于内质网膜的Doa10 E3泛素连接酶复合物各组分的相对贡献20,21 蛋白质质量控制报告底物的降解 Deg1-VU（图3A）。 Deg1-VU 质粒被整合到 野生型 细胞或缺乏E2结合酶基因的细胞中 UBC7 (ubc7）随后通过CHX追踪实验测定蛋白质稳定性6. Anti-FLAG 免疫印迹显示一种稳定的 Deg1-VU 蛋白条带在 ubc7 细胞，这在 野生型 细胞（图3B）。不存在 Deg1- VU 在 野生型 细胞的这一特性归因于其持续的降解过程，而该过程在 ubc7 细胞，表明 Deg1-V...

本文介绍了一种用于定量泛素-蛋白酶体系统中蛋白水解相对速率的可靠生物学检测方法。该检测的读出指标为酵母在液体培养中的生长速率，其依赖于报告蛋白的细胞内水平，该报告蛋白由一个降解信号与必需的代谢标记物融合而成。

通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）进行的蛋白质降解是所有真核生物中维持蛋白质稳态的主要调控机制。标准……

本实验的总体目标是通过将蛋白质降解速率的变化与液体培养中酵母生长动力学相偶联，系统性地测定蛋白质降解速率的差异。首先，在合适的选择性培养基中，将表达报告蛋白（该报告蛋白由一个降解信号与代谢标记物融合而成）的细胞培养至对数生长末期的静止期。接着，测定细胞的光密度以获得细胞生长动力学数据，然后利用指定的软件程序根据生长动力学计算细胞在对数生长期的最小倍增时间。最终，计算得到的最短倍增时间可用于定义蛋白质降解动力学的差异。与现有的环己酰亚胺或脉冲追踪降解实验等方法相比，本技术的主要优势在于其建立过程简单，数据采集与分析直接简便，且实验设计具有极高的模块化特性。该方法有助于解答蛋白质降解领域中的关键问题，例如泛素-蛋白酶体系统识别错误折叠蛋白质所需的哪些组分。当我希望开展筛选实验以鉴定参与从特定蛋白质亚群中去除泛素的蛋白质时，首次提出了该方法。为此，我建立了一种简便的方法，用于比较多个样本，以制备用于分析的细胞。首先，将适当的氧化胁迫敏感型酵母细胞（如 TRY 4 67）用含有 U3 嗜热菌素融合基因以及额外代谢标记物的质粒进行转化，该代谢标记物用于质粒的筛选与维持。为实现质粒的筛选与维持，将细胞接种于缺乏特定氨基酸筛选标记的合适合成限定培养基琼脂平板上培养，将存活的菌落转移至平板上的菌块中，再将菌块中的细胞转入液体培养基中，于 30 摄氏度下振荡培养过夜，直至进入稳定期。随后，对于 15 个或更少的样品，每孔用 150 微升合成限定培养基将过夜培养物中的 50 微升细胞进行稀释。在透明底96孔板中，使用酶标仪测定各样品的OD 600值。根据测定结果，计算获得相当于OD 600为0.25的酵母细胞数量所需的准确体积，随后在室温下以12,000 × g离心1分钟，弃上清，将细胞重悬于1毫升相应的选择性培养基中，使OD 600达到0.25。当待测样品数量超过15个时，将稀释后的菌液200微升转移至新的96孔板的各孔中。另取10微升过夜培养的静止期细胞，加入含有190微升相应选择性培养基的新96孔板的孔中，用于测定转化酵母细胞在选择性条件下的生长动力学。接下来，将多功能酶标仪设置为30摄氏度的孵育温度，OD 600测量间隔为15分钟，并设置每7分钟进行1分钟的轨道振荡和线性振荡。然后将细胞在酶标仪中30摄氏度条件下孵育12至24小时。当细胞进入稳定期后，将原始数据导出至电子表格文件，利用MDT Calc分析酵母生长动力学。确保包含生长数据的电子表格文件已保存并关闭。然后在文件路径下打开 MDT Calc 应用程序。单击矩形区域，根据工作表名称定位电子表格文件。在起始位置处输入包含原始数据的电子表格名称。在时间列中输入第一个样本的时间零点对应的电子表格坐标。在空白列中输入以秒为单位的时间点列所在位置的字母，然后输入定义空白列位置的字母。例如，选择96孔板中的A1孔。接下来，在OD值下，选择启动MDT计算所需的最小转化OD 600值。通常为0.15至0.25，以确保仅对达到设定的D 600值或更高值的样品计算MDT。输入最后一个数值后，单击计算按钮，并确认右侧的进度条逐渐变为绿色。最后，将 MDT 计算完成后屏幕上自动显示的两组数据导出至新的电子表格中。请确认数据包含通过最低 OD 值测试的每个孔的 MDT 值，以及本代表性实验中用于计算 MDT 的时间区间的起始时间。通过比较野生型与不同突变株之间蛋白质降解动力学的相对差异，首先将表达D1-VmaU3的野生型U BBC6、Ubc7缺失型或Doa10缺失型细胞在合成定义完全培养基中培养。随后为测定降解速率，将细胞洗涤并转移至不含尿嘧啶的合成定义培养基中孵育。所有菌株在合成定义完全培养基中均表现出相似的生长曲线和计算所得的MDT值，排除了所检测的任一基因缺失影响细胞生长的可能性。相比之下，在缺乏尿嘧啶的合成限定培养基中培养时，野生型细胞生长状况较差，而突变菌株仅表现出轻微的生长缺陷。UBC7 对 DEG1-VMAU3 降解至关重要，因此能够准确评估各种 E2 突变体的微弱效应。因此，在表达具有活性位点突变体 C89S 和 N81A 的 UBC7 的细胞中，观察到快速的生长动力学。此外，两种被预测会间接阻碍 DEG1-VMAU3 降解的突变体 V205G 和 H904K 也被发现相较于野生型 UBC7 能够促进细胞生长，尽管其促进程度低于活性位点突变体。因此，鳃方法可用于准确测量各种降解因素对报告底物稳定性的相对贡献。在进行该实验操作时，需要注意该方案对蛋白质降解速率的微小差异较为敏感。这是一大优势，但也意味着在设计和验证将要使用的Deron时必须格外谨慎。其他方法，如高通量荧光显微镜，可用于回答更多问题，例如报告蛋白的聚集倾向如何。因此，在报告蛋白中同时加入GFP标签是一个良好的策略。观看本视频后，您应能充分理解如何利用微孔板读板仪及我们指定的软件程序，系统性地测定蛋白质降解速率的变化。

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生物学

记者的增长分析的蛋白质降解的系统分析

本文介绍了一种在活细胞中监测泛素-蛋白酶体活性的方法。通过慢病毒表达载体，将一个含有降解决定子的不稳定型绿色荧光蛋白融合蛋白（GFP-dgn）和一种稳定的GFP-dgnFS融合蛋白导入细胞。该技术可用于建立稳定表达GFP-dgn/GFP-dgnFS的细胞系，在该细胞系中，可通过落射荧光显微镜或流式细胞术方便地评估泛素-蛋白酶体系统的活性。...

利用基于降解决定子（dgn）不稳定的绿色荧光蛋白（GFP）报告蛋白在活细胞中监测泛素-蛋白酶体活性

在本视频中，我们展示了一种基于细胞的蛋白质聚集检测方法，该方法使用蛋白酶体抑制剂来阻断蛋白酶体活性，从而阻止与荧光标签融合的错误折叠突变蛋白发生泛素依赖性的蛋白酶体降解，导致这些蛋白在细胞质中积累。随后通过荧光显微镜对蛋白质聚集体进行可视化和定量分析。...

蛋白质聚集体形成检测：一种在蛋白酶体抑制剂诱导下检测和定量培养细胞中蛋白质聚集的方法

本视频介绍了一种利用环己酰亚胺处理结合去垢剂分级分离技术来检测错误折叠蛋白质降解的方法。该方法有助于研究错误折叠蛋白质的动态变化，并深入揭示蛋白质周转的分子机制。...

易错折叠蛋白降解检测：一种利用环己酰亚胺处理与去垢剂分馏监测错误折叠蛋白降解的技术

靶向蛋白质降解是细胞功能调控的重要机制。它发生于 通过...

在植物无细胞系统中检测蛋白酶体降解

基因报告基因检测是一种成熟且强大的工具，用于解析DNA序列与其基因调控活性之间的关系。将候选调控元件与携带可识别序列标签的报告基因相偶联，可实现这些检测的大规模平行化。...

在培养的哺乳动物细胞中进行大规模平行报告基因分析

本文介绍了一种基于酵母生长的检测方法，用于确定蛋白质降解所需的遗传条件。同时展示了一种快速提取酵母蛋白质的方法，适用于蛋白质印迹（western...

基于生长的蛋白质降解遗传需求的测定及生化验证方法在Saccharomyces cerevisiae中的应用

本报告介绍了通过蛋白质印迹法或基于荧光的检测方法来测定错误折叠蛋白质降解速率的实验方案。这些方法可应用于其他错误折叠蛋白质的分析，以及高通量筛选。...

细胞中错误折叠蛋白质降解的检测方法

本方案描述了一种利用脉冲标记和SNAP-标签融合蛋白的荧光延时成像，在单个活体贴壁细胞中测定蛋白质半衰期的方法。...

通过延时荧光显微镜在贴壁细胞培养中对蛋白质降解速率进行单细胞定量分析

本方案描述了利用CRISPR/Cas9技术改造的活细胞中目标蛋白降解动力学的定量发光检测方法，这些细胞表达经基因编辑后融合于目标蛋白的无抗体依赖性内源蛋白检测标签。文中包含计算和获取定量降解参数的详细步骤，包括降解速率、Dmax、DC50 和...

利用HiBiT CRISPR细胞系进行靶向蛋白降解化合物的高通量细胞谱型分析

我们开发了一种可用于细胞的内含子微小RNA（microRNA）生成报告检测方法 体外 使用四种质粒：一种携带内含子miRNA，一种携带靶序列，一种用于过表达调控蛋白，一种用于Renilla荧光素酶。miRNA被加工处理后，可通过结合靶序列来调控荧光素酶的表达。...

一种用于分析哺乳动物细胞中内含子microRNA成熟的报告基因检测方法

本方案描述了使用脉冲式SILAC对衰老细胞和非分裂细胞进行代谢标记、非靶向质谱分析以及蛋白质半衰期的简化计算的工作流程。...

通过代谢标记与质谱法测定衰老及非分裂培养细胞中的蛋白质周转率

学习利用酵母生长动力学定量分析蛋白质降解速率的方法。通过报告蛋白与代谢标记偶联，在液体培养中系统测定蛋白酶体降解效率，为泛素化研究提供简便可靠的实验方案。

基于报告基因的生长分析法用于系统性研究蛋白质降解

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