基于报告基因的生长分析法用于系统性研究蛋白质降解

本实验的总体目标是通过将蛋白质降解速率的变化与液体培养中酵母生长动力学相偶联，系统性地测定蛋白质降解速率的差异。首先，在合适的选择性培养基中，将表达报告蛋白（该报告蛋白由一个降解信号与代谢标记物融合而成）的细胞培养至对数生长末期的静止期。接着，测定细胞的光密度以获得细胞生长动力学数据，然后利用指定的软件程序根据生长动力学计算细胞在对数生长期的最小倍增时间。

最终，计算得到的最短倍增时间可用于定义蛋白质降解动力学的差异。与现有的环己酰亚胺或脉冲追踪降解实验等方法相比，本技术的主要优势在于其建立过程简单，数据采集与分析直接简便，且实验设计具有极高的模块化特性。

该方法有助于解答蛋白质降解领域中的关键问题，例如泛素-蛋白酶体系统识别错误折叠蛋白质所需的哪些组分。当我希望开展筛选实验以鉴定参与从特定蛋白质亚群中去除泛素的蛋白质时，首次提出了该方法。为此，我建立了一种简便的方法，用于比较多个样本，以制备用于分析的细胞。

首先，将适当的氧化胁迫敏感型酵母细胞（如 TRY 4 67）用含有 U3 嗜热菌素融合基因以及额外代谢标记物的质粒进行转化，该代谢标记物用于质粒的筛选与维持。为实现质粒的筛选与维持，将细胞接种于缺乏特定氨基酸筛选标记的合适合成限定培养基琼脂平板上培养，将存活的菌落转移至平板上的菌块中，再将菌块中的细胞转入液体培养基中，于 30 摄氏度下振荡培养过夜，直至进入稳定期。随后，对于 15 个或更少的样品，每孔用 150 微升合成限定培养基将过夜培养物中的 50 微升细胞进行稀释。

在透明底96孔板中，使用酶标仪测定各样品的OD 600值。根据测定结果，计算获得相当于OD 600为0.25的酵母细胞数量所需的准确体积，随后在室温下以12,000 × g离心1分钟，弃上清，将细胞重悬于1毫升相应的选择性培养基中，使OD 600达到0.25。当待测样品数量超过15个时，将稀释后的菌液200微升转移至新的96孔板的各孔中。另取10微升过夜培养的静止期细胞，加入含有190微升相应选择性培养基的新96孔板的孔中，用于测定转化酵母细胞在选择性条件下的生长动力学。

接下来，将多功能酶标仪设置为30摄氏度的孵育温度，OD 600测量间隔为15分钟，并设置每7分钟进行1分钟的轨道振荡和线性振荡。然后将细胞在酶标仪中30摄氏度条件下孵育12至24小时。当细胞进入稳定期后，将原始数据导出至电子表格文件，利用MDT Calc分析酵母生长动力学。

确保包含生长数据的电子表格文件已保存并关闭。然后在文件路径下打开 MDT Calc 应用程序。单击矩形区域，根据工作表名称定位电子表格文件。

在起始位置处输入包含原始数据的电子表格名称。在时间列中输入第一个样本的时间零点对应的电子表格坐标。在空白列中输入以秒为单位的时间点列所在位置的字母，然后输入定义空白列位置的字母。

例如，选择96孔板中的A1孔。接下来，在OD值下，选择启动MDT计算所需的最小转化OD 600值。通常为0.15至0.25，以确保仅对达到设定的D 600值或更高值的样品计算MDT。

输入最后一个数值后，单击计算按钮，并确认右侧的进度条逐渐变为绿色。最后，将 MDT 计算完成后屏幕上自动显示的两组数据导出至新的电子表格中。请确认数据包含通过最低 OD 值测试的每个孔的 MDT 值，以及本代表性实验中用于计算 MDT 的时间区间的起始时间。

通过比较野生型与不同突变株之间蛋白质降解动力学的相对差异，首先将表达D1-VmaU3的野生型U BBC6、Ubc7缺失型或Doa10缺失型细胞在合成定义完全培养基中培养。随后为测定降解速率，将细胞洗涤并转移至不含尿嘧啶的合成定义培养基中孵育。所有菌株在合成定义完全培养基中均表现出相似的生长曲线和计算所得的MDT值，排除了所检测的任一基因缺失影响细胞生长的可能性。

相比之下，在缺乏尿嘧啶的合成限定培养基中培养时，野生型细胞生长状况较差，而突变菌株仅表现出轻微的生长缺陷。UBC7 对 DEG1-VMAU3 降解至关重要，因此能够准确评估各种 E2 突变体的微弱效应。因此，在表达具有活性位点突变体 C89S 和 N81A 的 UBC7 的细胞中，观察到快速的生长动力学。此外，两种被预测会间接阻碍 DEG1-VMAU3 降解的突变体 V205G 和 H904K 也被发现相较于野生型 UBC7 能够促进细胞生长，尽管其促进程度低于活性位点突变体。

因此，鳃方法可用于准确测量各种降解因素对报告底物稳定性的相对贡献。在进行该实验操作时，需要注意该方案对蛋白质降解速率的微小差异较为敏感。这是一大优势，但也意味着在设计和验证将要使用的Deron时必须格外谨慎。

其他方法，如高通量荧光显微镜，可用于回答更多问题，例如报告蛋白的聚集倾向如何。因此，在报告蛋白中同时加入GFP标签是一个良好的策略。观看本视频后，您应能充分理解如何利用微孔板读板仪及我们指定的软件程序，系统性地测定蛋白质降解速率的变化。