记者的增长分析的蛋白质降解的系统分析

该程序的总体目标是通过将蛋白质降解速率与液体培养物中酵母生长的动力学耦合，以系统的方式确定蛋白质降解速率的变化。这是通过首先培养表达报告蛋白的细胞来实现的，该报告蛋白由降解信号组成，该信号与代谢标志物偶联到合适的选择性培养基中过夜到固定相。接下来，测量细胞的光密度以确定细胞的生长动力学，然后使用指定的软件程序从生长动力学计算对数期细胞的最小倍增时间。

最终，计算出的最小倍增时间可用于定义蛋白质降解动力学的变化。与现有方法（如甜蜜素或脉冲追踪降解测定）相比，该技术的主要优势在于我们的技术易于设置。数据采集和分析简单明了，论文设计非常模块化。

这种方法可以帮助回答 pot 降解领域的关键问题，例如泛素 pot 系统识别错误折叠的 pot 需要哪些元素。当我想做一个筛选来鉴定涉及从其亚群中去除泛素的蛋白质时，我第一次想到了这种方法。所以我建立了一种比较多个样品的简单方法来准备用于分析的细胞。

首先，用含有 U 3 Deron 融合物的质粒转化适当的牛萎缩酵母细胞，例如 TRY 4 67，以及用于质粒选择和维持的附加代谢标记物。对于质粒选择和维持，在合适的合成成分确定的培养基下，在缺乏氨基酸选择标记物的琼脂平板上培养细胞，将存活的菌落转移到斑块中，将细胞从斑块转移到液体培养基中，并在 30 摄氏度下孵育过夜，直到达到固定相。然后，对于 15 个或更少的样品，每孔用 150 μL 合成成分确定的培养基稀释 50 μL 过夜培养物中的细胞。

在透明的底部 96 孔板中，使用酶标仪确定样品的 OD 600 值。然后，在计算出获得相当于 OD 600 为 0.25 的酵母细胞所需的确切体积后，以 12， 000 倍 G 和室温将细胞重悬于一毫升适当的选择性培养基中，以获得 OD 600 为 0.25，当大于 15 时，将 200 微升稀释的菌株转移到新的 96 孔板的一个孔中样品将被检测。将 10 μL 过夜生长的固定细胞转移到含有 190 μL 适当选择性培养基的新 96 孔板的一个孔中，以测量转化酵母细胞在选择性条件下的生长动力学。

接下来，将多功能酶标仪的孵育温度设置为 30 摄氏度，OD 600 测量间隔为 15 分钟，轨道和线性振荡周期为每 7 分钟一分钟。然后将细胞在 30 摄氏度下在酶标仪中孵育 12 至 24 小时。当细胞达到固定期时，将原始数据导出到电子表格文件中，以使用 MDT Calc 确定酵母生长动力学。

确保包含增长数据的电子表格文件已保存并关闭。然后在文件路径下打开 MDT Calc 应用程序。单击矩形以在 Sheet name （工作表名称） 下找到电子表格文件。

在 starting position （起始位置） 下输入原始数据所在的电子表格名称。在 time 列下输入时间的电子表格坐标，第一个样本的零。在空白列下输入定义时间点列位置的字母（以秒为单位），输入定义空白列位置的字母。

例如，96 孔板的 A 单孔。下一个。在 OD 值下，选择启动 MDT 计算所需的最小转换 OD 600 值。通常为 0.15 到 0.25，以确保仅针对达到定义的 D 600 或更高值的样品计算 MDT。

输入最后一个值后，单击 calculate 按钮并确认右侧的进度条逐渐变为绿色。最后，将 MDT 计算完成后自动显示在屏幕上的两组数据导出到新的电子表格中。确认数据包括通过最小 OD 值测试的每个孔的 MDT 值以及在此代表性实验中计算 MDT 的间隔的开始时间。

野生型和各种突变菌株之间蛋白质降解动力学的相对差异最初比较了野生型 U BBC six、delta UBC 7 delta 或 DOA 10 delta 细胞表达 D 1 VMAU 3 在合成成分确定的完全培养基上生长。然后为了测量鳃，将细胞洗涤并在合成成分确定的培养基中孵育。对于在合成成分确定的完全培养基中生长的所有菌株，观察到负尿嘧啶相似的生长曲线和计算的 MDT，排除了任何检查基因的缺失影响细胞生长的可能性。

相比之下，在不含尿嘧啶的合成成分确定的培养基中孵育导致野生型细胞生长不良，而在突变菌株中仅观察到轻微的生长缺陷。UBC 7 是 DEG 1 VMAU 3 降解的绝对必要条件，能够准确评估各种 E 2 突变体的部分影响。因此，在表达具有活性位点突变体 C 89 s 和 N 81 的 UBC 7 细胞中观察到快速生长动力学，A.In 添加，两种预测会间接阻碍 DEG 1 VMA ETH 三种降解的突变体 V 20 5G 和 H 90 4K 与野生型 UBC 7 相比，还发现增强细胞生长， 尽管程度不如活性位点突变体。

因此，鳃法可用于准确测量各种降解因子对报告基底稳定性的相对贡献。在尝试此过程时，重要的是要记住该方案对蛋白质降解速率的微小差异很敏感。这是一个优势，但这也意味着在设计和验证要按照此程序使用的 Deron 时应小心。

可以执行其他方法（如高通量荧光显微镜）来回答其他问题，例如报告蛋白的聚集倾向是什么。因此，最好在报告器中包含 GFP 标签。看完这个视频后，您应该对如何使用 MICROPLATE 读数仪和我们指定的软件程序系统地确定蛋白质降解速率的变化有了很好的了解。