Name: 小鼠胚胎的逆转录病毒感染干细胞衍生胚体细胞造血分化的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 学习利用逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞，通过悬滴培养形成胚体并诱导造血分化，结合流式细胞术分析基因表达对造血发育的影响。该方法可快速研究基因在特定分化阶段的功能。

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本研究得到了印第安纳大学医学院分子血液学卓越中心（IUSM）（NIDDK，5P30DK090948）的试点与可行性资助。额外资金由IUSM的生物医学增强资助提供。我们感谢Karen Cowden Dahl博士对本文手稿提出的宝贵意见。

1. 胚状体（EB）形成
<ol>
	<li>已在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上适应并维持的明胶包被ESC。将ESC在涂有0.1%明胶的6孔组织培养板上连续传代3次，以去除MEFs。
	<ol>
		<li>使用含LIF的ESC维持培养基培养细胞，以保持其未分化状态（表1）。确保细胞融合度 never 超过80%。用于分化实验的细胞应为低代次细胞（从MEFs去除后传代10次或更少）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在ESC进行拟胚体（EB）分化培养的前一天，对细胞进行传代，使其在次日达到约50–70%的融合度。继续使用ESC维持培养基培养细胞，以保持其多能性。</li>
	<li>在分化当天，吸除ESC维持培养基，并用1 ml磷酸盐缓冲液（PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，11.9 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4）洗涤6孔板的每孔。
	<ol>
		<li>向每孔加入200 µl 0.25%胰蛋白酶/EDTA，于37 °C孵育3分钟。</li>
		<li>用800 µl分化培养基终止胰蛋白酶/EDTA的作用。使用带p200枪头的2 ml血清移液管反复吹打5–10次，使细胞充分解离为单细胞悬液。确保p200枪头与移液器接口紧密，防止液体渗入枪头与移液管之间。</li>
		<li>吹打约5–10次。操作过程中注意避免产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞转移至15 ml锥形离心管中，用PBS补总体积至10 ml。在室温下以315 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液。用5 ml PBS洗涤两次，以彻底去除残留的含LIF培养基。每次洗涤均按步骤1.4的条件进行离心。
	<ol>
		<li>将最终的细胞沉淀重悬于2 ml分化培养基中（表2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞，并以每毫升6,000–10,000个细胞的密度接种于10 cm非组织培养处理的培养皿中。
	<ol>
		<li>针对每种ESC细胞系，需通过实验确定最适的细胞密度（个/ml）。使用无菌的、通常用于细菌培养的培养皿或低黏附培养皿。 
		注意：为获得最佳分化效果，拟胚体应形成悬浮球状结构，不贴附于培养皿表面。建议测试多个品牌的培养皿，选择黏附性最低者。</li>
		<li>将正在分化的ESC置于37 °C、含5% CO2的组织培养孵箱中培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>储存液浓度</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>体积</td>
			<td>公司</td>
			<td>货号</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
			<td>410 ml</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS（胚胎干细胞筛选级）</td>
			<td>100%</td>
			<td>15%</td>
			<td>75 ml</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>非必需氨基酸</td>
			<td>100x</td>
			<td>1x</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺</td>
			<td>100x</td>
			<td>1x</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>100x</td>
			<td>1x</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-巯基乙醇</td>
			<td>14.3 M</td>
			<td>114 µM</td>
			<td>4 µl</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>白血病抑制因子（LIF）</td>
			<td>107 单位/ml</td>
			<td>1,000 单位/ml</td>
			<td>50 µl</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：胚胎干细胞维持培养基。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>体积</td>
			<td>公司</td>
			<td>目录编号</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
			<td>410 ml</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS（用户筛选以获得最佳分化效果）</td>
			<td>100%</td>
			<td>15%</td>
			<td>75 ml</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>非必需氨基酸</td>
			<td>100x</td>
			<td>1x</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺</td>
			<td>100x</td>
			<td>1x</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>100x</td>
			<td>1x</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-巯基乙醇</td>
			<td>14.3 M</td>
			<td>114 µM</td>
			<td>4 µl</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：分化培养基。
2. 准备EB细胞以进行病毒感染
<ol>
	<li>在预期的发育阶段（第2天至第3天之间），将EBs从10 cm培养皿转移至15 ml锥形管中。用5 ml PBS洗涤培养皿，并将洗涤液加入锥形管中。</li>
	<li>在室温下以315 × g离心5分钟，使EBs沉淀。用5 ml PBS洗涤EB细胞。</li>
	<li>加入1 ml解冻的细胞解离溶液（含蛋白酶和胶原酶），将试管置于37 °C水浴（或培养箱）中孵育30分钟，期间偶尔轻轻振荡（通过轻弹或低速涡旋）。</li>
	<li>加入1 ml分化培养基。使用2 ml移液器配合p200吸头反复吹打混匀。再次将试管置于37 °C水浴中孵育30–60分钟。</li>
	<li>以315 × g离心5分钟使细胞沉淀，并用PBS洗涤细胞。</li>
</ol>
3. 病毒感染
<ol>
	<li>用1.5 ml分化培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至6孔非组织培养处理板中。</li>
	<li>提前按照标准方法制备逆转录病毒。根据病毒滴度，向细胞中加入5至100 µl病毒上清液。切勿添加polybrene以增强感染，因其会抑制后续拟胚体（EBs）的重新形成。</li>
	<li>将细胞与病毒共孵育，于室温下以2,120 × g离心90分钟。</li>
</ol>
4. 在悬滴中区分病毒感染的 EB 细胞
<ol>
	<li>向每个感染的EB细胞悬液孔中加入2 ml分化培养基。</li>
	<li>用移液器将3.5 ml感染的EB细胞悬液加入无菌试剂储液槽中，用于多通道移液器。使用多通道移液器在15 cm培养皿倒置的皿盖上点加15-20排，每排8个20 µl液滴。</li>
	<li>在培养皿下半部分加入10 ml无菌PBS或水。然后将带有液滴的皿盖倒扣放置于培养皿上。确保液滴悬挂在皿盖下方，且下方有PBS或水以维持腔内湿度。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、含5.0% CO2的组织培养孵育箱中。</li>
	<li>2天后，通过倒置皿盖并用4.5 ml分化培养基冲洗，收集悬滴中形成的EB。
	<ol>
		<li>将培养基和EB转移至一个新的10 cm非组织培养级培养皿中。再用3 ml分化培养基冲洗皿盖一次，并将冲洗液转移至该10 cm培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从细胞初次转入分化培养基（-LIF）开始计时，经过总共8天的培养后，收集细胞用于流式细胞术分析。</li>
</ol>
5. 流式细胞仪分析前的细胞准备
<ol>
	<li>用10 ml移液管将细胞转移至15 ml锥形管中。用5 ml PBS洗涤培养板，并将洗涤液转移至同一锥形管中。</li>
	<li>在315 × g条件下离心收集细胞沉淀。用10 ml PBS洗涤沉淀。</li>
	<li>加入1 ml解冻的细胞解离溶液，将试管置于37 °C水浴中孵育30分钟，期间偶尔轻轻振荡。对于某些细胞表面抗原的检测，可改用胰蛋白酶处理。</li>
	<li>加入1 ml分化培养基，使用2 ml移液管反复吹打。在移液管末端使用P200吸头，有助于将消化后的拟胚体分散成单细胞悬液。
	<ol>
		<li>再次将试管置于37 °C水浴中孵育60分钟，以使整合膜蛋白重新循环至细胞表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在315 × g条件下离心5分钟收集细胞。</li>
	<li>用PBS配制的含0.1%牛血清白蛋白第五组分（BSA）溶液（PBS/BSA）洗涤细胞，并与特异性荧光标记抗体孵育。</li>
</ol>
6. 造血祖细胞的流式细胞术分析
<ol>
	<li>将 106 个EB来源的细胞置于5 ml 12 x 75 mm的圆底试管中。为调整流式细胞仪的补偿设置，请根据制造商说明书使用补偿微珠。</li>
	<li>在315 × g条件下离心沉淀细胞。倒去上清液，并将沉淀重悬于试管中残留的PBS/BSA溶液中。</li>
	<li>为检测ESC HPCs，将细胞与荧光标记抗体孵育：抗小鼠CD41-PE（R-藻红蛋白）和抗小鼠CD117（cKit）-APC/CY7（别藻蓝蛋白-菁7）。
	<ol>
		<li>用PBS/BSA将抗体稀释1:100。向每个样本中加入100 µl稀释后的抗体。根据每个供应商、克隆及批次的抗体确定正确的稀释比例，并分别确定细胞标记的最佳稀释度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样本在冰上避光孵育30分钟。</li>
	<li>加入2 ml PBS/BSA，在315 × g条件下离心5分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>吸除上清液，并将沉淀重悬于300 µl PBS或其他等渗缓冲液中。</li>
	<li>将重悬的细胞通过带细胞筛网的管盖（0.35 µm）过滤，以去除大的细胞聚集体。</li>
	<li>在流式细胞仪上分析细胞。</li>
</ol>

<ol><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies%3A+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+physiology%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).</li>
<li>Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies.</a> Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).</li>
<li>Tian, X., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+towards+hematopoietic+cells%3A+progress+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls.</a> Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).</li>
<li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51, 503-512 (1987).</li>
<li>Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+proto-oncogene+int-2+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%3A+a+general+strategy+for+targeting+mutations+to+non-selectable+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes.</a> Nature. 336, 348-352 (1988).</li>
<li>Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+genes+introduced+into+cultured+pluripotential+cells+by+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector.</a> Nature. 323, 445-448 (1986).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+by+lentiviral+vectors%3A+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).</li>
<li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+efficiency+of+human+and+mouse+embryonic+stem+cells+using+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+stem+cells%22%5BJournal%5D)">Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors.</a> Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).</li>
<li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22, 531-543 (2004).</li>
<li>Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad1+signaling+restricts+hematopoietic+potential+after+promoting+hemangioblast+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment.</a> Blood. 117, 6489-6497 (2011).</li>
<li>Zafonte, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad1+expands+the+hemangioblast+population+within+a+limited+developmental+window%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window.</a> Blood. 109, 516-523 (2007).</li>
<li>Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HoxB4+confers+definitive+lymphoid-myeloid+engraftment+potential+on+embryonic+stem+cell+and+yolk+sac+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors.</a> Cell. 109, 29-37 (2002).</li>
<li>Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling+regulates+the+bone+morphogenic+protein+pluripotency+pathway+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).</li>
<li>Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+patterning+activity+of+SCL%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesodermal patterning activity of SCL.</a> Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).</li>
<li>Kyba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+hematopoietic+differentiation+of+embryonic+stem+cells+conditionally+expressing+Stat5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).</li>
<li>Cao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-23a+regulates+TGF-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+by+targeting+E-cadherin+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells.</a> Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).</li>
<li>Chan, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+antagonism+between+PDGF+and+the+TGFbeta+family+of+signalling+pathways+by+control+of+miR-24+expression%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression.</a> EMBO J. 29, 559-573 (2010).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+miR-23a+approximately+27a+approximately+24+decreases+transforming+growth+factor-beta-induced+tumor-suppressive+activities+in+human+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells.</a> Int J Cancer. 123, (2008).</li>
<li>Min, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-associated+miR-27a+inhibits+dendritic+cell-mediated+differentiation+of+Th1+and+Th17+cells+by+TAB3%2C+p38+MAPK%2C+MAP2K4+and+MAP2K7%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Immun%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7.</a> Genes Immun. 13, 621-631 (2012).</li>
<li>Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD41+marks+the+initiation+of+definitive+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo.</a> Blood. 101, 508-516 (2003).</li>
<li>Mitjavila-Garcia, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD41+on+hematopoietic+progenitors+derived+from+embryonic+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells.</a> Development. 129, 2003-2013 (2002).</li>
<li>Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+controlling+hematopoietic+stem+cell+functions+during+normal+hematopoiesis+and+hematological+malignancies.+Wiley+interdisciplinary+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Systems+biology+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews.</a> Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).</li>
<li>Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spi-B+can+functionally+replace+PU.1+in+myeloid+but+not+lymphoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development.</a> Embo J. 21, 2220-2230 (2002).</li>
<li>Dahl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+macrophage+and+neutrophil+cell+fates+by+the+PU.1%3AC%2FEBPalpha+ratio+and+granulocyte+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).</li>
</ol>

作者无任何竞争性财务利益需要披露。

如上所述，可利用多西环素系统生成可诱导表达目的基因的胚胎干细胞（ESC）克隆，但构建这些细胞系耗时且劳动强度大。本实验方案描述了一种方法，可在由ESC来源的拟胚体（EB）制备的单细胞悬液中表达目的基因。经病毒感染的细胞随后通过悬滴法重新聚集成EB，以观察其后续分化情况。在示例（图3）中显示，在分化第3天表达mirn23a基因簇可促进造血发育。此时，原始胚层组织已经形成，包括可发育为血液前体细胞的早期中胚层。在RW4 ESC分化第2天和第3天，通过定量反转录PCR（Q-RT-PCR，数据未显示）可检测到代表外胚层（Pax6）、内胚层（FoxA2）和中胚层（T、Twist和Tbx6）的基因表达。若要增强造血前体细胞（HPC）的生成，mirn23a可能需要在早期中胚层中表达。该技术使得研究人员能够在不耗费大量精力构建新型试剂的情况下，判断转基因在不同时间点表达是否会产生不同的效应。当观察到与特定时间表达相关的表型后，研究者可进一步投入精力构建可诱导表达细胞系，以实现对转基因表达的精确调控。
该技术的其他应用包括在基因双...

小鼠胚胎干细胞（ESCs）具有多能性，在白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）存在的情况下能够保持未分化状态并自我更新1。当撤除LIF后，这些细胞会自发分化形成称为类胚体（embryoid bodies, EBs）的三维（3D）结构2。这种3D结构可促进外胚层、内胚层和中胚层这三种胚层的发育，随后进一步分化为成熟的组织类型3。胚胎干细胞是研究细胞分化分子机制的优异模型，尤其适用于早期造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells, HPCs）发育过程的研究4。
可通过多种技术操控胚胎干细胞（ESCs）中的基因表达，从而确定单个分子在发育过程中的作用。其中最常用的技术之一是利用同源重组技术构建缺乏特定目的基因的ESC细胞系5,6。此外，也有多种技术可用于基因的过表达。最早用于修饰ESC基因表达的技术是用重组逆转录病毒感染细胞7,8。然而，目的基因在ESC分化为前体细胞及成熟细胞类型的过程中常常发生沉默。使用慢病毒可在一定程度上抑制病毒介导基因表达的沉默现象9。其他用于过表达的病毒载体还包括腺病毒和腺相关病毒10。此外，常规的转染技术被广泛用于稳定导入表达质粒，以实现ESC中外源基因的表达11。这些系统存在一个共同难点：特定基因的表达效果往往因其表达时序的不同而有所差异。例如，Smad1蛋白在拟胚体（EB）发育的不同阶段对造血细胞发育的影响各不相同12,13。
通过生成可诱导表达目的基因的胚胎干细胞（ESCs），可以规避这一问题。目前在胚胎干细胞中诱导表达外源基因最常用的系统是利用大肠杆菌（E. coli，Escherichia coli）的四环素抗性操纵子。已开发出多种不同的四环素诱导系统，其中一种较受欢迎的策略由Kyba及其同事提出14。他们构建了一株胚胎干细胞系（Ainv15），该细胞系在持续活跃的ROSA26位点插入了反向四环素转录激活因子基因。同时，在X染色体上的HPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）位点引入了四环素反应元件（TRE）、下游LoxP位点（来自P1噬菌体的X-over P1位点）以及一个无启动子的新霉素抗性基因盒。利用CRE介导的重组方法，可将目的基因与驱动新霉素抗性基因表达的真核启动子一同插入LoxP位点。通过G418筛选可分离出正确靶向的胚胎干细胞克隆，随后需检测这些克隆中外源基因是否可在多西环素（或四环素）诱导下表达。该策略已成功构建出可诱导表达HoxB4、Stat5、SCL和Smad7的胚胎干细胞系14-17。然而，构建此类可诱导细胞系的过程耗时较长。本文介绍一种方法：将胚胎干细胞来源的拟胚体（EBs）解离为单细胞悬液，在不同发育时间点通过逆转录病毒感染细胞悬液，再通过悬滴法重新形成拟胚体。后续的分化情况则通过流式细胞术进行评估。本文以实例展示了miRNA在拟胚体来源细胞中的表达对造血分化的影响。该方法适用于研究特定胚层组织形成后基因的功能。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基乙醇</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胚胎干细胞筛选型）</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>FBS（明确成分型）</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>LIF ESGRO</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>ACCUMAX</td><td>Millipore</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 组织培养板 6 孔</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 未处理板 6 孔</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 培养皿 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 培养皿 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-148</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 离心管 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 带细胞滤网盖的 5 ml 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>白色无菌储液槽</td><td>U.S.A. Scientific</td><td>111-0700</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD41 PE 标记抗体</td><td>Biolegend</td><td>133906</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD117 APC/CY7 标记抗体</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>RW4 胚胎干细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-12418</td><td></td></tr></tbody></table>

逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体细胞以分析造血分化

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

胚胎干细胞（ESCs）是阐明细胞分化分子机制的优秀模型，尤其适用于研究早期造血祖细胞（HPCs）的发育过程。可通过多种技术操控ESC中的基因表达，从而确定单个分子在发育中的作用。一个难点在于，特定基因的表达往往因其表达时间的不同而产生不同的表型效应。该问题可通过构建可诱导表达目的基因的ESC系来克服，例如使用多西环素诱导型转基因系统。然而，构建此类可诱导细胞系成本高且耗时。本文描述了一种方法：将ESC来源的拟胚体（EBs）解离为单细胞悬液，通过逆转录病毒转导感染细胞悬液，随后采用悬滴法重新形成EBs，再通过流式细胞术评估后续分化情况。利用该方案发现，在ESC分化起始阶段外源表达某个microRNA基因会阻断HPC的生成；而当该microRNA基因在EB来源细胞中、于原始中胚层形成后表达时，则可促进造血分化。该方法适用于研究特定胚层组织形成后基因的功能。

在这些研究中，使用了来自129X1/SvJ小鼠品系的RW4来源的已凝胶化的胚胎干细胞（ESCs）。在分化第3天分离拟胚体（EBs）。为获得最佳结果，EBs应呈球形且不贴壁（图1A、B）。通过使用共表达荧光标记GFP及目的基因的病毒进行离心接种（spinoculation）后，采用悬滴法重新形成EBs。从分化第2.0、2.5和3.0天的EBs制备的细胞悬液均能成功重新形成EBs，但从第4.0天的EBs制备的细胞悬液则无法重新形成EBs。在分化第8天，通过荧光显微镜观察感染细胞与非感染细胞之间EBs的嵌合情况（图2A、B）。由于EBs密度较高，常使其看起来似乎100%为GFP阳性。然而，通过聚焦于不同的焦平面，可揭示GFP阳性与阴性细胞对EBs的贡献（图2B）。
为了分析造血祖细胞（HPC）的发育，将嵌合体拟胚体（EB）在分化8天后解离为单细胞悬液。拮抗mirn23a基因簇（miR-23a、24-2和-27）中miRNA的活性会导致胚胎干细胞（ESCs）无法分化为血液...

在分化中的胚胎干细胞（ESCs）中调控基因的时间特异性表达，可利用诱导型基因系统实现。然而，构建此类细胞系成本较高且耗时较长。本实验方案可实现外源基因在分化中的ES来源细胞中的快速表达，并进一步分析其下游的造血分化过程。

胚胎干细胞（ESCs）是阐明细胞分化分子机制的杰出模型。它们尤其适用于……

本实验的总体目标是研究在胚胎干细胞分化过程中不同时间点基因表达对造血分化的影响。在对胚体进行转导后，通过离心获得单细胞悬液，再采用悬滴法重新形成胚体，并进行培养以促进其进一步分化为造血细胞。随后，制备重新形成的胚体的单细胞悬液，与荧光染料标记的抗体孵育，并通过流式细胞仪分析其造血分化情况。最终，该方法可用于验证在胚胎干细胞分化过程中某个基因的表达是否影响造血发育。该方法尤其适用于研究那些仅在早期胚胎组织形成后才具有活性的基因功能。目前常见的在胚胎干细胞分化不同阶段诱导基因表达的技术，需要构建胚胎干细胞系，并利用多西环素等诱导剂实现目的基因的可诱导表达。建立这些细胞系可能耗时较长。本方案的优势在于，只要研究者拥有可用于基因表达的逆转录病毒质粒，便可立即开展实验。我们最初了解到这一方法的思路，是在观察到一些原本假设可促进造血分化的基因在未分化细胞中却产生了相反效应时。这表明在该基因发挥作用之前，需要先形成美沙酮作用的组织。按照文本方案中所述，在所需发育阶段开始本方案，首先获取由胚胎干细胞衍生的胚胎体（EB）。将EBs从10厘米的培养皿转移至15毫升的锥形管中。用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤平板，并将洗涤液加入锥形管中。然后在室温下以315 ×g离心5分钟，使EBS沉淀。离心结束后。弃去上清液，随后用五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤EB细胞。再次离心细胞并弃去上清液。接着，向细胞沉淀中加入一毫升解冻的细胞解离溶液。将试管置于37摄氏度水浴中孵育30分钟，期间偶尔轻轻振荡。孵育结束后，加入1毫升分化培养基，并用移液器上下吹打混匀。使用连接P200移液器吸头的2毫升移液器进行操作。洗涤细胞后，将试管再次置于37摄氏度水浴中孵育30至60分钟。与之前相同，将细胞重悬于1.5毫升分化培养基中。然后将细胞悬液转移至六孔未经组织培养处理的培养板中。根据病毒滴度，向细胞中加入 5 至 100 微升病毒上清液。不要添加 polybrene 以增强感染，因为这会抑制后续 EB 的重新形成。在室温下以 2,125 ×g 离心 90 分钟，使细胞接种病毒。首先，向感染的 EB 细胞悬液的每孔中加入 2 毫升分化培养基，以诱导细胞分化。然后将3.5毫升感染的EB细胞悬液用移液器转移至无菌试剂储液槽中。若使用多通道移液器，则用多通道移液器吸取并滴加15至20行、每行8个20 µL液滴，滴于倒置的15 cm培养皿盖内表面。向培养皿的下半部分加入 10 毫升无菌 PBS 或水。然后将带有液滴的皿盖倒置，放置在培养皿上。确保液滴悬挂在皿盖下方，且 PBS 或水位于底部，以保持培养 chamber 的湿润环境。将培养皿放入37摄氏度、含5%二氧化碳的组织培养箱中。两天后，通过倒置盖子并用4.5毫升分化培养基冲洗，收集悬滴中形成的EBS。将培养基和EBS转移至新的10厘米非组织培养用培养皿中。然

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科研

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Biology

生物学

小鼠胚胎的逆转录病毒感染干细胞衍生胚体细胞造血分化的分析

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9...

从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

本文描述了一种从造血干细胞/祖细胞体外生成成熟人红细胞的 ex vivo 实验方案。此外，我们还介绍了一种高效的慢病毒递送方法，用于在原代红系细胞中敲低转录因子 TAL1。通过表达 GFP...

慢病毒介导的基因敲低过程 离体 人类造血干细胞的红细胞生成

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

本方案描述了构建人源化骨髓/肝/胸腺小鼠模型的方法，该模型基于干细胞工程技术，可产生针对HIV感染的免疫反应。...

基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗HIV感染

造血干细胞和祖细胞（HSPC）在发育过程中来源于特化的（生血性）内皮细胞，但关于部分内皮细胞如何特化为造血细胞的过程仍知之甚少。我们展示了一种基于流式细胞术的方法，可从鼠胚组织中同时分离生血性内皮细胞和HSPC。...

小鼠胚胎造血性内皮细胞的分离

我们提出了一种基于逆转录病毒的单个T细胞受体（TCR）快速且灵活的实验方案 体内 表达系统。逆转录病毒载体用于转导骨髓前体细胞，以研究单个TCR的T细胞发育与功能 体内...

逆转录病毒感染骨髓前体细胞以生成T细胞受体逆转录转基因小鼠

本文所述方案详细介绍了通过过表达少量转录因子，在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导造血程序的方法。该技术可被拓展至人类体系，为未来研究造血过程、血液系统疾病以及造血干细胞移植提供平台。...

利用转录因子重编程小鼠胚胎成纤维细胞以诱导造血程序

我们介绍了一种利用小鼠胚胎干细胞生成二维或三维类胚体的技术。随后，我们阐述了如何通过视黄酸诱导类胚体细胞的神经分化，以及如何利用前体细胞标志物的免疫荧光染色和免疫印迹法分析其分化状态。...

二维和三维拟胚体中视黄酸诱导小鼠胚胎干细胞神经分化的分析

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

本文介绍了一种通过过继性细胞转移（ACT）将干细胞来源的病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞移植到小鼠体内，从而有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验方案。该方法可进一步优化，用于HBV感染的潜在ACT免疫治疗研究。...

干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

本文介绍了一种用于逆转录病毒过表达及小鼠B-1a细胞过继转移的方法，以研究B-1a细胞在体内的迁移与定位。该方案可进一步扩展用于多种下游功能检测，包括定量分析供体B-1a细胞的定位，或在过继转移后检测供体细胞衍生的分泌因子。...

在小鼠B-1a细胞中通过逆转录病毒过表达CXCR4并进行过继转移，以实现B-1a细胞向骨髓的靶向迁移及IgM的产生

学习利用逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞，通过悬滴培养形成胚体并诱导造血分化，结合流式细胞术分析基因表达对造血发育的影响。该方法可快速研究基因在特定分化阶段的功能。

逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体细胞以分析造血分化

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