方法在小鼠肾上腺嗜铬细胞细胞贴附电容测量
2014年10月22日
胞吐作用后，融合的质膜通过称为内吞作用的过程被回收。这种机制重组新的突触小泡以进行下一轮释放。通过使用小鼠肾上腺嗜铬细胞中的细胞附着电容记录来捕获和分析单个内吞事件。
该程序的总体目标是检测单个囊泡、胞质增和内吞作用。这是通过首先获得小鼠肾上腺组织的清洁和完全消化来实现的。第二步是将细胞从肾上腺解离并铺板。
接下来，鉴定色蛋白细胞并膜片钳以获得细胞附着的电容记录。最终，可以观察到单个囊泡、胞质作用和内吞作用。与现有方法（例如单离子通道的细胞附着记录）相比，该技术的主要优点是我们能够检测单个囊泡的胞吐作用和内吞作用。
这种方法的视觉演示很有用，因为获得千兆密封很难学习。此外，在板内发现的混合细胞类型中可能难以识别细胞。为了准备手术，首先要对一对大大小小的解剖器、剪刀和两对镊子进行高压灭菌。
然后将解剖盘放在冰桶上。同时开始用 5% 二氧化碳和 95% 氧气鼓泡酶溶液。溶液在冒泡之前是亮粉色的。下一个。
在对新生至三天大的老鼠实施安乐死并斩首后，使用较小的剪刀沿着脊柱从颈椎到绳索区域剪下幼犬的背部。一定要在皮肤下浅表切开，以免刺穿体腔。接下来，将皮肤从脊柱上剥开，以便露出肌肉组织，并清楚地看到脊柱。
现在在颈脊髓处做一个横切，然后用一对镊子固定动物的主体，沿着脊柱的侧面做两个平行的切口。用另一对镊子抓住脊柱并剥开脊柱，直到肾脏暴露出来。在肾脏顶部找到肾上腺后，使用镊子将其取出。
然后小心地将肾上腺放入装满锁溶液的锥形管中。使用第二对镊子移开肾上腺。如果它们粘在第一对镊子上，请将锥形管放在冰上。
腺体可以在锁定溶液中保存长达两个小时。此时，检查酶溶液，确保平衡溶液已从亮粉色变为粉橙色。接下来，将 pape 添加到新鲜泡泡的酶溶液中，最终浓度为每毫升 20 至 25 单位。
然后将丙烷酶溶液加入新的锥形管中，并使用镊子将肾上腺转移到丙烷酶管中。将腺体在 40 摄氏度下孵育 60 至 37 分钟。然后向每个试管中加入 75% 的灭活溶液，并在 37 摄氏度下再孵育 10 分钟。
10 分钟后，轻轻地将腺体转移到新标记的试管中，并用培养基洗涤腺体 3 次。洗涤后，将腺体放入 200 微升培养基中，然后通过 200 微升移液器的移液器吸头轻轻上下滴定腺体。滴定时，用 200 微升移液器吸头的向下力保持管底的腺体，并轻柔缓慢地接合组织。请务必使用缓慢、连续的行程，切勿在滴定后快速或突然移液，额外添加 250 微升培养基，使培养基的总体积达到 450 微升。
接下来，7 个 12 毫米 PDL 预涂层盖玻片放在 60 x 50 毫米的培养皿板中。然后将 60 μL 含有细胞的溶液接种到 7 个盖玻片中的每一个上。装盘后，将培养皿放入 37 摄氏度的培养箱中 30 分钟。
孵育后，向培养皿中轻轻加入 5 mL 预热培养基，然后孵育 24 小时，然后再进行细胞贴壁记录。孵育放置后，将含有肾上腺细胞的 12 毫米盖玻片放入细胞外溶液中。由于使用了整个肾上腺，下一步是区分色素细胞和皮质细胞。
在培养中，色素细胞通常非常明亮，呈棕米色和近乎完美的圆形。相比之下，皮质细胞比 CHRO 细胞更小、更暗。按照文本方案中的说明拉动贴片移液器后，将移液器吸头浸入融化的蜡中以降低玻璃的电容。
然后用火抛光吸头，吹走移液器吸头内部的蜡。接下来，使用膜片移液器溶液构建移液器，使其电阻约为 2 兆欧姆。将补液管连接到其纵器上，并将其置于细胞的几微米范围内。
继续推进移液器，寻找任何轻微的细胞变形。一旦发现变形，轻轻抽吸，直到达到千兆级密封。产生单元附着配置。
一旦显示千兆密封，使用 EPC 7 plus 膜片钳放大器和两相模拟锁相放大器进行单元连接记录，如文本协议中所述，设置锁相放大器的相位，以便通过轻柔的吸力产生瞬态电容变化。脉冲仅出现在贴片电容或 Im 走线中，没有投影到贴片中，电导或回溯的贴片过程用作机械刺激。由于通常可以从大多数电池中记录动作电流，因此通过标记的向下步骤来识别典型的电容变化。
最后一步是保存数据以供将来分析。这里显示的是具有多个向下步骤的典型电池连接电容记录。每个下降步骤都与单个 iCal 内吞作用相关。
一旦掌握，细胞培养可以在 2 到 3 小时内完成，并且可以在显影后的 4 天内进行记录。这项技术为突触传递领域的研究人员探索神经内分泌色素蛋白细胞中的突触小泡再循环铺平了道路。
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概述
本研究重点在于检测小鼠肾上腺髓质细胞中单个小泡胞吞作用和内吞作用。该方法涉及膜片钳技术以获得细胞附着电容记录，允许观察单个小泡的胞吞作用和内吞作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 电生理学
背景
- 胞吞作用是小泡与质膜融合的过程。
- 内吞作用重新获取融合的膜并重新形成突触小泡。
- 理解这些过程对于洞察神经传递至关重要。
- 电容记录提供了一种在单个小泡水平上分析这些事件的方法。
研究目的
- 检测并分析单个小泡的胞吞作用和内吞作用。
- 改进现有的小泡动力学研究方法。
- 增强对突触传递机制的理解。
使用的方法
- 消化小鼠肾上腺组织以获得细胞。
- 解离和培养肾上腺髓质细胞。
- 鉴定髓质细胞以进行膜片钳。
- 细胞附着电容记录以观察小泡动力学。
主要结果
- 成功检测到单个小泡的胞吞作用和内吞作用。
- 展示了电容记录相对于传统方法的优势。
- 提供了对突触小泡循环机制的洞察。
- 有助于理解神经递质释放过程。
结论
- 该技术允许对小泡动力学进行详细研究。
- 研究结果增强了对突触传递的理解。
- 在研究各种神经生物学过程中的潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution cell-attached capacitance measurements in mouse adrenal chromaffin cells enable direct quantification of single-vesicle endocytosis, a critical process in synaptic vesicle recycling. This capability strengthens mechanistic de-risking and predictive confidence in early neurobiology target validation. The method supports translational continuity by providing quantitative, reproducible data on vesicle dynamics relevant to neurotransmission and neuroendocrine function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of vesicle recycling mechanisms at the single-event level.
- Supports functional target validation by quantifying endocytic kinetics in neuroendocrine cells.
- Reduces mechanistic ambiguity in synaptic transmission studies.
- Facilitates predictive confidence for neurobiology-focused portfolios.
Screening & Assay Development
- Provides validated electrophysiological readouts for downstream assay development.
- Enables standardization of vesicle event detection for reproducible screening workflows.
- Delivers quantitative outputs suitable for compound evaluation in synaptic function assays.
- Supports scalability and platform reuse in neuroendocrine model systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for neurotransmitter release and vesicle recycling.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of synaptic targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative vesicle dynamics.
- Provides mechanistic de-risking for neuroendocrine and synaptic transmission programs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both target validation and assay development for neuroendocrine and synaptic transmission research.
- Discovery Biology: Quantifies endocytic events to clarify vesicle recycling pathways and test mechanistic hypotheses.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative capacitance measurements for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Provides high-resolution readouts for comparing experimental conditions and kinetic parameters.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models of neurotransmitter release and synaptic function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological platform for diverse neurobiology R&D initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in synaptic biology.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable electrophysiological measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in patch clamp electrophysiology and cell identification.
- Needs specialized amplifiers and analytical infrastructure for capacitance recordings.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different neuroendocrine or neuronal cell types.
- Technical challenges include achieving giga-ohm seals and distinguishing cell subtypes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Adrenal Gland Isolation
2:52
Tissue Digestion
3:50
Cell Dissociation and Plating
5:16
Cell Identification and Gigaohm Seal Formation
6:41
Cell-attached Capacitance Recordings
7:34
Results: Cell-attached Capacitance Recording Shows Endocytosis in Chromaffin Cells
7:52
Conclusion
