定量免疫荧光测定法用于测量中心体蛋白水平的变化

本实验的总体目标是定量分析在不同条件下中心体中某种蛋白质水平的相对变化。例如，在抑制蛋白酶体后细胞周期的特定时间点，首先用蛋白酶体抑制剂MG132或对照溶剂DMSO处理生长在盖玻片上的细胞，随后立即向两组细胞中加入BrdU，并在细胞培养箱中孵育四小时。

第二步是将盖玻片转移至24孔板中以固定细胞。接着，使用抗BRDU抗体以及目标蛋白的抗体对细胞进行染色，然后使用相应的二抗进行孵育。最后一步是利用荧光显微镜和数字成像软件获取各组样本中BRDU阳性细胞的图像，并对所有样本的细胞应用相同的曝光时间和Z轴扫描范围。

然后分析图像以定量测定中心体中 VDA C3 的相对水平。最终，通过定量免疫荧光显微技术显示，在 S 期抑制蛋白酶体时，中心体内的 VDA C3 水平增加至原来的两倍。该方法相较于现有技术（如流式细胞术、免疫印迹或定量显微镜）的主要优势在于，该技术可对经不同处理的两个样本（分别处理于两个不同的盖玻片上）中蛋白质的相对水平进行分析。该方法利用内参标准归一化，以校正两个实验细胞群体在处理过程中可能引入的差异。

此外，尽管该方法可用于研究中心体上特定蛋白质的调控机制，也可应用于其他情况，例如其他亚细胞结构，或检测在细胞内多个位点存在的特定蛋白质亚群。本实验操作将由我实验室的博士后 Schu Majumder 演示。实验开始时，将 2 × 10⁵ 个处于异步生长状态的 RPE-1 细胞接种至预先准备好的 35 毫米培养皿中（含盖玻片），并在 2 毫升完全培养基中培养细胞。

每24小时更换一次培养基，使用新鲜的预热培养基。44小时后，更换培养基为含有0.05% DMSO或MG one 15（终浓度为5 µM）的完全培养基，同时向细胞中加入BRDU，使其终浓度为40 µM，将细胞继续培养4小时。接着，将每个盖玻片转移至24孔板中。

向每个孔中加入 500 µL 预冷的甲醇，并将培养板置于 -20 °C 下孵育，以固定细胞。10 分钟后，立即用 500 µL 洗涤缓冲液将盖玻片洗涤三次。在细胞孵育的同时，将固定后的细胞连同盖玻片一起置于 200 µL 封闭缓冲液中，孵育 30 分钟。

通过将一张湿润的纸巾放入一个空的1000微升移液器吸头盒的下半部分来准备一个加湿孵育盒。将一条帕洛甲醛膜条放置在支架表面，并在膜条上加入20微升抗体溶液液滴，该溶液为兔抗V DDA三抗体和鼠抗γ微管蛋白抗体用封闭缓冲液稀释后混合而成。封闭完成后，将盖玻片倒置覆盖在每滴抗体溶液上。

确保细胞完全浸没，然后盖上吸头盒的盖子。将细胞与一抗在湿盒中于4°C孵育过夜。再次倒置盖玻片，并将其放回24孔板中。

用培养皿清洗盖玻片，然后在含有150微升二抗溶液（用封闭缓冲液稀释）的条件下于室温孵育一小时。孵育结束后，用洗涤缓冲液清洗盖玻片三次。用500微升在零下20摄氏度预冷的甲醇固定染色的RPE细胞。细胞固定10分钟后，再用洗涤缓冲液清洗三次。

接下来，在 200 微升的 2 倍浓度正常 HCl 中将细胞孵育 30 分钟。在室温下，用 300 微升 1 摩尔 Tris-Cl（pH 8）中和细胞，并用洗涤缓冲液洗涤细胞 3 次。随后在室温下，用 200 微升封闭缓冲液封闭细胞 30 分钟。

封闭后，在湿润孵育盒中，将细胞与大鼠抗 BRDU 抗体和封闭缓冲液在 37 摄氏度下孵育 45 分钟。将盖玻片放回 24 孔板中，洗涤细胞。

接着，将样本与用150微升封闭缓冲液稀释的二抗在室温下于24孔板中孵育一小时。然后用一滴XPBS缓冲液洗涤盖玻片三次，每次使用六微升含Antifa试剂的封片液滴加在玻璃显微镜载片上。

将盖玻片细胞面朝下倒置，轻轻放置于载玻片的封片液上。用柔软的擦镜纸轻轻按压盖玻片，以去除多余液体并将其密封在显微载玻片上。沿盖玻片边缘涂抹指甲油，以固定盖玻片。

使用100倍平场复消色差油镜物镜（数值孔径1.4），在室温下采集BrdU阳性RPE细胞的图像。沿Z轴以0.2微米的步长确定合适的上下焦平面，并沿Z轴采集图像。随后，对沿Z轴采集的所有图像堆栈进行去卷积处理。

获取每张图像的总强度投影。对于中心体间距小于两微米的细胞，沿Z轴进行图像叠加。在两个中心体周围分别绘制一个边长为20至30像素的小方框，并标记所选区域。

在第一个方框周围绘制一个边长为24至35像素的较大方框，并标记大方框中选定的区域。然后获取每个荧光标记物的面积和总荧光强度。在每个方框中，计算经背景校正后的每个荧光标记物的荧光强度。

最后通过计算VDA C3的荧光素Four在扣除背景后的荧光强度与其所用内参标准的荧光素Four的比值，获得归一化的荧光强度。选取异步生长的RPE1细胞，用BRDU以及蛋白酶体抑制剂MG115或对照溶剂DMSO孵育后，随机拍摄多个视野的图像，显示DNA和BRDU。扣除背景后的荧光强度对应于着丝粒区域。

如该箱线图所示，经MG132处理的细胞中VD3水平约为对照组细胞的2.5倍。当以γ-微管蛋白的荧光强度对总VD3荧光进行归一化处理后，倍数增加略微下降至约2倍。蛋白酶体抑制对非核周细胞或细胞总体水平的VD3染色无影响。

因此，VDA C3 的 romal 池通过蛋白酶体介导的降解作用进行调控。在进行该实验操作时，需注意针对检测蛋白和内参标准的抗体必须由不同宿主物种产生，且两个样本的成像必须采用相同的成像参数（例如 C 切片数量和曝光时间），以最大限度地减少数字成像带来的影响。