定量免疫检测，以衡量在中心体的变异蛋白水平

该程序的总体目标是量化各种条件下 Centrosomes 蛋白质水平的相对变化。例如，在抑制蛋白酶体后细胞周期的特定点，这是通过首先用蛋白酶体抑制剂 MG one 15 或对照溶剂 DMSO 处理在盖玻片上生长的细胞来实现的。然后立即向两个细胞中加入 BRDU，并在细胞培养箱中孵育 4 小时。

第二步是将盖玻片转移到 24 孔板上以固定细胞。接下来，用针对 BRDU 和目标蛋白的抗体对细胞进行染色，然后用相应的二抗进行染色。最后一步是使用荧光显微镜和数字成像软件获取 BRDU 阳性细胞的图像，以对每个样品的细胞施加相同的曝光时间和 Z 轴长度。

然后分析图像以量化 romal VDA C3 的相对水平。最终，定量免疫荧光显微镜用于显示当蛋白酶体在 S 期受到抑制时，VDA C3 的中心体库增加了两倍。与流式细胞术、免疫印迹或定量显微镜等现有方法相比，该技术的主要优点是该技术分析了在两个不同盖玻片上处理的两个不同处理样品中蛋白质的相对罗马水平。该方法使用内标标准化来控制处理两个实验细胞群的需求。

另外，虽然这种方法可以提供对中心体特定蛋白质调节的见解。它也可以应用于其他情况，例如其他亚细胞结构或检查在细胞内多个位点发现的特定蛋白质库。演示该程序的将是我实验室的博士后 schu majumder 开始实验通道两次 10 到第五次异步生长 RPE 一个细胞放入预先准备好的带有盖唇的 35 毫米培养皿中，并在两毫升完全培养基中培养细胞。

44 小时后，每 24 小时更换一次培养基，更换一次新鲜的预热培养基。用含有 0.05% DMSO 或 MG one 15 的完全培养基替换培养基，终浓度为 5 微摩尔，同时将终浓度为 40 微摩尔的 BRDU 添加到细胞中，孵育细胞 4 小时。接下来，将每个盖玻片转移到 24 孔板中。

向每个孔中加入 500 微升预耕甲醇，并在零下 20 摄氏度下孵育板以固定细胞。10 分钟后，立即用 500 μL 洗涤缓冲液清洗盖玻片 3 次。盖上盖子孵育固定的细胞，在细胞孵育时加入 200 μL 封闭缓冲液 30 分钟。

将湿纸巾放在空的 1000 μL 移液器吸头盒的下半部分，准备一个加湿室。将一条香水放在架面上，并将 20 微升兔抗 V DDA 3 和小鼠抗 γ 微管蛋白抗体液滴（在封闭缓冲液中稀释）添加到多联体上。封闭后，将盖玻片倒置到抗体溶液的每滴上。

确保细胞浸入水中并合上吸头盒的盖子。将细胞与一抗在加湿室中于 4 摄氏度孵育过夜。再次倒置盖玻片并将其放回 24 中。

将盖玻片洗净，然后在 150 μL 二抗溶液中孵育，在封闭缓冲液中在室温下稀释 1 小时孵育孵育后，用洗涤缓冲液清洗盖玻片 3 次。用 500 微升甲醇固定染色的 RPE one 细胞，并在零下 20 摄氏度下冷却。细胞固定 10 分钟后，在洗涤缓冲液中洗涤 3 次。

接下来，将细胞在 200 μL 两种正常 HCL 中孵育 30 分钟。在室温下，用 300 微升 1 摩尔 tris CL pH 8 中和细胞，并洗涤细胞 3 次。使用洗涤缓冲液，用 200 μL 封闭缓冲液在室温下封闭细胞 30 分钟。

封闭后，将细胞与大鼠抗 BRDU 抗体和封闭缓冲液在加湿室中于 37 摄氏度孵育 45 分钟。将盖玻片放回 24.将细胞放入培养皿并清洗。

接下来，将它们与在 150 μL 封闭缓冲液中稀释的二抗一起孵育。在 24 孔培养皿中，在室温下放置 1 小时。然后用一个 XPBS 点清洗盖玻片 3 次，XPBS 点是玻璃显微镜上含有 Antifa 试剂的 6 微升封固液液滴。

盖玻片倒置，使电池面朝下滑到封固液上。用柔软的清洁纸轻轻按压盖玻片，以去除多余的液体，将盖玻片密封在显微镜上。沿着盖玻片的边缘涂抹指甲油滑动。

使用具有 1.4 数值孔径的 100 x 平面 APO 油浸物镜在室温下获取 BRDU 阳性 RPE one 细胞的图像。以 0.2 微米的步长确定沿 Z 轴的适当顶部和底部焦平面，并沿 Z 轴采集图像。接下来，对沿 Z 轴采集的所有图像堆栈执行反卷积。

获取每个图像的总强度投影。对于中心体相距小于 2 微米的细胞，沿 Z 轴堆叠。在两个中心体周围画一个每边 20 到 30 像素的小方块，并标记所选区域。

在第一个正方形周围绘制一个每边 24 到 35 像素的较大正方形，并标记大正方形的选定区域。然后获得每个荧光 4 的面积和总荧光强度。在每个框中，计算每个荧光的背景校正荧光强度。四。

最后，通过计算其荧光的背景校正荧光强度的比率，获得 VDA C3 的归一化荧光强度。4 比 4 的荧光，用于所选内标图像的 4 个用于所选内标图像的随机区域捕获了与 BRDU 和蛋白酶体抑制剂 MG one、15 或对照溶剂 DMSO 一起孵育的异步生长的 RPE one 细胞的随机区域，并显示 DNA 和 BRDU。背景校正了对应于 Centro Somal 的荧光强度。

VD 3 在 MG one 中大约高出 2.5 倍，在 MG one 中处理过 15 个细胞，然后在对照细胞中高出约 2.5 倍，如此箱须图所示。当总 VD 3 荧光与 γ 微管蛋白的数据进行归一化时，倍数增加，略微下降至大约两倍。非乳细胞的 VD C3 染色或 VD 3 的总细胞水平不受蛋白酶体抑制的影响。

因此，VDA C3 的罗马池受蛋白酶体介导的降解调节。在尝试此过程时，重要的是要记住，针对测试蛋白和内标的抗体必须在不同的宿主物种中产生，并且应使用相同的成像参数（例如 C 剖腹产的数量和曝光时间）获取两个样品的图像，以尽量减少数字成像的影响。