由肌营养不良症患者尿源性细胞高效无整合重编程生成诱导性多能干细胞

以下实验的总体目标是利用肌营养不良症患者的尿源性细胞培养物，通过无整合的重编程方法，高效地生成诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPSC）。该过程首先采集肌营养不良症患者的尿液样本；第二步，分离尿液中的细胞并将其扩增为尿源性细胞培养物。

接下来，使用含有山中因子的仙台病毒对尿源性细胞进行转导，12天后出现典型的类似多能性的细胞集落。最终在第13代时，可通过RT-PCR分析确认多能干细胞已处于无外源基因整合的状态。该技术相较于现有方法（如利用慢病毒载体对分离的皮肤成纤维细胞进行重编程）的主要优势在于，可通过非侵入性方式从患者体内获取体细胞，并利用无足迹的病毒重编程方法高效地生成诱导多能干细胞（IPCs）。

该方法有助于回答肌肉营养不良研究领域中的一些关键问题，例如如何在体外建立此类疾病的模型，同时避免对人体应用带来的安全顾虑。演示本实验操作的人员包括博士后研究员 Mohammad Zishan Al、技术员 Courtney Guesting 和研究生 Melanie Ryder，他们均来自我的实验室。采集尿液样本时，首先建议患者在采集前30分钟饮用适量液体，以确保能够收集到约30至40毫升的尿液。当患者准备就绪后，提供一套尿液采集工具包，其中包含以下物品：获取无菌或清洁中段尿样本的书面说明、湿润的抗菌厕纸，以及一个100毫升的无菌标本采集杯。

样本采集后，立即将采样杯置于冰上，并将样本放入冷藏容器中转移至实验室。随后，使用无菌移液器将尿液样本转移至无菌的 50 毫升离心管中，在室温下以 400 × g 离心 10 分钟。接着，在生物安全等级二级（BSL-2）的生物安全柜中，小心吸取上清液，仅保留最后 1 毫升，注意不要扰动沉淀物。

然后用 7 毫升洗涤缓冲液洗涤细胞，并再次离心沉淀细胞。此次吸除上清液时保留最后约 0.2 至 0.5 毫升。现在将沉淀重悬于 2 至 3 毫升尿源性祖细胞（urinary progenitor cell, UPC）培养基中，并在 72 小时后将细胞悬液转移至未包被的 24 孔板中的 4 至 6 个孔内，每孔补充 0.5 毫升新鲜 UPC 培养基。

培养期间监测细胞，孵育时间为四到六天。应开始出现少量由2至4个细胞组成的克隆，细胞呈圆形或长形，分别代表I型或II型肾上皮细胞。继续每两到三天更换一次培养基。

由于细胞集落在培养约9至15天时将进入快速扩增阶段，此时细胞应达到80%至90%融合度，需将细胞传代至24孔板的2至4个孔中以进一步扩增。将此次培养标记为第1代细胞传代，随后可通过流式细胞术分析、免疫组织化学染色或逆转录酶聚合酶链式反应对尿源性细胞进行谱系特异性标志物的鉴定，以确保在转导接种前具有高效的重编程效率，每孔接种60,000个细胞。在第0天，将第1至第5代的细胞培养物接种至6孔板中的两个孔内。

通过将四种OSKM因子分别以适当的MLI加入1毫升预热的UPC培养基中，制备仙台病毒重编程载体；吸除悬浮培养基后，缓慢将病毒悬液加入一孔尿液细胞中，持续处理六天。此后每天更换新鲜UPC培养基。在第5天，将经丝裂霉素C处理的MEF饲养层细胞接种至明胶包被的100毫米方形培养皿中。第6天，用胰蛋白酶消化尿液细胞，重悬于UPC培养基中，并以每皿5×10⁴至2×10⁵个细胞的密度接种至MEF饲养层细胞上。

次日，将 UPC 培养基更换为人胚胎干细胞培养基（HES 培养基），并在显微镜下监测细胞，观察约 12 至 18 天后转化的细胞。转导后，细胞应形成具有典型鹅卵石样形态和较高核质比的克隆性聚集体。为鉴定重编程的诱导多能干细胞（iPSC）克隆，可使用 TRA-1-81 抗体进行活细胞染色。

然后使用26号半英寸针头将TRA-1-80阳性单克隆集落划分为每个克隆四到六个大小均等的小块。接着，在重编程的克隆接种到Matrigel表面后24至48小时，使用无菌移液器吸头从多个克隆中挑选并转移10至20个划痕处理的小块，放入含有人胚胎干细胞（hESC）培养基的24孔Matrigel包被培养板的各个孔中。

用iPSC培养基替换原有培养基。使用移液枪头手动刮除已分化的细胞或污染的鼠尾 feeder 细胞，以帮助纯化完全重编程且具有多能性的营养不良性iPSC克隆。当克隆生长至约100微米大小时，用EDTA处理3分钟以解离细胞，随后将重编程后的营养不良性iPSC小细胞团块接种至新鲜的Matrigel包被的12孔板中，细胞团块应悬浮于添加了RO激酶抑制剂的iPSC培养基中。

最后，通过基因表达分析和免疫组织化学染色来确认每个克隆的多能性。对于多能性标志物，从人尿液中分离的大多数细胞对祖细胞和干细胞标志物呈阳性，例如 CD 44、CD 73 和 CD 146。这些细胞还表达间充质标志物，如α-平滑肌肌动蛋白和menton。

分离细胞的R-T-P-C-R结果显示，培养物中含有混合型细胞群体。其中，细胞角蛋白7以及UIN1A和3A（尿路上皮细胞标志物）表达较弱。尿液细胞在重编程第0天呈长梭形的II型细胞，至第4天则转变为铺路石样形态。

到第12天，可观察到典型的多能性克隆，这些克隆能够在无饲养层条件下维持其多能性形态。可通过TRA-1-60的活细胞染色来鉴定重编程的克隆。为确认已生成无载体和外源基因的多能性克隆，可使用针对仙台病毒基因组及各个外源性OSKM因子的引物进行RT-PCR检测。

到第13代时，外源基因的表达已无法再被检测到，但内源性因子的上调仍可观察到。免疫荧光染色证实，诱导多能干细胞（IPCs）表达多能性标志物，而尿细胞则不表达。随后可通过进一步的免疫荧光染色、蛋白质印迹（western blotting）和逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）分别验证抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的蛋白及基因表达，这些代表性图像来自野生型对照和肌营养不良细胞系的实验结果。

掌握该技术后，可用于实现无病毒载体的重编程。在此操作后的几周内，可将诱导多能干细胞（IPCs）分化为心肌细胞或骨骼肌细胞，以进一步研究肌营养不良症的潜在机制。