Name: 从生成性肌营养不良患者诱导多能干细胞的：尿源性细胞的有效整合，免费重编程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 了解从肌营养不良患者尿液细胞中高效生成无整合诱导多能干细胞的方法。该技术利用仙台病毒转染实现非侵入性重编程，为再生医学研究提供安全可靠的细胞来源。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本方案的开发得到了 Advancing a Healthier Wisconsin 以及美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心通过资助号 8UL1TR000055 提供的支持。其内容仅由作者负责，不一定代表 NIH 的官方观点。

注意：患者和/或其监护人应签署知情同意书，同意参加经机构审查委员会批准的研究。
1. 缓冲液与培养基的配制
<ol>
	<li>洗涤缓冲液：制备 100 ml 洗涤缓冲液，将 1 ml 100 倍浓度的青霉素/链霉素溶液（100 U/ml 青霉素 + 100 µg/ml 链霉素）加入 99 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>尿源性祖细胞（UPC）培养基：制备 UPC 培养基时，将角质形成细胞无血清（KSF）培养基与祖细胞培养基等体积混合。
	<ol>
		<li>KSF 培养基：制备角质形成细胞培养基时，向 500 ml KSF 培养基中加入 5 ng/ml 表皮生长因子（EGF）、50 ng/ml 牛垂体提取物（BPE）、30 ng/ml 霍乱毒素以及青霉素/链霉素溶液（100 U/ml 青霉素，100 µg/ml 链霉素）。</li>
		<li>祖细胞培养基：将四分之三体积的 DMEM 与四分之一体积的 Ham-F12 培养基混合，并添加 10% 胎牛血清（FBS）、0.4 µg/ml 氢化可的松、0.1 nM 霍乱毒素、5 ng/ml 胰岛素、1.8 × 10-4 M 腺嘌呤、5 µg/ml 转铁蛋白、2 × 10-9 M 三碘甲腺原氨酸、10 ng/ml EGF 以及青霉素/链霉素溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人胚胎干细胞（hES）培养基：向 400 ml DMEM/F12 培养基中加入 20% KO-血清替代物（K-SR）、1 倍浓度 MEM 非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺、100 µM β-巯基乙醇、20 ng/ml bFGF 以及青霉素/链霉素溶液。</li>
</ol>
2. 尿液样本采集
<ol>
	<li>指导患者在尿液采集前 30 分钟饮用适量液体，以确保能够采集到足够的尿液量（约 30–40 ml）。</li>
	<li>向患者和/或其监护人提供尿液采集套装，内含以下物品：（1）获取无菌或清洁中段尿样本的书面说明，（2）湿润的抗菌湿巾，以及（3）一个 100 ml 的无菌标本采集杯。指导患者进行样本采集。</li>
	<li>立即将尿液样本置于冰上，并用冷藏箱转运至实验室。应立即处理尿液以分离细胞。若不可避免出现延迟，可将样本在冰上保存最多 4 小时，细胞活力损失最小。</li>
</ol>
3. 尿液细胞的分离与扩增
注意：以下步骤需在生物安全二级（BSL2）生物安全柜中的无菌条件下进行。
<ol>
	<li>使用无菌移液管将尿液样本转移至无菌的 50 ml 离心管中，在室温下以 400 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，保留约 1 ml，注意不要扰动管底的细胞沉淀。</li>
	<li>将多个离心管中的沉淀用 7 ml 洗涤缓冲液重悬并合并，再次在室温下以 400 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，保留细胞沉淀及约 0.2–0.5 ml 上清液，用 2–3 ml 尿源性祖细胞（UPC）培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至 2–6 个未经包被的 24 孔板孔中。</li>
	<li>72 小时后，每孔补充 0.5 ml 新鲜 UPC 培养基，此后每 2–3 天更换一次培养基。未贴壁的红细胞和鳞状细胞将随换液被清除。</li>
	<li>在接种后 4–6 天观察培养情况。 
	注：将开始出现 2–4 个细胞的小克隆。细胞呈圆形或细长形，分别代表肾小管上皮（RE）细胞的 I 型和 II 型3。</li>
	<li>自细胞出现后，每 2–3 天更换一次培养基，因为此时细胞将进入快速增殖阶段。</li>
	<li>当细胞融合度达到 80–90% 时（接种后约 9–15 天），将细胞消化并传代至 2–4 个 24 孔板孔中进行进一步扩增，接种密度为 15,000–18,000 个细胞/cm2。将此次传代标记为细胞第 1 代（P1）。</li>
	<li>通过流式细胞术分析、免疫组织化学染色或逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）对尿液来源细胞进行谱系鉴定。</li>
	<li>对分离获得的尿液细胞进行重编程（见第 4 节），或将其置于冷冻保存液（含 10% 血清和 10% DMSO 的 DMEM）中冷冻，用于长期低温保存。</li>
</ol>
4. 使用仙台病毒对尿液细胞进行重编程
注意：操作转染试剂时，建议正确处理并使用个人防护装备（PPE）。以下步骤应在生物安全二级（BSL2）生物安全柜中的无菌条件下进行。建议妥善处置转染试剂和/或转染后的细胞，以避免对环境和健康造成危害。对于尿液细胞重编程，请使用仙台病毒重编程试剂盒，并对生产商提供的依赖饲养层细胞的方案进行如下修改。
<ol>
	<li>为确保使用仙台病毒实现高效的重编程，应选用处于第1至第5代且快速分裂的尿液细胞。若细胞增殖不良或出现衰老现象，则应弃用，因其重编程效率低下。</li>
	<li>在6孔板的两个孔中，每孔接种60,000个细胞，标记为第-2天。根据需要调整接种密度（每孔5 × 104–9 × 104个细胞），以确保在第0天达到80–90%的融合度。</li>
	<li>在第0天（细胞接种后48小时），准备包含四个OSKM因子的仙台病毒重编程载体（SeV）。将各载体分别加入1 ml预热的UPC培养基中。使用MOI为1–1.5（5–7.5 × 105 CIU），此剂量足以对尿液细胞进行重编程。吸除原有培养基后，缓慢将1 ml UPC + SeV加入一个尿液细胞孔中。另一个孔作为转导阴性对照。</li>
	<li>在第1天，将UPC + SeV培养基更换为新鲜的UPC培养基。由于病毒的细胞毒性，24小时后可观察到部分细胞死亡。</li>
	<li>根据重编程克隆形成的效率及克隆的致密形态，持续每日更换培养基，直至第6或第7天。</li>
	<li>在转导细胞消化前一天（第5或第6天），通过将经丝裂霉素C（10 µg/ml，处理3小时）处理的MEF细胞以5 × 104个细胞/cm2的密度接种于0.1%明胶包被的100 mm2培养皿上，制备MEF饲养层平板。</li>
	<li>次日（第6或第7天），使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，将细胞重悬于UPC培养基中，并将5 × 104–2 × 105个细胞/100 mm2接种至MEF饲养层平板。</li>
	<li>次日，更换为hES培养基，并每日更换培养基。在显微镜下观察细胞，监测转化后的细胞状态。 
	注：转导后12–18天，细胞形成具有典型鹅卵石样形态的克隆样集落，且核质比升高。</li>
	<li>转导后两周至三周内，挑选克隆并转移至新培养板进行克隆扩增。</li>
	<li>通过活细胞染色法筛选iPSC克隆：将细胞在CO2培养箱中与TRA-1-81抗体于37 °C孵育1小时，随后加入特异性荧光染料标记的二抗，在CO2培养箱中37 °C复染1小时。</li>
	<li>使用26 G&#160;1½英寸针头将较大的TRA-1-81阳性iPSC克隆划成大小均一的小块（每个克隆4–6块）。</li>
	<li>使用无菌移液器吸头挑取多个克隆的10–20个划痕小块，转移至含hES培养基的Matrigel（10 µg/cm2）包被的24孔板的各个孔中。 
	注：单个克隆的片段若单独接种于单个孔中，则无法扩增或维持多能性。</li>
	<li>在重编程克隆贴附于Matrigel表面后24–48小时内，将培养基由hES培养基更换为iPSC培养基。</li>
	<li>在Matrigel包被的培养板上维持培养期间，使用移液器吸头手动刮除任何已分化的细胞或污染的MEF饲养层细胞，以富集完全重编程且具有多能性的肌营养不良iPSC（MD-iPSC）克隆。</li>
	<li>当单个克隆达到约100 μm大小时，使用0.48 mM EDTA（乙二胺四乙酸）溶液消化3分钟，将MD-iPSC的小细胞集落重悬于含5 μM Y27632（ROCK激酶抑制剂）的iPSC培养基中，接种至新鲜Matrigel（10 µg/cm2）包被的12孔板中进行扩增。每日更换iPSC培养基。</li>
	<li>每个克隆的完全重编程可通过OSKM基因的表达分析以及多能性标志物（Oct3/4和TRA-1-81）的免疫组织化学染色来确定。应采用严格的多能性潜能评估方法，以确认完全重编程的iPSC系能够分化为三个胚层。该目标可通过拟胚体（EB）形成与分化实验或畸胎瘤形成实验实现。</li>
</ol>

<ol><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+cardiomyocytes+derived+from+human+urine%3A+New+biologic+reagents+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).</li>
<li>Dick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+and+Gene+Transfer+Restore+Dystrophin+Expression+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Cardiomyocytes+Harboring+DMD+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations.</a> Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+as+a+Model+for+Familial+Dilated+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Nakanishi, M., Otsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Sendai+virus+vectors+and+their+potential+applications+in+gene+therapy+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine.</a> Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).</li>
<li>González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+nuclear+envelope+localization+of+dystrophin+Dp71+and+dystrophin-associated+proteins+%28DAPs%29+in+the+C2C12+muscle+cells%3A+DAPs+nuclear+localization+is+modulated+during+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis.</a> J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).</li>
<li>Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+dystrophin+Dp71+impairs+PC12+cells+cycle%3A+localization+in+the+spindle+and+cytokinesis+structures+implies+a+role+for+Dp71+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division.</a> PloS One. 6 (8), e23504(2011).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

利用诱导多能干细胞（iPSCs）建立心血管疾病模型已成为研究遗传因素贡献的常用方法4-6。通过提供尿液采集等非侵入性方法，可以避免从患者（尤其是年幼儿童）获取细胞样本时存在的一些意外困难。在这一年轻患者群体中，常常难以收集到足够体积的尿液以获得足量可用于重编程的尿细胞。指导年幼患者在尿液采集前30分钟饮用液体，有助于提高尿细胞分离的成功率。然而，在该人群中可能仍需多次重复采集尿液。为了优化从杜氏肌营养不良症患者中分离和培养尿细胞（UCs）的效果，我们整合并改进了两种不同的实验方案3,7。
已从肌营养不良症患者的皮肤成纤维细胞或尿液细胞中成功生成诱导性多能干细胞1,2。然而，这两种重编程方案均依赖于慢病毒将重编程因子导入体细胞。这种整合型病毒递送方法可能存在风险，因为外源基因若随机整合至宿主基因组中，可能引发外源基因再激活或诱变（详见文献8综述）。因此，我们改进了这些技术，采用仙台病毒以非整合方式将OSKM转录因子基因导入尿液细胞9。
利用仙...

心肌病是杜氏与贝克型肌营养不良症（MD）患者死亡的第二大原因。尽管X连锁的肌营养不良蛋白基因突变在每3,500例男性出生中即有一例发生，但目前对导致心肌进行性损伤的分子与细胞事件仍知之甚少。近年来，从肌营养不良症患者来源的人诱导性多能干细胞已成为研究疾病潜在机制及用于药物筛选的一种新型工具1,2。
皮肤活检或采血可能带来的不适感，可能会使年轻患者和/或其监护人不愿同意参与研究。尿液样本是一种非侵入性获取体细胞的来源，适用于重编程技术。我们近期已证明，从肌营养不良症患者收集的尿液细胞可被培养，并通过使用Yamanaka因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc；OSKM）的逆转录病毒转导高效地重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）1。逆转录病毒基因递送的缺点是重编程基因会随机整合到宿主染色体中。为克服这一局限，我们采用了非整合型仙台病毒进行尿液细胞的重编程。
本方案详细描述了利用仙台病毒对肌营养不良症患者尿液中分离的细胞进行重编程，随后可将这些细胞分化为心肌细胞或其他细胞类型以供进一步研究。该方案也可根据需要调整，用于其他患者特异性疾病的研究所。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4 盎司带盖标本杯</td><td>STL Medical Supply</td><td>M9AMSAS340</td><td>用于尿液样本采集</td></tr><tr><td>15 ml BD-Falcon 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml BD-Falcon 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>圆形玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 仙台病毒重编程试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>A1378-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（不含谷氨酰胺）&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>B-27 补充剂（含胰岛素，50 倍浓缩）</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>B-27 补充剂（不含胰岛素，50 倍浓缩）</td><td>Life Technologies</td><td>0050129SA</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>DMEM/F12（1:1）</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>Versene，1:5,000</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>bFGF（10 &amp;micro;g）</td><td>Life Technologies</td><td>13256-029</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>细胞计数器专用计数板</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>无血清培养用胎牛血清（500&amp;nbsp;ml 瓶装）</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>Recovery 细胞冻存培养基</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>角质形成细胞-SFM（1 倍浓度，液体）</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>Ham's F-12 营养混合物&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>EGF 重组人蛋白，液态</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311L</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>胰岛素，人重组，锌溶液</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5940</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂（Y-27632）</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>适用于人胚胎干细胞的基质，不含 LVED</td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix（2 倍浓度）</td><td>Thermo-Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>经鉴定适用于细胞培养的胎牛血清（FBS-Qualified）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>腺嘌呤生物试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2786-5G</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>霍乱弧菌来源的霍乱毒素 &lt;em&gt;Vibrio cholerae&lt;/em&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1G</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>人全转铁蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0665-50MG</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397-100MG</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-3598</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount 水性封片剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Alfa-Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>小鼠抗 CD44 抗体 - FITC 标记&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>560977</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 CD146 抗体 - PE 标记</td><td>BD Biosciences</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 CD73 抗体 - PE 标记</td><td>BD Biosciences</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗-&amp;alpha;-平滑肌肌动蛋白抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗波形蛋白（Vimentin）抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8978-100</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 TRA-1-81 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>411100</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 Oct 3/4 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗肌营养不良蛋白（Dystrophin）抗体</td><td>Leica Biosystems</td><td>NCL-DYSB</td><td></td></tr></tbody></table>

由肌营养不良症患者尿源性细胞高效无整合重编程生成诱导性多能干细胞

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

营养不良性心肌病是肌营养不良症的一种尚未被充分理解的后果。从肌营养不良症患者身上获取诱导多能干细胞（iPSCs）是研究该疾病极为宝贵的细胞来源。 在&#160;体外 疾病模型系统可用于药物筛选研究。已成功将患者来源的尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞，用于构建营养不良性心肌病模型。1为解决整合型载体系统的安全问题，我们提出了一种利用非整合型仙台病毒载体将山中因子转导至杜氏肌营养不良症患者尿液细胞的实验方案。该方案可在2至3周内获得完全重编程的克隆。经第13代传代后，多能干细胞中已无载体残留。这些肌营养不良症诱导多能干细胞可分化为心肌细胞，可用于疾病机制研究或药物筛选。

从人尿液中分离的大多数祖细胞对尿路上皮祖细胞和壁细胞标志物呈阳性，例如 CD44、CD73 和 CD146（分别为 97.37%、97.09% 和 97.3%；图 1A 和 1B）。这些细胞还表达其他间充质标志物，如 α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin）和波形蛋白（vimentin）（图 1B）。RT-PCR 分析表明培养物中存在混合细胞群体，表现为角蛋白-7（Cytokeratin-7, CK-7）以及尿路斑蛋白（Uroplakin, UP）-Ia 和 -IIIa 表达较弱，这些是尿路上皮谱系的标志物（图 1C）。
重编程步骤的示意图见图2A。代表性图像展示了在实验流程不同时间点的细胞形态（图2B）。尿液细胞在重编程过程中从细长的II型细胞（第0天）转变为鹅卵石样形态（第4天）。到第12天时，可观察到典型的多能性克隆（iPSC），并在无饲养层条...

本方案包含从肌营养不良症患者尿液中分离尿源细胞的详细步骤，以及通过仙台病毒转导实现这些细胞高效快速重编程的方法。

营养不良性心肌病是肌肉萎缩症的一种尚未充分理解的继发性后果。通过从患有……的患者身上生成诱导多能干细胞（iPSCs）

以下实验的总体目标是利用肌营养不良症患者的尿源性细胞培养物，通过无整合的重编程方法，高效地生成诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPSC）。该过程首先采集肌营养不良症患者的尿液样本；第二步，分离尿液中的细胞并将其扩增为尿源性细胞培养物。接下来，使用含有山中因子的仙台病毒对尿源性细胞进行转导，12天后出现典型的类似多能性的细胞集落。最终在第13代时，可通过RT-PCR分析确认多能干细胞已处于无外源基因整合的状态。该技术相较于现有方法（如利用慢病毒载体对分离的皮肤成纤维细胞进行重编程）的主要优势在于，可通过非侵入性方式从患者体内获取体细胞，并利用无足迹的病毒重编程方法高效地生成诱导多能干细胞（IPCs）。该方法有助于回答肌肉营养不良研究领域中的一些关键问题，例如如何在体外建立此类疾病的模型，同时避免对人体应用带来的安全顾虑。演示本实验操作的人员包括博士后研究员 Mohammad Zishan Al、技术员 Courtney Guesting 和研究生 Melanie Ryder，他们均来自我的实验室。采集尿液样本时，首先建议患者在采集前30分钟饮用适量液体，以确保能够收集到约30至40毫升的尿液。当患者准备就绪后，提供一套尿液采集工具包，其中包含以下物品：获取无菌或清洁中段尿样本的书面说明、湿润的抗菌厕纸，以及一个100毫升的无菌标本采集杯。样本采集后，立即将采样杯置于冰上，并将样本放入冷藏容器中转移至实验室。随后，使用无菌移液器将尿液样本转移至无菌的 50 毫升离心管中，在室温下以 400 × g 离心 10 分钟。接着，在生物安全等级二级（BSL-2）的生物安全柜中，小心吸取上清液，仅保留最后 1 毫升，注意不要扰动沉淀物。然后用 7 毫升洗涤缓冲液洗涤细胞，并再次离心沉淀细胞。此次吸除上清液时保留最后约 0.2 至 0.5 毫升。现在将沉淀重悬于 2 至 3 毫升尿源性祖细胞（urinary progenitor cell, UPC）培养基中，并在 72 小时后将细胞悬液转移至未包被的 24 孔板中的 4 至 6 个孔内，每孔补充 0.5 毫升新鲜 UPC 培养基。培养期间监测细胞，孵育时间为四到六天。应开始出现少量由2至4个细胞组成的克隆，细胞呈圆形或长形，分别代表I型或II型肾上皮细胞。继续每两到三天更换一次培养基。由于细胞集落在培养约9至15天时将进入快速扩增阶段，此时细胞应达到80%至90%融合度，需将细胞传代至24孔板的2至4个孔中以进一步扩增。将此次培养标记为第1代细胞传代，随后可通过流式细胞术分析、免疫组织化学染色或逆转录酶聚合酶链式反应对尿源性细胞进行谱系特异性标志物的鉴定，以确保在转导接种前具有高效的重编程效率，每孔接种60,000个细胞。在第0天，将第1至第5代的细胞培养物接种至6孔板中的两个孔内。通过将四种OSKM因子分别以适当的MLI加入1毫升预热的UPC培养基中，制备仙台病毒重编程载体；吸除悬浮培养基后，缓慢将病毒悬液加入一孔尿液细胞中，持续处理六天。此后每天更换新鲜UPC培养基。在第5天，将经丝裂霉素C处理的MEF饲养层细胞接种至明胶包被的100毫米方形培养皿中。第6天，用胰蛋白酶消化尿液细胞，重悬于UPC培养基中，并以每皿5×10⁴至2×10⁵个细胞的密度接种至MEF饲养层细胞上。次日，将 UPC 培养基更换为人胚胎干细胞培养基（HES 培养基），并在显微镜下监测细胞，观察约 12 至 18 天后转化的细胞。转导后，细胞应形成具有典型鹅卵石样形态和较高核质比的克隆性聚集体。为鉴定重编程的诱导多能干细胞（iPSC）克隆，可使用 TRA-1-81 抗体进行活细胞染色。然后使用26号半英寸针头将TRA-1-80阳性单克隆集落划分为每个克隆四到六个大小均等的小块。接着，在重编程的克隆接种到Matrigel表面后24至48小时，使用无菌移液器吸头从多个克隆中挑选并转移10至20个划痕处理的小块，放入含有人胚胎干细胞（hESC）培养基的24孔Matrigel包被培养板的各个孔中。用iPSC培养基替换原有培养基。使用移液枪头手动刮除已分化的细胞或污染的鼠尾 feeder 细胞，以帮助纯化完全重编程且具有多能性的营养不良性iPSC克隆。当克隆生长至约100微米大小时，用EDTA处理3分钟以解离细胞，随后将重编程后的营养不良性iPSC小细胞团块接种至新鲜的Matrigel包被的12孔板中，细胞团块应悬浮于添加了RO激酶抑制剂的iPSC培养基中。最后，通过基因表达分析和免疫组织化学染色来确认每个克隆的多能性。对于多能性标志物，从人尿液中分离的大多数细胞对祖细胞和干细胞标志物呈阳性，例如 CD 44、CD 73 和 CD 146。这些细胞还表达间充质标志物，如α-平滑肌肌动蛋白和menton。分离细胞的R-T-P-C-R结果显示，培养物中含有混合型细胞群体。其中，细胞角蛋白7以及UIN1A和3A（尿路上皮细胞标志物）表达较弱。尿液细胞在重编程第0天呈长梭形的II型细胞，至第4天则转变为铺路石样形态。到第12天，可观察到典型的多能性克隆，这些克隆能够在无饲养层条件下维持其多能性形态。可通过TRA-1-60的活细胞染色来鉴定重编程的克隆。为确认已生成无载体和外源基因的多能性克隆，可使用针对仙台病毒基因组及各个外源性OSKM因子的引物进行RT-PCR检测。到第13代时，外源基因的表达已无法再被检测到，但内源性因子的上调仍可观察到。免疫荧光染色证实，诱导多能干细胞（IPCs）表达多能性标志物，而尿细胞则不表达。随后可通过进一步的免疫荧光染色、蛋白质印迹（western blotting）和逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）分别验证抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的蛋白及基因表达，这些代表性图像来自野生型对照和肌营养不良细胞系的实验结果。掌握该技术后，可用于实现无病毒载体的重编程。在此操作后的几周内，可将诱导多能干细胞（IPCs）分化为心肌细胞或骨骼肌细胞，以进一步研究肌营养不良症的潜在机制。

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-muscular-dystrophy

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

从生成性肌营养不良患者诱导多能干细胞的：尿源性细胞的有效整合，免费重编程

我们介绍一种利用编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体，将人类体细胞高效重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC），并通过Tra-1-81抗体活细胞染色鉴定正确重编程的hiPSC的实验方案。...

从成人成纤维细胞重编程获得的人诱导性多能干细胞克隆的筛选与分离

由诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的成肌祖细胞是治疗肌肉营养不良症的细胞治疗策略中颇具前景的候选细胞。本方案描述了在急性与慢性肌肉再生小鼠模型中，评估iPSC来源的血管壁干细胞（一类肌肉祖细胞）移植后植入与分化能力所需的移植操作及功能检测方法。...

诱导多能干细胞来源的类血管壁细胞样肌源性前体细胞在小鼠肌肉再生模型中的移植

本文介绍一种基于表观遗传重编程的实验方案，可将人类胚胎干细胞（hESCs）定向诱导为均一的骨骼肌前体细胞群体；在允许性培养条件下，这些前体细胞可形成具有收缩功能的三维肌纤维簇（肌球体），从而重现人类骨骼肌的生物学特征。...

通过表观遗传重编程由人胚胎干细胞生成肌球体

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

诱导性多能干细胞（iPSCs）是临床应用和基础研究中患者特异性组织的重要来源。本文详细介绍了一种利用非整合型附加体质粒将来自冻存富集白细胞层的人外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为无病毒iPSCs的实验方案。...

利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

本文介绍了一种基于Cas9的外显子23缺失方案，用于在源自Dmdmdx小鼠皮肤成纤维细胞的诱导多能干细胞（iPSC）中恢复抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的表达，并利用Tet-on...

利用CRISPR/Cas9技术恢复iPSC来源的肌前体细胞中抗肌萎缩蛋白的表达

本方案介绍了通过仙台病毒感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞，将iNSCs分化为多巴胺能神经元，将多巴胺能前体细胞移植到单侧损毁的帕金森病小鼠模型，并评估iNSC来源的多巴胺能前体细胞用于帕金森病治疗的安全性和有效性。...

从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究

本文介绍了一种利用MYOD1转分化的尿液来源细胞高效构建杜氏肌营养不良症肌肉模型的详细方案，用于评估外显子跳跃后抗肌萎缩蛋白mRNA和蛋白水平的恢复情况。...

从人尿源性细胞直接重编程获得的肌管中的外显子跳跃

本方案描述了将皮肤成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步分化为肌管细胞的过程。这些细胞系来源于患有神经肌肉疾病的患者，可用于研究病理机制以及测试治疗策略。...

直接重编程人类成纤维细胞为成肌细胞以研究神经肌肉疾病疗法

本方案描述了一种从人和非人灵长类动物尿液来源细胞中分离、扩增并重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法，以及新生成的iPSCs在无饲养层条件下的维持培养操作指南。...

尿源性灵长类诱导多能干细胞的建立与维持

了解从肌营养不良患者尿液细胞中高效生成无整合诱导多能干细胞的方法。该技术利用仙台病毒转染实现非侵入性重编程，为再生医学研究提供安全可靠的细胞来源。

由肌营养不良症患者尿源性细胞高效无整合重编程生成诱导性多能干细胞

探索更多视频