从开发小脑显微切割分离的不同的细胞群
2014年9月21日
巢蛋白表达祖细胞是在发展中国家小脑的神经元祖细胞的新发现的种群。用在这里用荧光激活细胞分选组合呈现的显微切割技术中，该细胞群可与任何其他小脑区域污染被纯化和可以培养用于进一步研究。
该程序的总体目标是从发育中的小脑中分离特定细胞群。这是通过首先从携带荧光蛋白的新生小鼠中采集小脑来实现的。该程序的第二步是使用颤音获得活组织切片。
第三步是在荧光解剖显微镜下显微解剖小脑的外生发层。最后的步骤是将组织解离成单细胞悬液，并通过荧光激活细胞分选收集细胞。最终，结果可以表明可以从小脑中分离出特定的细胞群。
与现有方法（如激光捕获、显微解剖）相比，该技术的主要优点是细胞是活的并且可以培养。进一步实验 对于此程序，使用高压灭菌器对手术工具进行消毒。将新鲜或重新加热的 3% 低熔点 aros 准备在 37 摄氏度的水浴中使用。
构成基于木瓜的细胞解离所需的溶液。准备新鲜的 NBB 27 培养基。然后过滤、消毒并储存在培养箱中。
准备传真缓冲液并准备 poly de lycine 盖玻片。第一涂高压灭菌器盖玻片每毫升无菌水含 100 μg poly de lycine。然后将盖玻片在 37 摄氏度下孵育 2 小时或在室温下孵育过夜。
之后，在使用盖玻片之前，先用蒸馏水清洗盖玻片，然后用 NBB 27 介质清洗。将它们完全擦干。这至少需要一个小时才能开始。
首先准备解剖区域。用 70% 乙醇擦拭干净。然后用吸水垫盖住。
其次，从消毒袋中取出工具并放置以供使用。第三，在培养皿中加入冰冷的无菌 DPBS 和 1% 笔条，并将其放在冰上。解剖表达荧光标志物的 P 四幼崽的大脑。
然后将其转移到准备好的 DPBS 盘中。使用镊子小心地将小脑与大脑的其他部分分开。这些小脑表达 CFP 中的标志物数学一、GFP 和巢，其中 EGL 表达 GFP，分子层对 CFP 呈阳性。
接下来，用 agro 溶液填充一个 2 厘米长的立方体包埋模具。确保温度不超过 37 摄氏度。用带孔的勺子拿起小脑，轻轻擦拭纸巾擦干。
然后用镊子将其放入模具中。用针头使小脑垂直方向。一次，将大约 4 个装入模具中。
将模具放在冰上，这样它就会迅速凝固 使用剃须刀片。修剪块以减少切片时间。然后将块粘在定向板上，使小脑垂直。
在装入装盘的冰冷 DPBS 和 1% 压边带，然后将冰块放在烤盘下方使其保持低温。现在用振动器将块切开。切割和收集 600 微米的切片。
用多孔勺子将它们从冰盘中取出，然后将它们转移到加冰的 A-D-P-B-S 盘中。在荧光解剖显微镜下。尽快检查切片。
小心地将 EGL 与小脑切片的其余部分分开。使用细镊子解剖 CFP 阳性分子层和 GFP 阳性 EGL 之间。显微解剖时要非常保守，以避免来自相邻区域的污染。
将 GFP 阳性 EGL 组织转移到冰上装满 DPBS 的新培养皿中。避免包括任何分子层组织，因为这会污染表达 Bergman 胶质细胞的嵌套培养物。接下来，去除分离的 EGL 组织周围的 agros。
现在，可以使用基于 paan 的单细胞悬液方案解离 EGL。完成此作后，resus 将单元格挂起在传真缓冲区中。继续使用传真收集 CFP 信元。
使用高速细胞仪和 CFP 过滤器对它们进行分类，然后将它们拉入冰冷的传真缓冲液中。每个 P 4 个小脑应获得约 100， 000 NPS。然后将混合细胞以 300 G 离心 5 分钟。
立即利用细胞进行 resus 培养。将它们悬浮在预热的 NBB 27 介质中。然后将它们加载到多聚 D 赖氨酸涂层的盖玻片上。
细胞贝拉切片由 CFP 小鼠的 P 4 数学 1 个 GFP 巢制备。小脑 EGL 主要包含表达 GFP 的 GMP，可以很容易地与富含表达 CFP 的神经胶质细胞的分子层分离 事实分析表明，EGL 中超过 85% 的细胞是常规 GNP。
这些细胞约占 EGL 培养 4 天细胞的 5%。分离的 NPS 产生了表达 β 微管蛋白的神经元。这是谱系限制性神经元祖细胞的特征。
在尝试此程序时，重要的是要记住快速工作并尽可能将组织保持在冰上。
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概述
本文介绍了一种从新生小鼠发育中的小脑中分离表达nestin的祖细胞的方法。该技术结合了显微解剖和荧光活化细胞分选，以纯化这些祖细胞以供进一步研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 表达nestin的祖细胞是小脑中一种新发现的细胞群。
- 了解这些祖细胞可以提供关于神经元发育的洞见。
- 现有的细胞分离方法往往导致污染。
- 本研究旨在提高分离细胞群的纯度。
研究目的
- 从小脑中分离特定的神经元祖细胞群。
- 为这些细胞的进一步实验和分析提供可能。
- 展示一种能保持细胞活力以供培养的技术。
使用的方法
- 用荧光标记物从新生小鼠中收集小脑。
- 在荧光显微镜下对外部生殖层进行显微解剖。
- 将组织分离成单细胞悬液。
- 通过荧光活化细胞分选收集特定的细胞群。
主要结果
- 从小脑中成功分离了特定的细胞群。
- 超过85%的分离细胞被确认为常规的GNPs。
- NEPs被分离出来，占EGL细胞的约5%。
- 分离的祖细胞生成了表达β-tubulin的神经元。
结论
- 该方法允许分离活体神经元祖细胞。
- 这种技术可以增强小脑发育的研究。
- 维持组织活力对于成功的细胞培养至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from heterogeneous tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and assay development. This microdissection-FACS workflow enables the recovery of live, contamination-free progenitors, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in neuronal lineage studies. The ability to culture isolated cells bridges discovery biology with translational biomarker exploration in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Nestin-expressing progenitors as a distinct therapeutic hypothesis in cerebellar development.
- Operational Value: Provides a purified cell population free from contaminating granule neuron precursors and Bergman glia for functional target assessment.
- Predictive Value: Supports lineage-restricted progenitor validation through beta-tubulin+ neuronal differentiation readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a live, single-cell suspension suitable for downstream fluorescent-activated sorting and phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation through vibratome sectioning and microdissection under fluorescence guidance for reproducible EGL isolation.
- Assay Readiness: Yields approximately 100,000 viable progenitors per P4 cerebellum, enabling scalable compound testing in culture.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Isolated Nestin-expressing progenitors maintain viability for at least four days in culture, supporting preclinical phenotypic analysis.
- Biomarker Alignment: Beta-tubulin expression serves as a measurable readout for neuronal differentiation, aligning with translational biomarker strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Pure progenitor isolation reduces mechanistic ambiguity in de-risking neuronal differentiation pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven isolation of rare cell populations prior to functional screening and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of progenitor identity and spatial localization within the external germinal layer.
- Screening: Produces a standardized, live cell suspension compatible with FACS-based sorting and compound exposure assays.
- Analytics: Enables quantitative measurement of progenitor frequency (~5% of EGL) and differentiation outcomes via beta-tubulin expression.
- Translational Research: Connects isolated progenitors to preclinical validation through sustained culture and lineage-specific marker expression.
- Enterprise Reuse: The microdissection-FACS workflow is adaptable to other fluorescently labeled tissues, supporting platform-level application across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating live Nestin-expressing progenitors free from adjacent cellular contamination.
- Operational Value: Standardizes tissue viability preservation through ice-cold handling and rapid processing, enabling consistent culture initiation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in neuronal progenitor studies by providing purified, functional cell inputs.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of cerebellar development targets through reliable, contamination-free cellular models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent tissue dissection and microdissection under stereomicroscopy to maintain spatial precision.
- Dependent on cryostat-compatible embedding media (low-melting agarose) and vibratome sectioning at 600-micron thickness.
- Necessitates standardized FACS setup with CFP and GFP filters for parallel isolation of molecular layer and EGL populations.
- Requires poly-D-lysine coating and NBB 27 media preparation for adherent progenitor culture and differentiation assays.
- Practical limitation: Tissue must be processed rapidly on ice to prevent viability loss, restricting batch size without coordinated workflow.
