Name: 从开发小脑显微切割分离的不同的细胞群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习利用显微切割和荧光激活细胞分选技术，从新生小鼠发育中的小脑分离巢蛋白阳性神经前体细胞。该方法可获得高纯度活细胞用于体外培养，为研究小脑发育和神经元分化提供可靠实验基础。

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作者谨此感谢 James Oesterling 在流式细胞术方面的协助。本研究得到了美国国家癌症研究所资助（R01-CA178380，Z.Y.）以及美国国立卫生研究院博士后培训资助（5T32CA009035-37，L.W.Y.）的支持。

本方案中动物的使用已按照福克斯蔡斯癌症中心动物护理与使用委员会批准的程序进行。
1. 仪器、溶液和盖玻片的准备
<ol>
	<li>清洁两把#5精细镊子、一把#7精细弯头镊子、一把大手术剪、一把显微解剖剪、一把刮匙和一把带孔匙。将器械放入自封式灭菌袋中并进行高压灭菌。使用前保持器械存放于灭菌袋内。</li>
	<li>制备3%低熔点琼脂糖溶液。
	<ol>
		<li>将1.5 g琼脂糖加入50 ml无菌Dulbecco&#8242;将磷酸盐缓冲液（DPBS）加入烧瓶中，放入微波炉加热至出现气泡。摇动烧瓶，并继续加热直至所有琼脂糖完全溶解。若出现团块，加热前可用搅拌子搅拌溶液。</li>
		<li>将溶液储存在37 &#176;C水浴中，直至使用。</li>
		<li>长期保存时，可将琼脂糖溶液于室温或 4 ℃ 保存以备后续使用 &#176;数月内于室温保存。使用微波炉加热至融化。若需多次加热琼脂糖溶液，加热前需称量锥形瓶重量，并用温热的无菌蒸馏水补足至初始重量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照先前所述方法制备以下用于木瓜蛋白酶消化的细胞解离溶液2:
	<ol>
		<li>含木瓜蛋白酶（100 U/ml）、半胱氨酸（0.2 mg/ml）和DNase（250 U/ml）的无菌含酚红DPBS溶液</li>
		<li>含酚红的无菌DPBS中含卵类粘蛋白溶液、牛血清白蛋白（BSA；8 mg/ml）、大豆胰蛋白酶抑制剂（8 mg/ml）和DNase（250 U/ml）。 
		将两种溶液均通过滤器除菌，并调节pH值，使含酚红的DPBS恢复至原始颜色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备细胞培养基（NB/B27）：在基础培养基中添加1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素（P/S）和B27添加剂。过滤除菌，避光保存。将培养基在37℃预平衡 &#176;C 和 5% CO₂2 使用前</li>
	<li>配制FACS缓冲液：将5%胎牛血清（FBS）加入DPBS中。向47.5 ml DPBS中加入2.5 ml FBS。</li>
	<li>准备经多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的盖玻片。
	<ol>
		<li>高压灭菌新的玻璃盖玻片。</li>
		<li>用PDL（100）包被盖玻片 &#956;g/ml 溶于无菌蒸馏水中），37℃孵育 2 小时 &#176;室温过夜。</li>
		<li>用无菌蒸馏水清洗盖玻片，再用无菌蒸馏水洗涤一次&#160;NB/B27 培养基。使用前将盖玻片在组织培养罩内彻底晾干。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织切片的解剖与制备
<ol>
	<li>解剖当天，用70%乙醇擦拭解剖区域，并铺上吸水垫。</li>
	<li>从灭菌袋中取出解剖工具。在小型培养皿中加入冰冻的无菌DPBS/1% P/S，并置于冰上。</li>
	<li>使用大型手术剪剪下P4 Math1-GFP/Nestin-CFP 小鼠幼崽的头部，然后用精细弯镊固定头部。用#5精细镊子剥离皮肤并轻轻移除颅骨，再用刮勺从颅骨中取出脑组织，转移至含有DPBS/1% P/S的培养皿中。
	<ol>
		<li>使用#5精细镊子，小心地将小脑与脑的其余部分分离。务必一次快速解剖一只幼鼠。</li>
		<li>至少收集8个小脑，以获得足够的NEPs用于分子和功能分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用3%低熔点琼脂糖溶液填充一个尺寸为2 x 2 x 2 cm的包埋模。确保琼脂糖温度不超过37 °C。</li>
	<li>用实验纸巾轻轻吸去小脑表面多余液体。将小脑垂直放入包埋模中，并将模具置于冰上使其快速凝固。每个包埋块使用约4个小脑。</li>
	<li>使用振动切片机获取活体组织切片。用刀片修整含小脑的琼脂糖块。将琼脂糖块（小脑保持垂直方向）用胶固定在振动切片机的载物板上。</li>
	<li>在振动切片机的托盘中加入冰冻的无菌DPBS/1% P/S，并在托盘下方放置冰块。
	<ol>
		<li>对整个小脑进行600 μm厚度的切片。使用带孔的勺子从冰托盘中收集切片，并将切片置于盛有DPBS/1% P/S并置于冰上的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 显微解剖与细胞分离
<ol>
	<li>将含有组织切片的培养皿置于荧光解剖显微镜下。
	<ol>
		<li>使用精细镊子小心地将外颗粒层（EGL）从其余的小脑切片中分离，解剖位置位于CFP+分子层与GFP+外颗粒层之间（参见图1中的虚线）。注意避免带入任何分子层部分，否则会导致表达Nestin的伯格曼胶质细胞污染。</li>
		<li>此步骤应尽快完成，并将组织保持在冰上，以防止细胞死亡。</li>
		<li>在进入下一步之前，去除组织周围的琼脂糖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用基于木瓜蛋白酶的消化方案（如先前所述2）消化显微解剖获得的EGL组织，以得到单细胞悬液。
	<ol>
		<li>将细胞重悬于FACS缓冲液中，用于通过流式细胞分选（FACS）收集CFP阳性细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞分选与铺板
<ol>
	<li>使用无菌的高速流式细胞仪（配备适当的CFP滤光片），根据CFP荧光对细胞进行分选，并将细胞收集于冰上的FACS缓冲液中。从每个P4小脑中获取约100,000个NEPs。</li>
	<li>以300 × g离心5分钟。立即用于分子分析或培养以进行后续实验。</li>
	<li>如需培养细胞，将细胞重悬于预热的NB/B27培养基中，并接种至PDL包被的盖玻片上，具体方法如前所述2。</li>
</ol>

<ol><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li>
<li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li>
<li>Riobo, N. A., Manning, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+signal+transduction+employed+by+vertebrate+Hedgehogs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs.</a> Biochem J. 403, 369-379 (2007).</li>
<li>Dahmane, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sonic+Hedgehog-Gli+pathway+regulates+dorsal+brain+growth+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis.</a> Development. 128, 5201-5212 (2001).</li>
<li>Marino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma%3A+developmental+mechanisms+out+of+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control.</a> Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).</li>
<li>Yang, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li>
<li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).</li>
<li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li>
<li>Sutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+stem+cells+act+as+medulloblastoma-initiating+cells+in+a+mouse+model+and+a+neural+stem+cell+signature+characterizes+a+subset+of+human+medulloblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas.</a> Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).</li>
<li>Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li>
<li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li>
<li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li>
<li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处所述的显微解剖方法是首个能够分离出活细胞纯群体并用于分子与功能分析的技术。如Li所示 等9, 通过该方法获得的NEPs可进行培养并用于各种实验，且由于其纯度较高，也可用于微阵列分析。
花时间熟练掌握这种显微解剖技术非常重要。神经上皮前体细胞（NEPs）位于外颗粒层（EGL）的深层区域，紧邻分子层，而表达Nestin的伯格曼胶质细胞可能污染NEP细胞的分离，从而影响纯度。因此，显微解剖操作应谨慎进行，以确保不包含邻近组织中的污染细胞。本文所述显微解剖技术的主要优势在于能够获得可存活的细胞，用于后续培养和实验。正因如此，整个操作过程中的每一步都必须迅速完成，并尽可能将组织保持在冰上。此外，所有器械和试剂均须无菌。遵循这些步骤可减少细胞死亡和细胞培养污染。另外，将多个小脑组织固定在同一块琼脂糖凝胶块上，有助于缩短操作时间。
该技术不仅限于NEPs的分离，还可用于收集小脑其他区域的细胞，例如分子层中的胶质细胞以及白质中的神经干细胞。除了小脑之外，显微解剖技...

小脑由多个细胞层组成，每层包含不同类型的细胞。在发育过程中，外颗粒层（EGL）含有增殖的颗粒神经元前体细胞（GNPs），而分子层和浦肯野层分别含有伯格曼胶质细胞和浦肯野神经元。小脑深部为白质，其中含有神经干细胞（NSCs）和少突胶质细胞1。
Sonic hedgehog（Shh）在调控小脑发育中起关键作用，特别是通过与其受体Patched（Ptc）结合，促进颗粒神经前体细胞（GNPs）的增殖，而Ptc是Shh信号通路的负向调控因子2-4。Shh信号通路的异常激活可导致髓母细胞瘤（MB）的发生，MB是儿童中最常见的恶性脑肿瘤5,6。
Ptc 突变型髓母细胞瘤（MB）转基因小鼠模型是研究髓母细胞瘤的有力工具，其产生的肿瘤与人类髓母细胞瘤相似7,8。利用这些小鼠模型，研究人员发现颗粒神经元前体细胞（GNPs）是音猬因子型（hedgehog-type）髓母细胞瘤的起源细胞7。此外，除了GNPs之外，我们最近还鉴定出在发育中的小脑外颗粒层（EGL）中存在一类独特的神经元前体细胞群体，也可发展为髓母细胞瘤。这些细胞高表达VI型中间丝蛋白Nestin，被称为NEPs9。NEPs位于EGL的深层，在新生期小脑发育过程中短暂存在。与GNPs一样，NEPs也承诺进入颗粒细胞谱系，但它们处于静息状态，且不表达Math1——这是传统GNPs的一个明确标志物10。此外，在Shh信号通路激活后，NEPs比GNPs更高效地产生髓母细胞瘤9，这使其成为髓母细胞瘤发生的一种新起源。
我们此前通过本文所述的显微解剖技术，在出生后第4天（P4）从小脑外颗粒层（EGL）分离出了神经上皮前体细胞（NEPs）9。通过显微镜直接观察组织进行显微解剖，可特异性地分离小脑EGL。这一步骤至关重要，因为Nestin也在小脑白质中的神经干细胞（NSCs）以及分子层中的伯格曼胶质细胞（Bergmann glia）中表达1,7,11,12，必须避免这些细胞的混入，否则将干扰后续分析。从显微解剖组织中分离得到的细胞可立即用于分子分析，也可进行培养以用于后续实验应用。
为了特异性地显微解剖外颗粒层（EGL）并进一步纯化神经上皮前体细胞（NEPs），将Math1-GFP（绿色荧光蛋白）小鼠与Nestin-CFP（青色荧光蛋白）小鼠杂交。转录因子Math1在颗粒神经元前体细胞（GNPs）中特异性表达，GFP的表达在外颗粒层中清晰可见9,13。Nestin-CFP小鼠表达一种核定位的CFP，在分子层中易于观察9,14。GFP与CFP的共同表达为外颗粒层的显微解剖提供了明确的边界（见图1）。随后，对解剖获得的EGL组织进行酶解离，再通过流式细胞分选（FACS）分离出CFP阳性的NEPs。
目前，从外颗粒层（EGL）中分离细胞最常用的方法是使用Percoll梯度离心法处理整个小脑组织15,16。然而，该方法无法完全排除分子层和白质中的Nestin+细胞群体，因此不能用于神经上皮前体细胞（NEPs）的研究。激光显微切割技术通过激光能量转移来获取特定细胞，是另一种用于从异质组织中分离特定细胞的方法17,18，但所捕获的细胞仅可用于DNA、RNA和蛋白质的提取，无法进行培养。
本方案提供了一种从外颗粒层（EGL）中特异性分离活的、纯的神经上皮前体细胞（NEPs）群体的方法。该技术也可应用于具有可识别解剖结构或荧光标记细胞/区域的不同组织类型。因此，将这种新型显微解剖技术整合到细胞分离方案中的主要优势在于，能够从特定组织区域分离细胞，从而消除邻近组织的污染，并可立即收集细胞用于分析，或进行培养以用于其他应用。

<table><tbody><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>超纯低熔点琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr></tbody></table>

通过显微解剖法从发育中的小脑分离不同细胞群体

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

显微解剖是一种新型技术，可分离组织中的特定区域，并消除邻近区域细胞来源的污染。该方法首次应用于研究表达Nestin的前体细胞（NEPs），即小脑外颗粒层（EGL）中新发现的一类细胞群体。通过将显微解剖与荧光激活细胞分选（FACS）相结合，研究人员能够从EGL中传统的颗粒神经元前体细胞以及其他小脑内污染性的表达Nestin的细胞中，单独获取纯化的NEPs细胞群。若不采用显微解剖技术，利用现有方法（如Percoll梯度离心和激光捕获显微切割）将无法实现对NEPs的功能性分析。该技术还可应用于含有可识别区域或荧光标记细胞的多种组织。尤为重要的是，这种显微解剖技术的主要优势在于所分离的细胞具有活性，可进行体外培养以用于后续实验，而这一点是目前其他已描述方法所无法实现的。

如图1A所示，小脑切片取自出生后第4天（P4）的Math1-GFP/Nestin-CFP小鼠，其中小脑外颗粒层（EGL）主要由表达GFP的颗粒神经前体细胞（GNPs）构成，而分子层则富含CFP阳性的胶质细胞。为了分离位于EGL深层的神经上皮前体细胞（NEPs），在EGL与分子层之间进行显微解剖（沿虚线；图1A）。解剖获得的EGL组织（图1B）随后被收集，进行酶消化处理，继而进行流式细胞分选（FACS）。
正如预期，分离出的外颗粒层中大部分细胞（超过85%）为常规颗粒神经前体细胞（GNPs），这些细胞GFP呈阳性（图 2A）。根据FACS分析，NEPs（CFP+）仅占EGL细胞群体的约5%。几乎未见GFP与CFP双阳性细胞。通过FACS分选的CFP+细胞被分离后进行培养 体外 以检测其分化潜能。如图所示 图2B培养4天后，NEPs仅生成β-tubulin+神经元，...

表达巢蛋白的&#160;前体细胞是发育中小脑中一种新近发现的神经前体细胞群体。结合本文所述的显微解剖技术与荧光激活细胞分选，可有效分离该细胞群体，且不混杂其他小脑区域的污染细胞，进而可用于培养以开展后续研究。

显微解剖是一种新型技术，可分离组织的特定区域，并消除邻近区域细胞来源的污染。

本实验的总体目标是从发育中的小脑中分离出特定的细胞群体。首先获取携带荧光蛋白的新生小鼠的小脑组织，以完成组织的采集；实验的第二步是使用振动切片机获得活体组织切片。第三步是在荧光解剖显微镜下显微解剖小脑的外颗粒层。最后的步骤是将组织解离为单细胞悬液，并通过荧光激活细胞分选法收集细胞。最终结果表明，可从小脑中分离出特定的细胞群体。与现有方法（如激光捕获显微切割）相比，该技术的主要优势在于细胞保持活性，可进行培养，适用于进一步实验。对于本实验步骤，需使用高压灭菌器对手术器械进行灭菌处理。准备新鲜或重新加热的3%低熔点琼脂糖，置于37摄氏度水浴中备用。配制木瓜蛋白酶为基础的细胞解离所需溶液。新鲜配制NBB 27培养基，过滤除菌后置于培养箱中保存。配制传真缓冲液并准备多聚赖氨酸盖玻片。首先，用每毫升无菌水中含100微克多聚赖氨酸的溶液包被经高压灭菌的盖玻片。然后在37摄氏度孵育盖玻片2小时，或在室温下过夜孵育。随后，使用盖玻片前，先用蒸馏水清洗，再用 NBB 27 培养基冲洗。彻底干燥，此过程至少需要一小时才能开始后续操作。首先准备解剖区域。用70%乙醇擦拭清洁，然后铺上吸水垫。第二步，从灭菌袋中取出器械并摆放至便于使用的位置。第三步，将含有1% pen strip的冰上预冷的无菌DPBS加入培养皿中，并置于冰上。解剖出一只表达荧光标记物的P4幼鼠的大脑。然后将其转移至预先准备好的DPBS培养皿中。使用镊子小心地将小脑与脑的其余部分分离。这些小脑表达math one、GFP以及nestin CFP标记物，其中外颗粒层表达GFP，分子层对CFP呈阳性。接下来，用琼脂溶液填充一个2立方厘米的包埋模具。确保溶液温度不超过37摄氏度。用带孔的勺子取出小脑，并用纸巾轻轻蘸干。然后使用镊子将其放入模具中。用针将小脑调整为垂直方向。当模具中装入约四个样本时。将模具置于冰上，使其迅速凝固。使用剃刀刀片修整组织块，以减少切片时间。然后将组织块粘附到载板上，调整方向使小脑垂直。将装有冰冻 DPBS（含 1% pent strap）的填充托盘置于冰上，以保持低温。使用振动切片机对组织块进行切片，切取并收集 600 微米的切片。使用带孔的勺子将它们从冰盘中取出，并转移至置于冰上的含 A-D-P-B-S 的培养皿中。在荧光解剖显微镜下，尽快检查切片。小心地将外颗粒层（EGL）从其余的小脑切片部分分离。使用精细镊子在CFP阳性的分子层与GFP阳性的EGL之间进行解剖。在显微解剖过程中务必谨慎，避免邻近区域的污染。将GFP阳性的外颗粒层组织转移至一个新的盛有DPBS并置于冰上的培养皿中。避免带入任何分子层组织，以免污染表达巢蛋白的伯格曼胶质细胞。接着，去除围绕分离的外颗粒层组织的软脑膜。现在可以使用基于paan的方案解离EGL，以获得单细胞悬液。完成后，将细胞重悬于fax缓冲液中。随后使用fax收集CFP细胞。使用高速流式细胞仪和CFP滤光片进行分选，并将细胞收集到预冷的fax缓冲液中。每只P4小脑可获得约100,000个NPS。随后将合并的细胞在300 G下离心5分钟。立即使用细胞进行培养复苏。将细胞悬浮于预热的NBB 27培养基中，然后接种到聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上。从小脑P4 Math1 GFP嵌合CFP小鼠中制备了小脑切片。小脑外颗粒层（EGL）主要包含表达GFP的颗粒神经元前体细胞（GMPs），可轻松与富含表达CFP的胶质细胞的分子层分离。流式细胞分析显示，EGL中超过85%的细胞为典型的颗粒神经元前体细胞（GNPs）。通过显微解剖从EGL深层分离出神经上皮前体细胞（NEPs），随后进行流式分析。这些细胞在培养四天后约占颗粒层外层（EGL）细胞的5%。分离得到的NPS可分化为表达β微管蛋白的神经元，这是谱系受限的神经前体细胞的特征。进行此操作时，重要的是要记住快速操作，并尽可能将组织置于冰上。

isolation-distinct-cell-populations-from-developing-cerebellum

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

从开发小脑显微切割分离的不同的细胞群

本文介绍了一种从出生后小鼠中分离并培养小脑颗粒神经元前体细胞及小脑颗粒神经元的方法。...

出生后小鼠小脑颗粒神经元前体细胞及神经元的分离与培养

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本视频展示了一种从出生后小鼠小脑中分离干细胞并将其分化为神经细胞的方法。利用抗体包被的磁珠从分离的细胞悬液中纯化干细胞，并进行培养以形成神经球。随后将神经球维持在分化培养基中，以诱导生成神经细胞。...

从小鼠出生后小脑中分离干细胞并诱导其分化为神经细胞

成功研究小胶质细胞生物学的一个关键在于，从小胶质细胞从中枢神经系统组织中分离的过程中，保持其免疫功能的 ex vivo 状态。通过旋转振荡法分离小胶质细胞，可获得高纯度且具有免疫功能的细胞培养物，这一点在使用促炎刺激物脂多糖（LPS）和 Pam3CSK4（Pam）激活小胶质细胞后，通过荧光成像、免疫细胞化学和 ELISA...

从新生小鼠中分离保留免疫表型和功能的皮层小胶质细胞

小脑外颗粒层是发育中大脑内发生最大规模过渡性扩增的部位。本文介绍了一种在增殖高峰期靶向该层进行遗传修饰的实验方案 离体...

离体 培养鸡小脑切片及颗粒细胞前体的靶向电穿孔

本文介绍了一种从小鼠小脑制备脑片器官型培养物的方法，并通过免疫组织化学染色显示髓鞘，适用于研究中枢神经系统中髓鞘形成及再髓鞘化的机制。...

制备及髓鞘化器官型小脑切片培养物的免疫染色

尽可能充分地在体外实验中模拟体内条件并非易事。使用原代细胞培养是理解完整生物体中细胞生物学的重要一步。本方案详细介绍了如何成功培养和培育小鼠胚胎小脑神经元。...

从小鼠胚胎小脑分离神经元的原代培养

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

本文介绍了一种从小鼠中枢神经系统体外分离多种胶质细胞群体的实验方案。该方法可分离出不同区域的小胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞以及星形胶质细胞，以便在多种培养体系中分别研究各类细胞的表型特征。...

从小鼠中枢神经系统多个区域分离和提取胶质细胞

不同的小脑区域被认为在特定行为输出中发挥重要作用，但其潜在的分子机制仍不清楚。本研究描述了一种可重复且快速分离小脑半球皮层、蚓部前部和后部区域以及小脑深部核团的方法，以便通过分离RNA并检测基因表达差异，探究这些区域间的分子差异。...

小脑区域解剖用于分子分析

此处，我们展示一种可重复的 体外...

一种高效且经济的电穿孔方法用于研究颗粒细胞前体中依赖初级纤毛的信号通路

学习利用显微切割和荧光激活细胞分选技术，从新生小鼠发育中的小脑分离巢蛋白阳性神经前体细胞。该方法可获得高纯度活细胞用于体外培养，为研究小脑发育和神经元分化提供可靠实验基础。

通过显微解剖法从发育中的小脑分离不同细胞群体

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