多光子细胞内钠成像结合谷氨酸海马CA1锥体神经元的UV-介导的焦点解笼锁

该程序的总体目标是唤起和分析小细胞区室中的钠动力学，例如完整组织中中枢神经元的棘和树突。这是通过首先制备急性小鼠海马切片，通过贴片移液管用钠敏感荧光染料 SBFI 加载锥体神经元，并使用多光子激发可视化细胞形态来实现的。下一步是为实验选择多刺树突，并在靠近该树突的地方注入光活化化合物，例如笼状谷氨酸。

然后使用紫外激光将紫外闪光应用于 Foley 解笼谷氨酸，紫外激光已精确定位，以靶向靠近所选树突的小体积。最后一步是监测树突中 SBFI 荧光的变化，并监测相邻棘中钠的变化。还记录了伴随的膜电流。

最终，使用适当的药理学工具（如受体阻滞剂）将能够研究产生诱发细胞内钠信号的机制。该方法为研究小细胞区室和完整脑组织中的细胞内钠信号提供了可靠的工具。在这里，我们将全细胞膜片钳和多光子钠成像与改进的紫外光诱导解笼程序相结合。

With 使我们能够监测神经活性化合物的精确和局部应用时的细胞反应。该程序将由 Karl KA 和我实验室的研究生 Kaan Kleinhans 演示。要开始解剖组织，请立即将大脑放入装有冰冷解剖、人工脑脊髓液或 A CSF 的培养皿中，然后通过沿中线进行矢状切割来解剖半球。

在所需方向上执行第二次切割作为阻挡曲面。然后用强力胶将其连接到振动器的切割台上。将 vibram 的切割室和冷却元件从冰箱中取出后，将带有大脑切片的切割台放在腔室中。

然后将冷却元件放入腔室中，将组织浸入冰冷的解剖 A CSF 中。接下来切割 250 微米厚。海马体的矢状旁切片与一个 viome。

确保 CS 流体始终处于鼓泡状态。切片后，将组织放在装有正常 A CSF 的烧杯中的网眼上，并在 34 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育后，将组织保持在室温下。

此实验应在黑暗环境中进行，但为了拍摄目的，此处在昏暗的光线条件下显示。要首先准备硬件，请打开多光子系统的组件并按照文本协议中的说明调整红外激光束对准。然后通过更改 pcal 单元和光电倍增器的设置来调整多光子激光波长和光束强度。

接下来，通过在物镜下放置荧光样品载玻片来打开并校准解笼系统。启动解笼装置控制软件的校准程序。通过单击 UV 激光点，将 UV 激光器设置到其扫描范围内的几个点，同时使用 CCD 相机捕获荧光。

在每个点上，调整电流扫描镜的位置以对应于软件中的某个坐标。通过解笼和成像计算机之间的网络连接导入成像系统的图像，可以实现解笼点的准确定位。使用屏幕抓取软件不断读出成像软件的帧并调整成像。

在完成锁定帧后，将每 10 帧作为参考图像从成像软件中一致导出到闪光灯装置中，以确保在整个实验过程中进行适当调整。接下来，打开微纵器电生理组件和压力施加装置，将笼状化合物输送到目标区域。使用火焰抛光硼硅酸盐玻璃毛细管进行全细胞膜片钳和局部富集的拉动移液器。

然后将切片放入实验浴中并用网格固定，将浴槽放在显微镜载物台上，并用 A CSF 永久灌注切片。通过将细胞内溶液或含有 SBFI 的 ICS 加载到膜片移液管中开始全细胞膜片钳，然后用笼状化合物加载局部灌注移液管。将移液器连接到相应的微型纵器上，并将参比电极放入浴中。

选择位于切片表面以下 30 至 70 微米处的胞体的 CA 单锥体细胞，以确保细胞形态完整以及解笼光束的低散射和衰减。使用采用 IR DIC 视频显微镜的膜片移液器接近该细胞。轻轻抽吸，直到获得千兆密封。

补偿快速容量。然后打破膜并打开细胞以获得细胞配置。最后，在电流钳模式下评估细胞活力。

注入去极化电流并检查产生的尖峰活动以进行成像和刺激。首先，将 tetro DOIND 添加到 A CSF 中，以防止电压门控钠通道的激活和动作电位的产生。使用多光子激发和产生的 SBFI 荧光可视化细胞形态。

为实验选择多刺树突。以更高分辨率放大图像，并在树突周围放置一个剪辑框。然后将装有笼状化合物的移液器放在树突附近。

放置移液器以允许所选树突的有效局部灌注。调整解笼激光器，将解笼点定位在靠近目标结构的位置。接下来，使用成像软件在选定的树突和相邻棘上设置感兴趣的区域。

接近感兴趣区域，然后通过触发信号用低压起始膜片、夹具和荧光记录注入笼状化合物几秒钟。在笼状化合物局部富集期间，激发光束完全变暗以防止漂白。接下来，停止笼中化合物的局部泛滥。

然后增加双光子激光的强度以实现 SBFI 的高效激发，并应用紫外闪光在笼子上初始化，监测 SBFI 荧光的变化以及体细胞电流的变化，在 SBFI 荧光恢复到基线后继续停止记录。要获得形态学，请记录为执行测量设置的剪辑盒区域的 XY、Z 堆栈。确保此堆栈在空间上进行过采样，以实现最佳图像反卷积并提高图像质量和分辨率。

通过膜片移液管用 SBFI 加载神经元，通过在笼状谷氨酸局部灌注后采用多光子激发，实现了整个细胞的可视化，包括细小的树突和相邻的棘。在树突附近应用紫外线闪光导致 SBFI 的荧光发射瞬时降低，反映出细胞内钠浓度的增加。同时，在 SOMA 应用中记录了紫外线闪光对切片的向内电流，这些切片尚未用笼状谷氨酸预灌注。

从未引起 SBFI 荧光或向内电流的变化，表明这些信号是由于谷氨酸的解笼造成的。在靠近解笼点的棘中，峰值振幅略高，而更多棘的模式类似于母树突。使用钠渗透性离子型谷氨酸受体的选择性阻滞剂研究钠进入树突和刺响应谷氨酸解笼的途径，谷氨酸诱导的细胞内钠信号，并且在这些阻滞剂存在下省略了引发的体细胞电流。

在阻断剂清除后，信号重新获得，表明谷氨酸的解笼激活 ca one 锥体神经元上的嗜细胞性谷氨酸受体，导致细胞内钠瞬时和内向电流。在尝试此过程时，请务必记住为红外激光选择尽可能低的强度，以尽量减少对制备物的任何损坏。观看此视频后，您应该对我们研究细胞微遗骸中钠信号传导的实验方法的关键步骤有一个很好的了解一旦掌握，该技术就可以对完整组织中活动诱发的细胞内离子信号进行高分辨率成像，从而摆脱其他技术引入的运动伪影。