Name: 多光子细胞内钠成像结合谷氨酸海马CA1锥体神经元的UV-介导的焦点解笼锁 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学习多光子钠成像结合UV解笼锁技术，用于研究海马CA1锥体神经元树突和棘突中的钠离子动态变化。该方法为神经科学研究提供了可靠的细胞内信号检测工具。

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本研究由德国科学基金会（DFG, Ro2327/6-1）向 C.R.R. 提供的资助支持。作者谨此感谢 S. Durry 和 C. Roderigo 提供出色的技术协助，以及 M. Dübbert（德国科隆大学动物学研究所电子实验室）在实现Pockels盒控制器和高频开关方面的帮助。

本研究严格遵循德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学的机构指南以及欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）。所有实验均已向德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学动物护理与使用机构的动物福利办公室通报并获得批准（机构批准编号：O52/05）。根据德国《动物福利法》（Tierschutzgesetz，第4条和第7条），死后脑组织的摘除无需额外的正式审批。
制备急性脑片时，小鼠通过CO2麻醉后迅速断头处死（遵循欧洲委员会发布的《实验动物安乐死》建议，卢森堡：欧洲共同体官方出版局，1997年；ISBN 92–827-9694-9）。
1. 溶液的配制
<ol>
	<li>制备用于解剖的人工脑脊液（ACSF），其成分（单位：mM）如下：125 NaCl，2.5 KCl，0.5 CaCl₂，1.25 NaH₂PO₄，26 NaHCO₃，10 葡萄糖，3.1 蔗糖2，6 MgCl2，1.25 NaH2PO4，26 NaHCO₃3，以及20葡萄糖，用95% O₂充气2 和5% CO2，pH 值为 7.4。</li>
	<li>制备用于实验的ACSF溶液，其成分（单位：mM）如下：125 NaCl，2.5 KCl，2 CaCl₂2，1 MgCl2，1.25 NaH2PO4，26 NaHCO₃3，以及20葡萄糖，用95% O₂充气2 和5% CO2，使pH值维持在7.4。</li>
	<li>配制细胞内液（ICS），其成分（单位：mM）如下：150 KMeSO3，12.5 羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），40 KCl，5 NaCl，1.25 乙二醇四乙酸（EGTA），5 Mg-ATP，0.5 Na-GTP。调节 pH 至 7.3。将 1 ml 分装后于 -20 °C.</li>
	<li>将钠结合型苯并呋喃间苯二甲酸盐（SBFI）溶于重蒸水中稀释，并分装成等份 5 µl 10 mM 储存液</li>
	<li>解冻 ICS，并加入 SBFI 储存液，使其终浓度为 1 mM。涡旋混匀后进行微孔滤膜过滤（0.22 µm）。保持在 4 °C 实验前保持冷冻，禁止反复冻融，且仅限当日使用。</li>
	<li>配制50 mM MNI谷氨酸储备液：将化合物溶于双蒸水中。用正常人工脑脊液（ACSF）将MNI谷氨酸储备液稀释至终浓度为5 mM。保存于 4 °C 直至实验使用。请勿再次冻存，且仅限当日使用。未立即用于实验的分装样品应保存在 -20 °C.</li>
</ol>
2. 组织解剖
注意：啮齿类动物脑急性海马脑片的制备方法此前已有详细描述13,14。简言之，本研究采用了以下实验方案。
<ol>
	<li>断头后，迅速将脑组织从颅骨中取出。</li>
	<li>立即将脑组织放入含有冰冻解剖用人工脑脊液（ACSF）的培养皿中，并沿中线进行矢状切面分离出半脑。</li>
	<li>按照所需方向进行第二次切割以形成固定面，然后使用超级胶水将该面固定在振动切片机的切片台上。</li>
	<li>从冰箱中取出振动切片机的切削室和冷却元件（均保持在 -20 °C），将带有脑组织的切片台放入切削室内，随后将冷却元件置入切削室，并将组织浸入冰冻解剖用 ACSF 中。为稳定标本，可用琼脂凝胶对组织块进行对侧支撑。</li>
	<li>使用振动切片机切割厚度为 250 µm 的海马旁矢状切片。确保所有 ACSF 始终处于持续通气状态。</li>
	<li>切片完成后，将组织置于盛有正常 ACSF 的烧杯中的网状支架上，在 34 °C 下孵育 30 分钟，随后置于室温下保存。</li>
</ol>
3. 硬件准备
<img alt="用于光学激发和光谱分析的激光显微镜装置示意图，配备集成的光电倍增管（PMT）" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 多光子成像、激光扫描紫外闪光解笼以及电生理实验装置的光路与实验控制示意图。 多光子光束（红色）由脉冲式可调谐红外（IR）激光器（TiSa）产生。该光束依次通过机械快门、普克尔斯盒（Pockels’ cell）和红外探测器（用于检测光束强度），这些组件共同实现对激光功率及其照射时间的控制。可翻转进出的可选激光二极管用于激光光束的基本对准。当与后焦平面极宽的物镜配合使用时，可启用扩束镜。远程控制的中性密度（ND）滤光轮可用于进一步调节或替代普克尔斯盒以控制激光光束功率。脉冲红外光在通过扫描头后被引导至样品。发射的荧光信号（浅绿色）由外部或内部的光电倍增管探测器（PMT）收集。外部探测器通过高频开关（PMT控制器）与内部PMT完全同步。解笼光束（浅蓝色）由紫外固态激光器（DPSS UV-Laser）产生，随后通过导光装置被引导至落射荧光聚光镜顶部后方的由检流计驱动的扫描单元。通过成像软件导出的图像，可实现对解笼光斑或区域的精确定位（校正成像光束与解笼光束之间的色差）。成像、电生理记录与闪光解笼之间的时序控制由电子系统统一管理。透射照明探测器（TL-PMT）用于记录微电极在组织中的位置。经改装的成像系统的控制单元和软件用于控制并同步运行该系统所需的所有其他设备。标注为“custom”的系统组件由作者自行设计、构建或改装；部分组件为满足自行搭建的多光子系统的需求而进行了调整，标注为“modified”。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>开启多光子系统的各个组件。测试并调整红外激光束的准直。
	<ol>
		<li>通过将中心棱镜翻转至物镜位置来控制光束定位。如果光束位置偏移，需通过潜望镜中的反射镜重新调整。注意，在成像时，中心棱镜的中心平面必须与物镜的后焦平面处于同一水平。</li>
		<li>开启光谱仪，并检测光束的多光子特性。</li>
		<li>将成像软件的参数设置为以下数值：选择512 × 512像素的帧尺寸用于细胞的概览图像（对于高帧率和高空间分辨率，可使用较小的裁剪框，分别设置2.5倍的放大倍数）。将成像速度设为快速模式，扫描模式设为XYT。Z轴步进应设为1 µm以用于概览图像堆栈，0.2 µm用于详细图像堆栈，以满足后续去卷积处理的空间采样要求。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过调节Pockels盒的设置来调整多光子激光束（790 nm）的强度（物镜下的最终功率：≈ 14 - 16 µW），并调节光电倍增管（PMTs）的参数。</li>
	<li>开启解笼系统，并通过将荧光样品载玻片置于物镜下进行校准。
	<ol>
		<li>使用双目镜，调整紫外光学系统的焦点，并利用UGA扫描头上的聚焦单元将紫外激光光斑的空间范围限制在最大直径2 µm以内。</li>
		<li>启动解笼单元控制软件的校准程序。
		<ol>
			<li>将紫外激光设置在其扫描范围内的多个点位，同时用CCD相机捕获荧光信号。通过在每个点位点击紫外激光光斑，调整伺服扫描镜的位置，使其与软件中的特定坐标相对应。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="显示近红外激发和发射、光纤、二向色镜的共聚焦显微镜示意图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 详细示意图，展示激发、发射和解笼光路的特性。红外激发光束（红色）穿过位于显微镜落射荧光聚光镜滤光轮位置的合束二向色镜，经物镜到达样品。解笼光束（蓝色）通过石英光纤传输至准直与聚焦单元，随后导入扫描单元中的扫描镜，再经过一个二向色镜到达合束二向色镜，与激发扫描光束合并。样品发出的荧光沿激发扫描光束路径反向传输至成像扫描头。相机用于对膜片钳移液管进行视觉监控，并结合共聚焦激光扫描显微镜（未示出）实现解笼光束的定位。绿色光路代表可选的落射荧光照明，可用于其他应用。
<ol start="3">
	<li>
	<ol start="2">
		<li>
		<ol start="2">
			<li>使用闪光光解系统在点模式下进行局部施加。确保解笼光束的焦点调节（物镜下方的平均功率：0.55 mW）在与组织切片所处 z 平面相对应的荧光载玻片上呈现为直径 1.5 µm（xy 方向扩展）的光斑（未显示）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过在解笼计算机与成像计算机之间建立网络连接，导入成像系统的图像，从而实现解笼光斑的精确定位。
		<ol>
			<li>使用屏幕捕获软件，持续读取成像软件的帧画面（而非相机直接信号），并使成像画面与解笼画面保持一致。从成像软件中每第 10th 帧导出一幅参考图像至闪光单元，以确保整个实验过程中校准的准确性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于神经元成像分析的激光扫描显微镜软件界面，神经元通路示意图。" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig3highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 解笼光斑位置的调整： 为精确定位解笼光斑，需将成像软件的截图（黄色框）导入解笼软件界面（绿色框）。黄色框内的左侧图像代表整个CA1区锥体细胞的Hi-Lo编码图像（蓝色：黑色像素，红色：饱和像素）。该图像上叠加了解笼软件的校准网格（绿色“X”标记）。右侧显示的是细胞局部放大图像，并叠加了解笼光斑（红色十字）。黄色光斑为解笼光束自动叠加的图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>打开显微操作器、电生理组件以及用于向目标区域递送笼锁化合物的压力施加装置。</li>
	<li>安装局灶性压力施加装置，以实现笼锁化合物的局部灌注。与将这些物质进行浴式灌注相比，该方法可显著降低成本。调节持握压力至当前大气压，以防止人工脑脊液（ACSF）被吸入或笼锁化合物从施加移液管中泄漏。 
	注意：压力施加装置在移液管夹持器中集成了一个高精度且超快速的微型阀门。这使得能够使用最低限度的施加压力，从而在使用笼锁化合物进行局部灌注时将运动伪影降至最低。</li>
	<li>使用经火焰抛光的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制用于全细胞膜片钳和局部灌注的移液管。移液管尖端直径应约为 1 µm，电阻约为 R ≈ 3 MΩ（使用基于 K-MeSO3 的细胞内液测定）。</li>
	<li>将脑片置于实验浴槽中，并用网格固定（由厚度为 250 µm 的铂金框架和直径 40 µm 的外科缝合丝线编织而成）（图 4A, B）。使用倒置的、尖端断裂并经火焰抛光的巴斯德移液管（在断裂尖端一侧连接吸球）转移脑片。避免弯曲或任何其他粗暴操作。</li>
</ol>
<img alt="灌流室装置；膜片钳电极法；电生理测量；示意图；科研用途。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 实验浴槽的组成及其在显微镜载物台上的位置。 (A) 实验浴槽由浴槽本体（蓝色方框）构成，其周围环绕着一个磁性金属环。管道系统可确保人工脑脊液（ACSF）持续灌流浴槽。用于压住并固定脑片的网格被置入浴槽内。(B) 急性脑片制备物置于浴槽本体中。脑片由网格的细丝固定。(C) 实验过程中，实验浴槽在显微镜载物台上的位置与几何布局。
<ol start="8">
	<li>将浴槽置于显微镜载物台上，并持续用ACSF灌流脑片。</li>
</ol>
4. 全细胞膜片钳
<ol>
	<li>用含有SBFI的细胞内液（ICS）填充记录电极，并用笼锁化合物填充局部灌流电极。将电极分别连接至相应的显微操作器。将参考电极置于浴液中。确保始终接地，以避免对探头级放大器造成损坏（参见图4C）。</li>
	<li>将两根电极均放入浴液中，并移至海马CA1区上方。对记录电极施加轻微正压（+40 mbar），以防止ACSF稀释细胞内液。</li>
	<li>使用电生理软件补偿记录电极的偏移电位。</li>
	<li>利用红外微分干涉差（IR-DIC）视频显微镜，将记录电极移向CA1区锥体细胞。施加轻柔负压，直至形成吉欧封接（Giga-seal）。选择胞体位于脑片表面下30–70 µm的细胞，以确保细胞形态完整，同时减少解笼光束的散射和衰减。</li>
	<li>补偿快速电容。施加额外负压击穿膜片，进入全细胞记录模式。</li>
	<li>补偿慢速电容和串联电阻。</li>
	<li>在开始成像实验前，至少让细胞与含SBFI的细胞内液透析30分钟。</li>
</ol>
5. 多光子成像与刺激
<img alt="双光子成像与电生理学时间线示意图；局部灌注，化合物施加。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig5highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 实验方案。 实验开始时，设置一个触发脉冲（以红色符号 (ᴨ) 和红线表示），在 0 秒时间点同时启动成像（蓝色）、电生理记录（绿色）以及笼锁化合物的施加（黄色）。在第一阶段期间，成像光束应完全调暗（浅蓝色）。4.5 秒后（虚线处），停止对笼锁化合物的局部灌注，并将成像光束调整至工作强度以进行数据采集（蓝色）。此后 1.5 秒（即 6 秒时间点），给予第二个触发脉冲（以红色符号 (ᴨ) 和红线表示），该脉冲启动紫外闪光装置（闪光持续时间为 300 毫秒；由黄色闪光表示），并在电生理和成像记录中设置标记。
<ol>
	<li>在人工脑脊液（ACSF）中加入河豚毒素（TTX，500 nM），以阻止电压门控钠通道的激活和动作电位的产生。</li>
	<li>利用多光子激发及由此产生的SBFI荧光观察细胞形态，并选择一根有棘的树突进行实验。放大图像以获得更高分辨率，并在树突周围放置一个剪辑框。</li>
	<li>用含有笼锁型谷氨酸的10 µl ACSF填充标准膜片电极。将电极连接至压力施加系统，并固定到显微操作器上。</li>
	<li>将装有笼锁化合物的电极置于树突附近（约30 µm处）。调整电极位置，以便有效地对目标树突进行局部灌注。调节解笼激光：将解笼光斑定位在目标结构附近（约1 - 2 µm）。</li>
	<li>使用成像软件在选定的树突及其相邻树突棘上设置感兴趣区域。</li>
	<li>接近感兴趣区域，通过低压力（&lt;3 PSI）局部注射笼锁化合物数秒。通过触发信号启动膜片钳记录和荧光记录（在790 nm多光子激发下）。 
	注意：在局部灌注笼锁化合物期间，激发光束完全关闭，以防止荧光漂白。</li>
	<li>停止笼锁化合物的局部灌注。提高双光子激光强度，以有效激发SBFI，并施加紫外闪光以启动解笼（解笼持续时间为300毫秒）。</li>
	<li>监测SBFI荧光的变化。待SBFI荧光恢复至基线水平后，停止记录。</li>
</ol>
6. 药理学
<ol>
	<li>为了检测离子型谷氨酸受体是否参与由紫外闪光光解笼锁谷氨酸所诱发的电流和/或钠信号的产生，使用受体阻断剂。
	<ol>
		<li>更换为含有AMPA受体阻断剂氰基硝基喹喔啉二酮（CNQX，10 µM）和NMDA受体阻断剂氨基磷酰基戊酸（APV，50 µM）以及TTX（见上文）的人工脑脊液（ACSF），并对脑片灌流至少10分钟。</li>
		<li>重复刺激程序（见5.4和5.5）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抑制剂作用的可逆性
	<ol>
		<li>换回仅含TTX的正常ACSF。</li>
		<li>灌流脑片20分钟。</li>
		<li>重复刺激程序（见5.4和5.5）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 形态学
<ol>
	<li>记录用于执行测量的剪辑框区域的XYZ堆栈图像。确保该堆栈在空间上过采样（至少0.2 µm/像素），以实现最佳的图像去卷积，并提高图像质量和分辨率。</li>
	<li>记录整个细胞的XYZ堆栈图像，以评估细胞形态。</li>
	<li>运行去卷积算法。</li>
</ol>

<ol><li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+Na%2B+imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pflueg.+Arch.%2C+Eur.+J.+Phy%22%5BJournal%5D)">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li>
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<li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+new+fluorescent+Na%2B+indicator+CoroNa+Green%3A+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。本研究的开放获取出版得到了德国韦德尔的Rapp OptoElectronic公司的资助，该公司生产了本视频文章中使用的仪器。该公司未参与实验、数据处理或稿件撰写。

本研究表明，SBFI 非常适用于小细胞区室中细胞内钠离子瞬变的双光子成像。然而必须注意，SBFI 的量子效率相对较低15，且在生理活动下钠离子浓度的相对变化较小。因此，对细小结构中的 Na+ 瞬变进行高分辨率测量是一项相对繁琐的工作，可能需要对多次实验结果进行像素合并或平均处理，才能获得满意的信号。此外，钠离子瞬变的动力学过程出人意料地缓慢，因而必须进行长时间的记录。该观察结果与早期研究一致，此前研究中已发现神经元树突和星形胶质细胞中钠离子瞬变的单指数衰减在室温下具有较大的衰减时间常数，约为 10 秒量级1,2,6。因此，与钙离子瞬变相比，钠离子瞬变似乎具有更缓慢的时间进程和更大的衰减时间常数16。
尽管存在这些局限性，钠离子成像仍是研究神经元亚区域生理特性的有力工具。例如，钠离子成像可用于监测活性突触处或其附近的兴奋性突触活动。由于钠离子基本不被缓冲8,17，活动诱导的钠瞬变与广泛范围内的突触谷氨酸释放或外源施加的谷氨酸呈线性关系。因此，它们是神经元谷氨酸能活动的直接且无偏倚的指标。此外，钠离子指示剂染料具有较高的解离常数Kd（SBFI的Kd约为25 mM1）。即使在为达到足够亮度而使用的相对较高的细胞内染料浓度下（通常为0.5 - 1 mM），较高的Kd值也意味着这些染料本身不会充当钠离子的缓冲剂。因此，它们不会扭曲钠瞬变的幅度或时间进程，而这一点在将钙敏感染料引入细胞时始终是一个担忧18。因此可以认为，所检测到的信号能够较好地反映细胞内钠离子“真实”变化的程度。其缓慢的时间进程进一步表明，钠离子在神经元内的扩散速度远小于此前假设的水平19。
成功开展研究兴奋性突触传递特性及树突棘和树突中钠离子内流途径的实验，其关键要求是对突触后结构实现快速且高度局部化的激活。这一目标可通过在树突棘或树突附近快速、局部地施加谷氨酸或谷氨酸受体激动剂来实现，具体方法为利用光解笼锁化合物技术（flash photolysis of caged compounds）。该技术不会对组织造成机械损伤，无运动伪影，且已被广泛应用于相关科学问题的研究。例如 局部钙信号）。在xy平面上，解笼斑点的直径为1.5 µm。在靠近多棘树突的位置进行解笼可诱导棘突及主树突均产生钠信号。尽管靠近解笼位置的棘突信号幅度往往最大，但主树突及更远位置的棘突信号幅度仍与解笼点附近区域的信号幅度较为相似。解笼持续时间为300毫秒，在此期间内向电流幅度增加。在相同时间段内，解笼释放的谷氨酸可能在组织中发生扩散，激活远离解笼点的树突区域及棘突上的离子型谷氨酸受体，引起钠离子内流。
使用紫外激光对通过细胞灌流液施加的笼锁化合物进行光解时，存在一个固有的问题，即“内滤效应”。由于笼锁基团对紫外光具有高吸收率，从物镜到刺激位点的光路中紫外光会显著衰减20,21。一种可行的避免方法是仅在刺激位点局部灌流笼锁化合物，这还能将所需笼锁化合物的用量降至最低。与紫外激光扫描介导的解笼相比，近红外双光子解笼22在空间上更为精确，主要原因是其在z轴方向的刺激精度更高。然而，由于常用笼锁化合物在双光子激发所用的较长波长下具有较小的截面，通常需要较高浓度的笼锁化合物或极高、可能具有光毒性的光照强度。此外，双光子解笼还需要更高的设备投入，包括额外的红外激光器以及相应的光学组件。
SBFI 和 MNI-谷氨酸的激发波长范围相同，这可能导致紫外解笼激光与 SBFI 或红外成像激光与 MNI-谷氨酸之间产生非预期的相互干扰，从而引起解笼闪光对 SBFI 的漂白和/或红外光束持续解笼谷氨酸。然而，如图6C所示，在本实验条件下，单独的紫外闪光或多光子成像均未引起此类相互影响。
与本文所述类似的紫外闪光系统已在许多其他实验室中常规使用，并且可以相对容易地整合到任何现有的多光子成像显微镜中。该系统的优势在于，可用于光解的激光束可在视野内自由定位。此外，该系统能够在实验过程中快速、自动地重新定位激光束及光解释放区域在视野中的位置。我们的改进简化并提高了脱笼位点精确定位的准确性，使得成像软件的帧画面可用于同步调整成像区域与脱笼区域。
综上所述，在中枢神经元的树突和树突棘中，结合全细胞膜片钳记录与多光子钠离子成像技术，并采用改良的紫外光诱导谷氨酸解笼方法，可在组织中实现谷氨酸受体的可靠且局灶性激活。因此，该方法可用于分析完整组织中神经元兴奋性突触传递特性及突触后钠离子信号的性质。

近年来，多光子显微技术等光学显微方法的进步使得在完整脑组织中以高空间和时间分辨率研究脑细胞的形态学与生理学参数成为可能。结合电生理学技术，这些方法现已被广泛用于分析神经元上与活动相关的电信号，以及在细小的亚细胞区室（特别是细小树突和树突棘）中伴随发生的钙信号。除了钙瞬变外，突触活动还会在树突和树突棘中诱导产生钠信号，但这类信号的特性在很大程度上仍未被充分探索。此类信号可通过细胞内钠离子浓度（[Na+]i）的双光子成像进行分析，该方法能够在长时间内在线检测[Na+]i瞬变，且不会引起明显的染料漂白或光损伤1,2。
用于[Na+]i，目前可用的化学指示剂染料仅有少数几种， 例如 CoroNa Green 或 Asante Natrium Green3,4最常用的钠离子荧光探针+ 成像所用的是钠结合苯并呋喃间苯二甲酸盐（SBFI）。它是一种比率型、紫外激发染料，类似于著名的钙敏感染料fura-2，已被用于传统的Na+ 在多种细胞类型中的成像（例如5,6）。激发染料并收集其荧光有多种不同方法。若需要高时间分辨率（即 当需要结合空间信息并具备高成像帧率时，SBFI 可使用氙弧灯或高功率发光二极管（LED）装置激发，并利用高速电荷耦合器件（CCD）相机检测其发射光7,8为了在组织深层实现最高的空间分辨率，多光子激光扫描显微镜是首选方法9SBFI的量子效率相对较低，因此需要相对较高的染料浓度（0.5 - 2 mM），并通过尖锐的微电极直接加载膜不通透形式的SBFI。10 或记录电极1.
利用SBFI，早期在啮齿类动物海马脑片上进行的研究表明，CA1锥体神经元的树突和树突棘中存在与活动相关的钠瞬变，这种现象主要由离子型NMDA受体介导的钠离子内流引起1,2。为了更详细地研究此类局部钠信号的特性，通过施加受体激动剂来特异性激活突触后受体是一种理想的方法。为了模拟突触前活动和神经递质释放，激动剂的施加应相对短暂且具有空间局限性，以实现局部刺激。然而，在完整组织中实现这一点颇具挑战性。使用尖端较细的移液管进行局部压力施加可实现高度局限的药物递送，但可能引起目标结构（例如树突或树突棘）的移动，从而妨碍高分辨率成像。神经活性物质的离子电渗施加效果则取决于其电学特性，且高电流强度可能引发细胞水平的伪迹。
克服这些障碍的一种方法是使用光激活化合物及其闪光光解技术。通常，光激活“笼锁”物质采用两种不同的原理：I）宽场闪光光解11 以及II）采用扫描模块结合激光的局部解笼技术12虽然宽场闪光光解用于激活更大的目标区域， 例如 整个细胞中，采用焦点解笼技术可特异性地刺激微小的细胞区域。本研究展示了一种结合全细胞膜片钳记录与多光子钠离子成像的技术，用于中枢神经元树突及树突棘的研究，同时结合一种改良的紫外光诱导谷氨酸解笼方法，可在组织中实现谷氨酸受体的可靠且局灶性激活。

<table><tbody><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Hilgenberg</td><td>1405059</td><td>75 × 2 mm，壁厚 0.3 mm</td></tr><tr><td>相机</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>红外微分干涉对比兼容相机</td></tr><tr><td>去卷积软件</td><td>SVI</td><td>Huygens Professional X11</td><td></td></tr><tr><td>光纤光谱仪</td><td>Ocean Optics</td><td>USB 4000</td><td>微型光纤光谱仪</td></tr><tr><td>滤膜离心管</td><td>VWR</td><td></td><td>离心过滤器，0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>成像软件</td><td>Olympus Europe</td><td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td><td></td></tr><tr><td>红外光束功率控制器</td><td>定制</td><td></td><td>激光束强度控制 + 通过普克尔斯盒在回扫时快速切换至零</td></tr><tr><td>红外激光器</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai-Tai</td><td>飞秒脉冲可调谐钛宝石激光器（710 - 990 nm）；注意</td></tr><tr><td>红外功率监测器</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Burleigh</td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>显微镜/成像系统</td><td>Olympus Europe</td><td>BX51WI/FV300</td><td>显微镜和成像系统均经过大幅改装</td></tr><tr><td>中性密度滤光轮</td><td>Newport</td><td>50Q04AV.2</td><td>紫外熔融石英，光密度 0.05 - 2.0</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>移液管拉制仪</td><td>Narishige</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>气动药物喷射系统</td><td>NPI Electronic</td><td>PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>普克尔斯盒</td><td>Conoptics</td><td>350-80 LA-BK</td><td>电光调制器，用作快速开关和功率调节</td></tr><tr><td>普克尔斯盒驱动器</td><td>Conoptics</td><td>M302-RM</td><td>高压差分放大器</td></tr><tr><td>快门</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>ALMgF&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;涂层铍铜叶片</td></tr><tr><td>快门控制器</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>快门驱动器</td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz VCM D1</td><td></td></tr><tr><td>切片机/振动切片机</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>解笼软件</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td><td></td></tr><tr><td>紫外激光器</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>连续波 DPSSL 激光器，355 nm；10 mW；注意</td></tr><tr><td>紫外激光扫描系统</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>振镜扫描系统</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化合物名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注/&lt;br /&gt;说明&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA受体拮抗剂；注意</td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>NMDA受体拮抗剂；注意</td></tr><tr><td>SBFI K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 盐</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>电压门控Na+通道抑制剂；注意</td></tr><tr><td>NMI-笼锁-L-谷氨酸</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>经紫外吸收释放笼锁谷氨酸</td></tr></tbody></table>

结合紫外光介导的谷氨酸局灶性解笼技术进行ca1锥体神经元多光子细胞内钠离子成像

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

多光子荧光显微镜技术实现了在完整组织中以高空间和时间分辨率对脑细胞形态学和生理学参数进行分析。结合电生理学技术，该方法被广泛用于研究树突及树突棘等亚细胞微区中与神经活动相关的钙信号。除了钙瞬变外，突触活动还会引发突触后钠信号，但其特性目前仍知之甚少。本文介绍了一种在中枢神经元细胞微区中联合使用全细胞膜片钳记录与多光子钠离子成像的技术方法。此外，我们还提出了一种改进的紫外光（UV）诱导谷氨酸解笼方法，可在脑组织中实现谷氨酸受体的可靠且局灶性激活。为此，我们在小鼠海马急性脑片的Cornu Ammonis 1区（CA1）锥体神经元上进行全细胞记录，通过膜片钳电极将钠离子敏感的荧光染料SBFI灌注至神经元内，利用多光子激发SBFI实现树突及其邻近树突棘的可视化。为建立紫外光诱导的局灶性解笼，我们对多个参数进行了测试和优化，包括光照强度、紫外解笼光束影响的体积、光束定位以及笼锁化合物的浓度。实验结果表明，在局部灌流笼锁型谷氨酸（MNI-谷氨酸）并进行局灶性紫外解笼后，可在树突和树突棘中诱导产生内向电流和钠瞬变信号。内向电流和钠信号的时间进程与幅度均与解笼脉冲的持续时间相关。此外，我们的结果还显示，当存在离子型谷氨酸受体阻断剂时，细胞内钠信号被完全抑制，表明这些信号是通过该通路介导的钠离子内流所引起的。综上所述，本方法为在完整脑组织中研究局灶性受体激活所诱导的细胞内钠信号提供了一种可靠的工具。

在本研究中，我们演示了一种利用钠离子依赖性荧光染料SBFI对急性小鼠海马脑片中CA1锥体神经元的细胞内钠离子动态进行多光子显微成像的实验方法。此外，我们还展示了如何将该成像技术与基于激光扫描的神经活性化合物光解笼技术相结合例如 笼锁型谷氨酸）及其对细胞微区的精确定位。
通过膜片钳电极将SBFI加载到神经元中，结合多光子激发，可实现对整个细胞（包括细小树突及邻近的树突棘）的可视化观察（图6A、B、D 和 图7A）。
<img alt="神经元信号分析；钠离子动态；电生理学图谱；MNI-谷氨酸刺激。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. 光解笼锁谷氨酸诱导的钠离子信号与突触电流。 (A) 通过膜片钳电极（PP）将SBFI载入CA1锥体神经元后的最大投影图像。方框表示B图中放大部分的区域。LP表示用于局部灌注笼锁谷氨酸的电极位置与方向。(B) 树突及其相邻树突棘的光学切片堆栈的高倍最大投影图像。光学切片堆栈经过Z轴对齐与去卷积处理。红色十字表示解笼光束的目标区域。橙色虚线勾画出用于记录荧光发射的感兴趣区域。方框表示D图中放大部分的区域。(C) 左侧：光解笼锁谷氨酸（由黄色闪光指示）诱导的钠离子信号（上排）和胞体向内电流（下排）。红线表示对实验数据的拟合结果。灰色区域表示解笼闪光（300毫秒）干扰SBFI荧光成像的时间段。右侧：在未预先灌注笼锁谷氨酸的情况下，相同的紫外闪光既未引起SBFI发射光的变化，也未引发向内电流。(D) 左侧：B图中标示区域的树突及相邻树突棘的高倍图像。旁边为同一图像的灰度反转图像。虚线表示用于记录荧光发射的感兴趣区域。红色十字表示解笼光束的定位位置。右侧：紫外闪光解笼笼锁谷氨酸诱导的钠离子瞬变信号。蓝色曲线：树突中的钠离子信号；红色曲线：解笼位点附近三个树突棘的平均反应；绿色曲线：三个远端树突棘的平均反应。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
局部灌注笼锁型谷氨酸后，在靠近树突的位置施加紫外闪光，导致SBFI的荧光发射出现短暂下降，反映细胞内钠离子浓度升高（图6C、D和图7B）。与此同时，在胞体处记录到内向电流（图6C和图7B）。延长紫外闪光持续时间会导致诱发的内向电流和钠信号幅度增加（数据未显示），表明系统处于良好的动态范围之内，且光解谷氨酸或细胞反应均未达到饱和。在未预先灌注笼锁型谷氨酸的脑片上施加相同或更长持续时间的紫外闪光，从未引发SBFI荧光变化或内向电流，说明这些信号源于谷氨酸的光解（图6C）。此外，这些结果表明，在我们的实验条件下，成像组件与光解组件之间未观察到相互干扰。钠信号也可在树突棘中检测到（图6D）。尽管我们并未尝试仅通过谷氨酸光解刺激单个树突棘，但靠近光解位点的树突棘峰值幅度往往略高，而距离较远的树突棘则表现出与主树突几乎相同的荧光变化（图6D）。
最后，我们研究了谷氨酸解笼后钠离子流入树突和树突棘的通路。为此，我们使用了CNQX和APV，它们分别是通透钠离子的AMPA型和NMDA型离子型谷氨酸受体的特异性阻断剂。我们的结果显示，在存在这些阻断剂的情况下，谷氨酸诱导的细胞内钠信号以及引发的胞体电流均被消除（图7B）。当洗脱阻断剂后，信号得以恢复。这表明谷氨酸解笼激活了CA1锥体神经元上的离子型谷氨酸受体，从而介导钠离子进入树突和树突棘，产生细胞内钠瞬变和内向电流。
<img alt="神经元活动示意图；钠信号、胞体电流分析；电生理学研究结果。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. 诱发性钠信号与内向电流的药理学特征。(A) 已填充SBFI的CA1区锥体神经元，膜片钳电极（PP）连接于胞体。 (B) 左：通过光激活树突及其附着树突棘中的笼锁型谷氨酸所引发的钠瞬变和胞体电流。 中：灌流离子型谷氨酸受体阻断剂CNQX和APV可抑制解笼所诱导的钠信号和内向电流。 右：洗脱阻断剂后，信号恢复。红线表示实验数据的拟合结果。灰色区域表示解笼闪光（300毫秒）干扰SBFI荧光成像的时间段。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们描述了一种结合局灶性紫外光诱导激活神经活性化合物、全细胞膜片钳技术以及多光子成像的方法，用于在小鼠脑急性组织切片的海马神经元树突和树突棘中检测细胞内钠离子瞬变。

结合紫外光介导的谷氨酸局灶性解笼技术进行CA1锥体神经元多光子细胞内钠离子成像

多光子荧光显微镜技术使得在完整组织中以高分辨率分析脑细胞的形态学和生理学参数成为可能

本实验的总体目标是诱发并分析完整组织中中枢神经元的树突棘和树突等小型细胞区室内的钠离子动态变化。首先制备急性小鼠海马脑片，通过膜片钳电极将对钠离子敏感的荧光染料SBFI导入锥体神经元，并利用多光子激发技术观察细胞形态。接下来选择具有树突棘的树突作为实验目标，并使用福雷氏微注射法将光激活化合物（如笼锁型谷氨酸）注入该树突附近。随后，使用已精确定位的紫外激光对Foley笼锁型谷氨酸施加紫外闪光，以靶向靠近所选树突的小体积区域。最后一步是监测树突中SBFI荧光的相应变化，以及邻近树突棘中钠离子的相应变化。同时记录伴随的膜电流。最终，使用适当的药理学工具（如受体阻断剂）将有助于研究诱发的细胞内钠信号的产生机制。该方法为在小型细胞区室及完整脑组织中研究细胞内钠信号提供了一种可靠的工具。本文中，我们结合全细胞膜片钳技术、多光子钠离子成像以及一种改良的紫外线诱导解笼锁技术流程。通过该方法可让我们监测神经活性化合物在精确且局部施加时引起的细胞反应。本实验操作将由 Karl KA 和我实验室的研究生 Kaan Kleinhans 演示。开始组织解剖时，立即将脑组织置于含有冰冻解剖用人工脑脊液（artificial cerebral spinal fluid，A CSF）的培养皿中，并沿中线进行矢状切开，分离出一侧半脑。以所需的取向进行第二次切割，形成一个阻断面。然后使用超级胶水将此样本固定在振动切片机的切削台上。从冰箱中取出振动切片机的切削室和冷却元件后，将带有脑组织切片的切削台放入切削室内。然后将冷却元件放入孵育 chamber 中，并将组织浸入冰冷的解剖 A 型人工脑脊液（CSF）中。接着使用切片机（viome）切割 hippocampus 的 250 微米厚的旁矢状面切片。确保CS液体始终处于鼓泡状态。切片后，将组织置于含有正常ACSF的烧杯中的网状物上，并在34摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，将组织置于室温下保存。该实验应在黑暗环境中进行，但为拍摄需要，此处展示时使用了微弱光照条件。首先准备硬件设备，开启多光子系统的各个组件，并按照文本方案中的描述调整红外激光束的准直。然后通过调节 pcal 电池和光电倍增管的设置，来调整多光子激光的波长和光束强度。接下来，将荧光样品载玻片置于物镜下，开启并校准解笼系统。启动解笼单元控制软件的校准程序。通过单击紫外激光光斑，用CCD相机捕获荧光，同时将紫外激光设置在其扫描范围内的多个点进行校准。在每个位置，调节电扫描振镜的位置，使其与软件中的特定坐标相对应。通过在解笼和成像计算机之间建立网络连接，导入成像系统的图像，从而实现对解笼位点的精确定位。使用屏幕捕获软件持续读取成像软件的帧，并据此调整成像。完成笼锁化合物的装载后，从成像软件中每间隔10帧导出一帧作为参考图像，导入闪光装置，以确保整个实验过程中参数的正确调整。接下来，打开显微操作器、电生理组件以及压力施加装置，用于将笼锁化合物递送至目标区域。使用火焰抛光的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制用于全细胞膜片钳和局部灌注的微电极。然后将脑片置于实验浴槽中，用网格固定，将浴槽放置在显微镜载物台上，并持续用人工脑脊液（aCSF）灌流脑片。开始全细胞膜片钳记录：先将膜片电极充灌含SBFI的细胞内液（ICS），再将局部灌流电极充灌笼锁化合物。将电极连接至相应的显微操作器，并将参考电极置入浴槽中。选择一个CA1区锥体细胞，其胞体位于脑片表面下30至70微米处，以确保细胞形态完整，并减少光解离激光的散射和衰减。使用红外微分干涉差视频显微镜，用膜片钳电极接近该细胞。施加轻柔负压，直至形成吉欧封接。补偿快速电容，然后击破膜并打开细胞以形成细胞模式。最后，在电流钳模式下评估细胞活性。注入去极化电流并检测由此产生的放电活动，以进行成像和刺激。首先，在人工脑脊液（aCSF）中加入四环 DOIND，以防止电压门控钠通道的激活及动作电位的产生。利用多光子激发观察细胞形态，并检测由此产生的 SBFI 荧光。为实验选择一个具有棘突的树突。放大以获取更高分辨率的图像，并在树突周围放置一个剪切框。然后将含有笼锁化合物的移液管放置在树突附近。将移液管定位，以实现对所选树突的有效局部灌流。调节解笼激光，使解笼光斑靠近目标结构。接下来，使用成像软件在所选树突及其相邻的树突棘上设置感兴趣区域。接近目标区域，并通过触发信号启动膜片钳和荧光记录，同时以较低压力注射笼锁化合物数秒。在局部灌注笼锁化合物期间，完全减弱激发光束以防止荧光漂白。随后，停止笼锁化合物的局部灌注。随后提高双光子激光的强度，以有效激发SBFI，并施加紫外闪光以启动笼锁化合物的释放，同时监测SBFI荧光的变化以及胞体电流；在SBFI荧光恢复至基线水平后，停止记录。为获取形态学信息，对已完成测量的夹片盒区域进行XY、Z轴层扫成像。确保该层扫图像在空间上过采样，以便实现最佳的图像去卷积，提高图像质量和分辨率。通过膜片钳电极将SBFI加载到神经元中，结合局部灌注笼锁谷氨酸后采用多光子激发，可实现对整个细胞的可视化观察，包括细小的树突及邻近的树突棘。在树突附近施加紫外闪光后，SBFI的荧光发射出现瞬时减弱，反映细胞内钠离子浓度升高。与此同时，在未预先灌注笼锁谷氨酸的脑片上对胞体施加紫外闪光时，记录到一个内向电流。从未引发SBFI荧光的变化或向内电流，表明这些信号是由谷氨酸解笼产生的。靠近解笼位点的树突棘中，峰值幅度略高，而较远树突棘的模式则类似于主树突。通过使用对钠离子通透性离子型谷氨酸受体的特异性阻断剂，研究了谷氨酸解笼后钠离子流入树突和树突棘的通路；谷氨酸诱导的细胞内钠信号以及所引发的胞体电流在这些阻断剂存在时均被消除。在洗脱阻断剂后，信号得以恢复，表明谷氨酸的解笼释放激活了CA1锥体神经元上的细胞趋向性谷氨酸受体，从而引发细胞内钠瞬变和内向电流。在进行该操作时，需注意应选择尽可能低的红外激光强度，以最大限度减少对样本的损伤。观看本视频后，您应已充分理解本实验方法中研究细胞微区钠信号传导的关键步骤。一旦掌握，该技术可实现对完整组织中活动诱发的细胞内离子信号进行高分辨率成像，且避免了其他技术可能引入的运动伪影。

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