通过向未受精卵母细胞注射 mRNA 在文昌鱼（Branchiostoma lanceolatum）中表达荧光蛋白

本实验的总体目标是将编码荧光蛋白的 mRNA 导入布朗氏囊胚腔卵母细胞中，以实现对发育中胚胎的活体荧光成像。该过程首先通过24小时的温度刺激诱导成熟雌性和雄性个体产卵。温度刺激后，将雌性和雄性分别放入独立的产卵杯中，以便分别收集卵母细胞和精子。

当细胞在经多聚赖氨酸包被的培养皿中排列整齐后，使用特别制备的显微注射针将溶液注入细胞核内。下一步是用一到五滴精子对细胞进行受精。最后进行双光子激光扫描。

显微镜用于展示由显微注射mRNA所产生的荧光蛋白的广泛表达。该方法的可视化演示至关重要，因为显微注射步骤难以学习，其所需要的技术技巧无法通过印刷材料详细描述和覆盖。首先，准备用于固定细胞的聚赖氨酸包被培养皿。

对于每个35毫米细胞培养培养皿，将底部覆盖多聚赖氨酸溶液，并在室温下孵育5分钟。接着，将多聚赖氨酸溶液转移至另一个培养皿中，再次于室温下孵育5分钟。弃去溶液，并将培养皿倒置，在室温下干燥2小时。

干燥储存时，将包被好的培养皿用塑料薄膜包裹，置于 4 摄氏度条件下，可保存至多一周。为制备用于培养显微注射胚胎的 aros 包被培养皿，需先配制人工海水和反渗透水。接着，将 aros 迅速溶解于过滤的人工海水中，配成 1% 浓度，然后将温热的 aros 溶液从一个培养皿倒入另一个培养皿，以确保培养皿表面形成极薄的 aros 包被层。

用保鲜膜包裹包被好的培养皿，并在4°C下保存，最长可保存一周。首先，在无RNase和DNase的水中配制注射混合液，苯酚呈红色，可用来识别成功注射的胚胎。

接下来离心混合物以沉淀晶体，并将样品置于冰上保存，直至准备使用。准备就绪后，用移液器吸取10 µL，取其中0.5 µL注射混合液，注意避免吸取管底已沉淀晶体的部分。通过吸取0.5 µL的注射液滴，从后端填充注射针。

将液体注入针头的大开口中。准备两根针头，以防其中一根在注射过程中断裂。将针头存放在底部装有水的容器中，以防止注射液蒸发。

混合后置于4°C环境中。让注射混合液缓慢移至注射针尖端，至少静置1小时，以尽量减少气泡的产生。开始卵母细胞和精子采集时，将雄鱼和雌鱼在海水（SW）中电击刺激24小时，然后在排卵前1至2小时转移至单独的容器中。

产卵后，立即收集精子和卵子。收集过程中需避免惊扰成体，额外的扰动可能导致收集后的精子和卵子扩散，从而降低其浓度。

将精子置于冰上，保存在1.5毫升离心管中，并将卵母细胞转移至经滤膜过滤的SW溶液预润洗过的培养皿中。取100至500个卵母细胞转移至另一35毫米培养皿，用于进行显微注射。最后，将剩余的卵母细胞进行受精，作为精子和卵母细胞质量的对照，或用于其他实验。

开始注射操作时，在荧光解剖显微镜下，将针头以相对于水平面50度的角度安装到显微操作器上，目镜放大倍数为25倍，将30个细胞转移至多聚赖氨酸包被的培养皿中，并用过滤后的SW标记，以便追踪已注射的细胞。将细胞有序地沿一条直线放置。每次注射应尽量减少数量，以降低暴露时间。

转移至多聚赖氨酸的时间，因其易导致发育中的胚胎变形。使用暗视野照明，使细胞尽可能呈现半透明状态。然后通过粗调旋钮，用精细镊子将注射针靠近细胞。剪切。

使用注射器脉冲式操作，在针尖开始弯曲的位置打开针头。在200倍放大下确认红色注射混合液从针头流出。然后通过微调旋钮，轻轻将注射针插入细胞核内部。

如果插入过浅，注入的溶液将无法保留在尿道口（UO）部位。如果插入过深，会破坏尿道口（UO）部位。注射时采用一到三次脉冲式推注。

如果针头足够细，应在恒定压力下以连续流动的方式注射。确保注射体积相当于单个卵母细胞注射后体积的五分之一至三分之一。迅速拔出针头，以避免泄漏。

确认注射的溶液保留在细胞内，并在数秒后扩散至整个细胞。继续对下一个细胞进行操作。每组保留一些未注射的胚胎作为阴性对照，以便在扫描注射后的胚胎时评估背景荧光。注射完成后，立即对卵母细胞进行受精处理。

由于卵母细胞质量会随着时间下降，因此应在排卵后一小时内完成注射与受精。根据精子浓度，向卵黄中加入一到五滴精子，并轻轻旋转培养皿。

胚胎上应出现受精膜。约一分钟后，在注射另一批卵母细胞的同时，使胚胎从聚赖氨酸包被的培养皿上脱落。脱落后，将胚胎转移至经aros包被的培养皿中。

尽可能在两细胞期之前，从多聚赖氨酸包被的培养皿中移出胚胎。在两细胞至四细胞期，借助荧光解剖显微镜筛选出注射成功的胚胎。

使用DSR滤光片时，成功的注射可通过正常的形态学特征来判断，即呈现出由酚红产生的红色荧光信号。将胚胎与过滤后的海水置于经农杆菌包被的培养皿中，在19°C条件下培养，直至达到体内成像所需的发育阶段。这些代表性图像来自注射了mRNA并包被荧光蛋白的斑马鱼胚胎。第一张图像显示，通过显微注射H2B-EGFP构建体所获得的核定位EGFP表达，在16细胞期阶段即可在胚胎中检测到。

此原肠胚是核定位mCherry与膜靶向EGFP普遍共表达的一个实例。核信号来源于H2B-mCherry构建体的显微注射，而细胞膜上的荧光则通过显微注射EGFP-CAAX盒构建体获得。对该原肠胚的光学切片显示了核靶向mCherry和膜相关EGFP如何分别标记细胞核与细胞轮廓。

本视频演示的显微注射技术将为进化生物学领域的研究人员提供支持，以改进现有方法，并开发针对个体成像、基因特异性操控以及稳定转化的重要模式生物——afi 的新策略，从而促进对动物进化的理解。