Name: 从胚胎干细胞衍生心脏祖细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学习利用流式细胞术从胚胎干细胞中分离心脏祖细胞的方法。该方案适用于小鼠和人类细胞系，通过生长因子诱导分化，为心脏再生医学研究提供可靠的细胞来源。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

感谢 Leonid Gnatovskiy 博士对本文的细致审阅和宝贵意见。本研究部分得到了美国国立卫生研究院（HL109054）和密歇根大学 Samuel 和 Jean Frankel 心血管中心（启动基金）对 WZ 的资助，以及纽约大学医学院 Leon H Charney 心脏病学部对 BL 的资助。

1. 从小鼠ESC诱导小鼠胚胎CPC
<ol>
	<li>准备小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层。
	<ol>
		<li>将MEF培养基（含10% FBS的DMEM）预热至37 °C。</li>
		<li>准备明胶包被的培养板。
		<ol>
			<li>向6孔板的每个孔中加入1 ml 0.1%明胶水溶液，或向10 cm培养皿中加入5 ml。</li>
			<li>将培养板或培养皿置于37 °C或室温下至少30分钟。使用前吸除明胶溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在37 °C水浴中快速解冻经辐照处理的MEFs，并轻轻摇动。</li>
		<li>轻柔地将细胞转移至15 ml或50 ml锥形管中，加入5 ml预热的MEF培养基，缓慢混匀后在200 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>用MEF培养基重悬细胞并计数活细胞。接种时使用以下体积的MEF培养基：6孔板每孔2 ml，10 cm培养皿10 ml。</li>
		<li>以每板/皿1–2 × 106的密度将细胞接种至6孔板或10 cm培养皿中。</li>
		<li>将MEF培养板/皿置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育至少24小时后使用。 
		注意：超过一周的MEF培养板/皿应弃用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备小鼠胚胎干细胞（ESCs）
	<ol>
		<li>将Isl1-cre; Rosa26YFP/ Mef2c-cre; Rosa26YFP小鼠ESCs在MEFs上培养至约90%汇合度。使用以下成分配制ES细胞培养基：410 ml DMEM、75 ml FBS、0.1 mM MEM NEAA、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM丙酮酸钠、100 U青霉素/链霉素和0.1 mM β-巯基乙醇。</li>
		<li>按照步骤1.1.2所述方法准备明胶包被的6孔板。</li>
		<li>吸除培养板中的培养基，并用DPBS清洗细胞。
		<ol>
			<li>吸除DPBS，向6孔板的一个孔中加入0.4 ml 0.25%胰蛋白酶，于37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟。加入1 ml预热的ES培养基以终止胰酶反应。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>收集细胞并在200 × g条件下离心，吸除上清液。用1 ml ES细胞培养基重悬细胞并进行计数。</li>
		<li>以3 × 104/cm2的密度将ESCs接种至明胶包被的培养板上，于37 °C、5% CO2条件下培养约2天，直至细胞达到约90%汇合度。每天更换培养基。</li>
		<li>当ESCs达到90%汇合度时，重复步骤1.2.2–1.2.5，以彻底去除MEF饲养层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过拟胚体（EB）形成诱导心前体细胞（CPC）分化
	<ol>
		<li>配制分化培养基：36 ml IMDM、12 ml Ham’s F12、2 mM L-谷氨酰胺、0.34 ml BSA（7.5%）、0.25 ml N2、0.5 ml B27、50 µg/ml抗坏血酸（AA）和0.45 mM 1-巯基甘油。</li>
		<li>吸除细胞培养基，并用DPBS清洗。吸除DPBS后，向6孔板的一个孔中加入0.4 ml 0.25%胰蛋白酶，在37 °C条件下孵育5分钟。</li>
		<li>加入1 ml分化培养基终止反应，并反复吹打使细胞团块分散为单细胞。</li>
		<li>将ESCs在200 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
		<ol>
			<li>用1 ml分化培养基重悬1 × 106个ESCs，计数后将细胞以1 × 105个细胞/ml的浓度接种于低吸附培养皿中，于37 °C进行初次EB聚集培养。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>EB形成两天后，将EB从培养皿转移至50 ml离心管中，在200 × g条件下离心1分钟。弃去上清液，并用10 ml不含Ca2+和Mg2+的DPBS清洗EB一次。</li>
		<li>吸除DPBS，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟。加入4.5 ml分化培养基终止反应，并反复吹打使EB解离为单细胞。</li>
		<li>在200 × g条件下离心细胞5分钟，吸除上清液后用1 ml分化培养基重悬细胞。</li>
		<li>计数细胞后，将2 × 106个细胞稀释至1 × 105个细胞/ml的浓度于分化培养基中。向培养基中加入VEGF、Bmp4和Activin A，使其终浓度分别为5 ng/ml、0.8 ng/ml和5 ng/ml。将细胞接种于培养皿中，在37 °C进行第二次EB形成。</li>
		<li>第二次EB形成40小时后，将EB转移至50 ml离心管中，用DPBS清洗一次，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶于37 °C消化5分钟，并反复吹打使EB解离为单细胞。</li>
		<li>用含5 ng/ml VEGF、10 ng/ml bFGF和12.5 ng/ml FGF10的Stempro-34培养基重悬细胞，以2 × 105/cm2的密度接种于明胶包被的培养板中。在37 °C培养箱中继续培养约32小时，随后进行CPC分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离小鼠心前体细胞（mCPCs）
	<ol>
		<li>吸除培养基并用DPBS清洗。向培养板中加入0.5 ml 0.25%胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟。加入4.5 ml分化培养基终止反应，并反复吹打使细胞解离为单细胞。离心收集细胞后，用含2% FBS的PBS重悬细胞，用于FACS纯化。</li>
		<li>将未分化的ESCs上样至分选仪作为阴性对照。调节电压以调整前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），选择目标细胞群。利用前向散射对侧向散射图以及前向散射高度对宽度图排除碎片和双联体。在选定的亚群中，根据ESCs对照的分布情况，在直方图中设定YFP阳性门控以消除细胞自发荧光。从YFP+门控中收集YFP+ CPCs。</li>
		<li>将纯化的CPCs（YFP+细胞）接种至6孔板中，使用分化培养基（见步骤1.3.1），在37 °C继续培养3–5天，以诱导CPCs分化为心肌细胞和SMCs。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 由人胚胎干细胞衍生人心脏祖细胞
<ol>
	<li>准备饲养层细胞
	<ol>
		<li>按上述方法制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层，密度为 2 × 104/cm2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>维持人胚胎干细胞（hESCs）
	<ol>
		<li>常规在MEF上使用标准hESC培养基（Knockout DMEM/F-12 385 ml、Knockout SR 100 ml、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM NEAA、0.1 mM β-巯基乙醇、10 ng/ml基础FGF）维持人ISL1:cre;pCAG-flox-STOP-flox-GFP或RFP ESCs。在进行心脏分化前，将人ESCs转移至无饲养层条件下培养至少2代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无饲养层条件下准备人ESCs
	<ol>
		<li>准备用于人ESCs培养的包被培养板。
		<ol>
			<li>在4 °C过夜解冻Matrigel。将一个50 ml离心管置于冰上，并向管中加入30 ml冷的DMEM/F12培养基。</li>
			<li>向冷培养基中加入1 ml Matrigel，充分混匀。将1 ml冷的Matrigel-DMEM/F12混合液加入6孔板的一个孔中，或5 ml加入10 cm培养皿中。</li>
			<li>将培养板/培养皿置于4 °C过夜或室温放置2小时。使用前吸除液体。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将人ESCs传代至上述包被板中：吸除MEF培养板中的培养基，用DPBS冲洗人ESCs。然后向6孔板的一个孔中加入1 ml分散酶（1 mg/ml）。将细胞置于37 °C培养箱中孵育，直至克隆边缘开始脱落。</li>
		<li>移除分散酶溶液，用DPBS冲洗两次，然后向每孔加入2.5 ml mTeSR培养基或MEF条件培养基。</li>
		<li>使用细胞刮刀刮取细胞，并轻轻吹打使hESC克隆分散为小细胞团块。</li>
		<li>将ESCs细胞团块转移并按1:3比例稀释接种至包被板中。</li>
		<li>每孔加入2 ml mTeSR培养基或MEF条件培养基，并每日更换培养基。</li>
		<li>在包被板上使用mTeSR培养基或MEF条件培养基培养人ESCs至少2代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导人ESCs向心前体细胞（CPC）分化
	<ol>
		<li>当细胞融合度约为90%时，吸除培养基并用DPBS冲洗。随后将hESCs在含0.5 mg/ml分散酶的溶液中于37 °C孵育20分钟。</li>
		<li>用DPBS冲洗hESCs两次，使用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下，然后将细胞团块重悬于分化培养基（DMEM/F12含18% FBS、0.1 mM NEAA、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM β-巯基乙醇和50 µg/ml抗坏血酸）中。</li>
		<li>将细胞转移至6孔超低吸附培养板中以形成拟胚体（EB）。</li>
		<li>次日更换分化培养基。</li>
		<li>每3天更换一次培养基，并维持EB悬浮培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离人CPCs（hCPCs）
	<ol>
		<li>在分化第9天或之前收集EB，用于人CPC的分离。</li>
		<li>吸除培养基，用DPBS冲洗EB两次。向6孔板每孔加入0.5 ml 0.25%胰蛋白酶，在37 °C作用5分钟。</li>
		<li>加入等体积的分化培养基终止反应。反复吹打使EB解离为单细胞。以200 × g离心5分钟收集细胞，重悬于含2% FBS的DPBS中。用40 µm细胞筛过滤，然后按照1.4.3节所述方法通过FACS分选RFP+ CPC细胞。</li>
		<li>将分选后的hCPCs接种至明胶包被的培养板上。在分化培养基中培养7–9天，使其分化为心肌细胞和平滑肌细胞。接种7天后，改用含5% Knockout SR的DMEM/F12培养基继续培养已分化细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li>
<li>Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).</li>
<li>Bondue, A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesp1%3A+a+key+regulator+of+cardiovascular+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment.</a> Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).</li>
<li>Bondue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesp1+acts+as+a+master+regulator+of+multipotent+cardiovascular+progenitor+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).</li>
<li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li>
<li>Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+protein+component+BAF250a+regulates+cardiac+progenitor+cell+differentiation+by+modulating+chromatin+accessibility+during+second+heart+field+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).</li>
<li>Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+in+cardiac+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).</li>
<li>Wu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin+of+a+bipotential+myocardial+and+smooth+muscle+cell+precursor+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart.</a> Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).</li>
<li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+HCN4%2B+cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li>
<li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricle%2C+outflow+tract%2C+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary%2Fanterior+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).</li>
<li>Boheler, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).</li>
<li>Wada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+cardiomyocyte-like+cells+from+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).</li>
<li>Wamstad, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151 (1), 206-220 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. S. 3rd, Barbas, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PloS One. 6 (4), e18293(2011).</li>
<li>Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+development+of+hematopoietic+and+cardiac+mesoderm+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).</li>
<li>Xu, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+medium+supporting+cardiomyocyte+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3A+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.</a> Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).</li>
<li>Bizy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+2-based+selection+of+human+iPSC-derived+early+ventricular+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes.</a> Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

该方案结合了使用生长因子引导小鼠胚胎干细胞（mESCs）分化以及人胚胎干细胞（hESCs）自发分化为心前体细胞（CPCs）的方法。利用带有荧光报告基因标记的CPC谱系，可通过流式细胞术（FACS）高效地识别和分离CPCs。经FACS纯化的CPCs仍具有分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的能力，并且其基因表达谱与体内来源的细胞相似。因此，由于这些CPCs能够形成心肌组织和血管结构，可成为基于细胞的心脏治疗的重要资源。
本方案中的一个关键步骤是在体外分化过程中确定获得高纯度和高产量心肌前体细胞（CPCs）的正确时间点。许多因素（例如，血清批次、细胞系、等）可能影响多能干细胞向CPCs的分化。强烈建议进行预实验，以优化分化条件并确定分离CPCs的合适时间窗口。
本方案中，CPC 的纯化依赖于由组织特异性 cre 重组酶激活的荧光报告基因。报告基因的特异性取决于心血管前体细胞标志物启动子以及 cre 重组酶的保真度。近年来，基因组编辑工具（如 CRISPR/Cas9 系统）的发展使得在 ESCs ...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/52047/derivation-of-cardiac-progenitor-cells-from-embryonic-stem-cells">Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells</a>.
The following author is now listed as a co-corresponding author:
Lei Bu

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

目前，心脏病仍是全球首要死因，过去二十年中的死亡率几乎未发生变化（美国心脏协会）。迫切需要开发新的治疗策略，以有效预防或逆转心力衰竭。随着干细胞生物学的快速发展，基于细胞的治疗成为一种有前景的策略1。在此背景下，多能心脏祖细胞（CPCs）因其具有增殖能力且仅定向分化为心肌谱系，可能是该疗法的理想细胞来源。因此，建立高效且稳定的生成与分离心脏祖细胞的方法，对心脏细胞治疗研究具有重要意义。
本方案重点关注早期胚胎发育过程中鉴定出的胚胎期心脏前体细胞（CPCs）及其由胚胎干细胞（ESCs）分化生成的方法。已有多种心脏前体细胞从胚胎心脏、成体心脏甚至骨髓中分离获得。2在胚胎发育过程中，骨形态发生蛋白（BMPs）、Wnt家族成员（wingless-type MMTV integration site family members）以及Nodal信号可诱导Mesp1的定向分化。+ 多能中胚层3Mesp1+ 细胞随后分化为胚胎期CPCs4这些心脏祖细胞通常表达HCN4、NK2同源框5（Nkx2-5）、Isl LIM同源框1（Isl1）、T-box 5（Tbx5）和心肌增强因子2C（Mef2c），形成第一和第二心脏区，并在心脏发生过程中贡献于心脏的主要结构。5-10Nkx2-5+ 和 Isl1+Mef2c+ CPCs 能够分化为心肌细胞、平滑肌细胞（SMCs）和内皮细胞5-8因此，这些心脏前体细胞（CPCs）将分化为心脏血管以及心脏组织，是基于细胞的心脏治疗的理想细胞来源。因此，生成CPCs 体外 一直是心血管研究的主要课题。由于胚胎干细胞（ESCs）具有无限增殖能力，并代表囊胚阶段的内细胞团（ICM）细胞，因此通过模拟自然胚胎发育过程将ESCs分化为胚胎期心脏前体细胞（CPCs），被认为是获取CPCs的合理且有效的方法。
从胚胎干细胞（ESCs）获得心前体细胞（CPCs）的一种广泛应用的方法是将ESCs聚集成拟胚体（EBs）11。为了提高分化效率，研究人员基于心脏发育的知识，使用了明确的化学物质和生长因子12-14。然而，目前尚无被领域内广泛接受的明确CPC标志物，尤其是缺乏公认的细胞表面标志物。为解决这一问题，可通过Cre/loxP系统对ESCs进行基因工程改造，使其在Isl1+或Mef2c+ CPC及其衍生物中表达荧光报告基因。具体方法是将cre重组酶基因敲入到Isl1/Mef2c启动子/增强子的控制之下。当cre重组酶切除flox-stop密码子后，可在组成型启动子驱动下激活修饰后的荧光蛋白RFP或YFP基因（如ISL1:cre;pCAG-flox-STOP-flox-GFP或RFP/Isl1-cre;Rosa26YFP/Mef2c-cre;Rosa26YFP）5,6。一旦ESCs分化为第二心区CPCs，由Isl1/Mef2c启动子/增强子驱动的cre即可激活荧光报告基因，从而通过流式细胞术（FACS）富集CPCs。简而言之，本方案采用拟胚体聚集体方法启动ESCs的分化；为提高分化效率，对分化细胞施加抗坏血酸（AA）以及Bmp4、Activin A和Vegf等生长因子处理13,15。该方案可高效、稳定地实现小鼠和人源ESCs向CPC的分化。

<table><tbody><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>Knockout SR</td><td>Life Technology</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technology</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technology</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technology</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technology</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technology</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technology</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>Life Technology</td><td>11765062</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technology</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technology</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Life Technology</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technology</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34</td><td>Life Technology</td><td>10639011</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technology</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>BSA&amp;nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Ascobic Acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>Sigma</td><td>M1753</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R&amp;D</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Bmp4</td><td>R&amp;D</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>ActivinA</td><td>R&amp;D</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>bFgf</td><td>R&amp;D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Fgf10</td><td>R&amp;D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr></tbody></table>

从胚胎干细胞中获取心脏前体细胞

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

心脏祖细胞（CPCs）具有分化为心肌细胞、平滑肌细胞（SMC）和内皮细胞的能力，在针对心脏病的细胞治疗中具有广阔前景。在多种分离CPCs的方法中，将胚胎干细胞（ESC）分化为CPCs的方法因其可提供无限的细胞来源而在该领域受到广泛关注。因此，已开发出多种从ESC分化获得CPCs的策略。本实验方案描述了从小鼠和人ESC中分化并纯化胚胎期CPCs的方法。由于利用细胞表面标志物分离胚胎期CPCs存在困难，本方法通过构建携带荧光报告基因的ESC系，使其在CPC特异性cre重组酶表达时激活荧光信号，从而可通过荧光激活细胞分选（FACS）富集CPCs。本方案详细说明了由ESC形成拟胚体（EBs）以实现CPC定向分化与富集的操作步骤。所获得的CPCs可进一步用于心肌谱系分化及其他生物学功能检测。该方案已优化，适用于高效、稳定地从小鼠和人ESC中获得CPCs。

本方案展示了从多种胚胎干细胞系中诱导获得心前体细胞（CPCs）的方法。通过将胚胎干细胞（ESCs）聚集成胚状体（EBs），使其分化为心前体细胞。ESCs通常在MEF饲养层上常规培养（图1A, F），在诱导分化前需去除饲养层。将ESCs在分化培养基中聚集形成EBs（图1B, G）后，对形成的EBs使用Bmp4和Activin A处理，以促进小鼠细胞系中中胚层的分化（图1C）。通过荧光蛋白YFP/RFP的表达可识别ESCs向心肌谱系的分化情况（图1D）。CPCs通过流式细胞分选（FACS）进行纯化（图1H），随后进一步培养以分化为心肌细胞和平滑肌细胞。cTnT和SM-MHC的染色结果表明CPCs具有向心肌细胞和平滑肌细胞分化的潜能（图1 E,I,J）。通常，从小鼠ESCs分化方案中可获得80–90%的CPCs，而从人ESCs分化方案中可获得0.5–5%的CPCs。
<p class="jove_content" fo:keep-to...

本方案将介绍从小鼠和人类胚胎干细胞中诱导获得心肌前体细胞的方法。该方案的主要策略是利用流式细胞术，通过在胚胎干细胞系中构建的荧光报告系统来富集心肌前体细胞。

心脏前体细胞（CPCs）具有分化为心肌细胞、平滑肌细胞（SMC）和内皮细胞的能力，在……方面具有巨大潜力。

本实验方案的总体目标是从胚胎干细胞中生成人或小鼠的心脏前体细胞。首先，需培养高质量的胚胎干细胞（e ESCs）或小鼠胚胎饲养层细胞（myths）。第二步，将细胞转移至明胶包被的培养皿中，以促进形成最初的胚胎小体。接下来，将细胞进行聚集培养，并在培养物中添加生长因子，以诱导形成第二阶段的拟胚体。在最后一步中，将拟胚体再次解离，所得细胞经额外的生长因子处理。最终，心脏前体细胞可进一步培养，以实现心肌细胞和血管平滑肌细胞的分化。在进行该实验操作时，重要的是要检测每种细胞系的分化效率，以便筛选出具有最佳心源性潜能的细胞。接下来，由实验室的博士后研究员 Dr. Inland Lamb 演示从小鼠胚胎体诱导心脏前体细胞分化的实验步骤。首先，在 ESC 培养基中培养小鼠胚胎干细胞（mESCs），直至细胞融合度达到 90%。随后，用 DPBS 洗涤细胞，再于 37°C、5% CO₂ 条件下，加入 0.4 毫升 0.25% 胰蛋白酶消化使细胞脱落。五分钟后，加入一毫升预热的培养基以终止酶促反应。在室温下以200 × g离心五分钟，然后将细胞重悬于一毫升ESC培养基中。计数后，将细胞以每平方厘米3 × 10⁴个细胞的密度接种至明胶包被的培养板中，在37°C、5% CO₂条件下培养，并每天更换培养基。当细胞达到汇合状态时，用胰蛋白酶将其消化脱离，方法如前所述。随后，在37摄氏度条件下，将1×10⁶个胚胎干细胞接种于1毫升分化培养基中，置于低吸附培养皿内，以进行初次胚胎体聚集。胚胎体形成两天后，将胚胎体转移至50毫升离心管中并进行离心。用10毫升不含钙和镁的DPBS洗涤细胞沉淀，然后在37摄氏度下加入1毫升胰蛋白酶消化以分散胚胎体。5分钟后，加入4.5毫升分化培养基终止反应。用培养基上下吹打以将胚胎体解离为单细胞悬液。然后再次离心，将细胞重悬于1毫升培养基中，计数后稀释至每毫升2×10⁶个细胞，再稀释至每毫升1×10⁵个细胞，置于含有VEGF、BMP4和Activin A的分化培养基中，随后在37°C的培养皿中培养，以形成第二代胚胎体。第二次形成胚体后40小时，将胚体转移至50毫升离心管中，然后按照前述方法进行细胞解离。接下来，将细胞重悬于含VEGF-B、FGF和FGF-10的EmPro 34培养基中，并以每平方厘米2×10⁵的密度接种于明胶包被的培养板中，在37°C条件下培养。约32小时后，按前述方法将胚体解离为单细胞悬液，然后将最终的细胞沉淀重悬于2% FBS-PBS中。请注意，获得荧光标记细胞最高产量所需的培养时间需针对每种细胞系单独确定。以未分化的 ESCs 作为阴性对照在流式细胞仪上进行检测，调节前向散射光和侧向散射光，利用前向散射光对侧向散射光以及前向散射光高度对宽度的图示来选择目标细胞群，排除碎片和双联体。随后，在选定的亚群内，绘制 YFP 阳性直方图门控，以消除细胞

derivation-of-cardiac-progenitor-cells-from-embryonic-stem-cells

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从胚胎干细胞衍生心脏祖细胞

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9...

从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。...

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

本文介绍一种可扩展的方法，通过简单组合使用Activin...

从人多能干细胞生成第一心场样心脏前体细胞及心室样心肌细胞

本方案描述了一种心脏前体细胞的内皮分化技术，重点介绍血清浓度和细胞接种密度如何影响内皮分化潜能。...

低血清条件下诱导心脏前体细胞向内皮细胞分化

本文的总体目标是规范从小鼠成年心脏中分离、鉴定和分化心脏干细胞（CSCs）的实验方案。本文介绍了一种利用密度梯度离心法分离小鼠心脏干细胞的方法，并详细阐述了心脏干细胞的培养、增殖以及向心肌细胞分化的具体方法。...

从小鼠成年心脏中分离、鉴定及分化心脏干细胞

本文详细描述了一种实验方案，用于在干细胞移植前对其DNA完整性进行评估的分析。...

评估用于心脏细胞治疗的干细胞DNA完整性

本方法的目的是在体外生成心区特异的心脏前体细胞，以研究前体细胞的特化过程和功能特性，并生成心腔特异的心脏细胞用于心脏疾病建模。...

体外生成心脏区域特异性心脏前体细胞

学习利用流式细胞术从胚胎干细胞中分离心脏祖细胞的方法。该方案适用于小鼠和人类细胞系，通过生长因子诱导分化，为心脏再生医学研究提供可靠的细胞来源。

从胚胎干细胞中获取心脏前体细胞

探索更多视频