Name: 快速荧光原位对于Xist的RNA杂交组合议定书组蛋白修饰免疫荧光X染色体失活 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学习快速荧光原位杂交结合免疫荧光技术，用于研究X染色体失活过程中长链非编码RNA动态变化与组蛋白修饰的关系。该方法可在单细胞水平分析RNA与染色质结构的相互作用。

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我们感谢洪在俊（Hongjae Sunwoo）在RNA FISH寡核苷酸设计方面提供的有益建议。我们还感谢塞雷妮蒂·柯蒂斯（Serenity Curtis）对稿件的编辑。N.Y. 获得了日本促进科学振兴会（JSPS）海外博士后研究奖学金的支持。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：RO1-GM102184）、March of Dimes 研究基金会（项目编号：#6-FY12-337）以及辛辛那提儿童医院医学中心发展基金和受托人基金对 Y.O. 的资助。

1. 探针制备
<ol>
	<li>获取多个位于 Xist 基因中的独特寡核苷酸（长度为 20–30 个核苷酸，熔解温度为 63–65 ºC，表 1），5’端带有氨基修饰，并溶于水中。</li>
	<li>将等摩尔量的 5’端氨基修饰寡核苷酸（总量 4.5 µg）混合，按照制造商说明书使用胺反应性荧光染料进行标记。
	<ol>
		<li>将混合后的寡核苷酸溶解于最终体积为 5 µl 的无核酸酶水中，并向寡核苷酸溶液中加入 3 µl 1 M 碳酸氢钠。</li>
		<li>向胺反应性染料小瓶中加入 2 µl DMSO，并短暂涡旋振荡。</li>
		<li>将寡核苷酸溶液与 DMSO 中的反应性染料混合，在室温避光条件下孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 G-25 柱层析纯化并随后进行乙醇沉淀，以纯化荧光标记的寡核苷酸探针。
	<ol>
		<li>将 G-25 柱在 750 × g 条件下离心 1 分钟，以去除多余的保存缓冲液。</li>
		<li>向第 1.2.3 步中得到的标记混合物中加入 40 µl 无核酸酶水，并将其加至 G-25 柱上。在 750 × g 条件下离心 2 分钟。</li>
		<li>向第 1.3.2 步获得的纯化探针中加入 50 µl 无核酸酶水、10 µl 3 M 醋酸钠（pH 5.2）和 250 µl 乙醇。在 -80 °C 下保存 30 分钟，然后在 4 °C 下以 21,000 × g 离心 15 分钟。</li>
		<li>用 1 ml 70% 乙醇洗涤沉淀的寡核苷酸一次。</li>
		<li>将沉淀物重悬于 50 µl 无核酸酶水或 TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5；1 mM EDTA）中，终浓度约为 10 µM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用杂交缓冲液（10% 甲酰胺；2× SSC [300 mM NaCl；30 mM 柠檬酸钠]；2 mg/ml BSA；10% 硫酸葡聚糖）将荧光标记的寡核苷酸探针稀释至终浓度为 250 nM。 
	注：在此快速 FISH 实验方案中，Xist 基因的寡核苷酸探针设计并使用了比常规 FISH 协议更高的浓度，以缩短杂交孵育时间。</li>
</ol>
2. 载玻片制备
注意：可通过将小鼠胚胎干细胞（ES）或类胚体（EB）分化细胞直接培养在经多聚赖氨酸处理的载玻片上，或使用细胞悬液进行细胞离心涂片，制备用于免疫荧光原位杂交（immuno-FISH）的载玻片样品20,21。此处展示的是通过细胞离心涂片法制备载玻片的步骤。
<ol>
	<li>吸弃6孔板中的培养基，用PBS（室温）洗涤一次，彻底吸弃。</li>
	<li>向6孔板中加入0.5 ml胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育5–10分钟。</li>
	<li>加入5 ml培养基，通过轻柔吹打数次使细胞充分重悬。</li>
	<li>将细胞转移至15 ml离心管中，于室温下以200 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用2 ml PBS轻柔重悬细胞沉淀。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞，并用PBS将细胞悬液稀释至4 × 105 个细胞/ml。</li>
	<li>将载玻片、滤纸卡和样品室用夹子组装好，放入细胞离心涂片机（cytospin）对应的插槽中。在每组组装好的样品室中加入250 μl步骤2.6制备的细胞悬液，于室温下以1,500 rpm离心10分钟。</li>
	<li>在冰上准备3个科卜林染色缸（coplin jars），分别加入40 ml预冷的PBS、CSK缓冲液（10 mM PIPES，pH 6.8；100 mM NaCl；300 mM蔗糖；3 mM MgCl2）和CSKT缓冲液（含0.5% Triton X-100的CSK缓冲液）。</li>
	<li>细胞离心涂片完成后，迅速将载玻片转移至冰上预冷的PBS中，孵育5分钟。</li>
	<li>将载玻片转移至冰上预冷的CSK缓冲液中，孵育1分钟。</li>
	<li>将载玻片转移至冰上预冷的CSKT缓冲液中，孵育5分钟。</li>
	<li>将载玻片再次转移回冰上预冷的CSK缓冲液中，孵育1分钟。</li>
	<li>将载玻片转移至含4%多聚甲醛的PBS溶液中，于室温孵育10分钟。</li>
</ol>
3. 免疫荧光
<ol>
	<li>将载玻片放入盛有PBST（1x PBS含0.1% Tween-20）的考普林瓶中，浸泡数秒。</li>
	<li>将载玻片倾斜放置，使残留缓冲液沿玻片流下。小心擦去多余液体，将载玻片放入装有水的移液枪头盒中。在玻片上覆盖40 μl封闭液（1x PBS，1% BSA，0.1% Tween-20），轻轻加盖盖玻片，室温孵育10分钟。</li>
	<li>移除盖玻片，除去封闭液，加入40 μl组蛋白H3K27me3一抗，用封闭液按1:500比例稀释。重新盖上盖玻片，室温孵育30分钟。 
	注意：在此RNA FISH实验流程中，若使用多克隆抗体，封闭液中添加RNase抑制剂可能有助于保护RNA。</li>
	<li>将载玻片在盛有PBST的考普林瓶中洗涤2次，每次5分钟，洗涤时轻轻振荡。</li>
	<li>将载玻片倾斜放置，使残留缓冲液沿玻片流下。小心擦去多余液体，将载玻片放回枪头盒中。加入40 μl用封闭液按1:500比例稀释的二抗，覆盖盖玻片，避光孵育15分钟。后续所有步骤均需始终避光操作。</li>
	<li>参照步骤3.4，在盛有PBST的考普林瓶中洗涤2次。</li>
</ol>
4. 使用寡核苷酸探针进行RNA FISH
<ol>
	<li>在步骤 4.3 的 RNA FISH 实验前，将底部装有水的移液器吸头盒在 37 °C 预热，以防止载玻片干燥。</li>
	<li>将载玻片倾斜放置，使残留缓冲液沿玻片流下。小心擦去步骤 3.6 中多余的液体，将载玻片放入底部装有水的预热移液器吸头盒中。在载玻片上加入 500 μl FISH 洗涤缓冲液（含 10% 甲酰胺的 2x SSC），室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>移除 FISH 洗涤液，在载玻片上加入 8 μl 寡核苷酸探针，盖上盖玻片，将载玻片转移至底部装有水的预热移液器吸头盒中；在 37 °C 孵育 1–2 小时。</li>
	<li>将 3 个已预热的考兰罐（coplin jar）置于 37 °C 水浴中，分别装有 FISH 洗涤缓冲液、含 DAPI 的 FISH 洗涤缓冲液和 2x SSC。</li>
	<li>RNA FISH 孵育 1–2 小时后，将载玻片放入预热的 FISH 洗涤缓冲液中。</li>
	<li>孵育数分钟，直至盖玻片从载玻片上脱落。</li>
	<li>将载玻片重新放入洗涤缓冲液中，继续孵育 5 分钟。</li>
	<li>将载玻片转移至另一装有预热的含 0.5 ng/ml DAPI 的 FISH 洗涤缓冲液的考兰罐中，孵育 5 分钟。</li>
	<li>将载玻片转移至另一装有预热的 2x SSC 的考兰罐中，孵育 5 分钟。</li>
	<li>将载玻片倾斜放置，使残留缓冲液流下。小心擦去多余液体，将载玻片放回干燥的吸头盒中。在载玻片上加入 4 μl 含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片。</li>
	<li>用指甲油密封盖玻片，置于显微镜下观察。载玻片可在避光条件下于 4 °C 保存数月。</li>
</ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
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<li>Gendrel, A. V., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+years+of+X-inactivation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fifty years of X-inactivation research.</a> Development. 138, 5049-5055 (2011).</li>
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<li>Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Xist+in+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Requirement for Xist in X chromosome inactivation.</a> Nature. 379, 131-137 (1996).</li>
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<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).</li>
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<li>Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersection+of+the+RNA+interference+and+X-inactivation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways.</a> Science. 320, 1336-1341 (2008).</li>
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<li>Wang, K. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Mol Cell. 43, 904-914 (2011).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

本文介绍了一种快速的免疫荧光原位杂交（immuno-FISH）方案，可在不到5小时内完成载玻片制备、Xist RNA荧光原位杂交以及H3K27me3的免疫荧光染色。与常规用于Xist RNA检测的免疫FISH方法相比（通常需要过夜进行RNA FISH杂交），本方案不仅显著缩短了实验时间，而且通过使用寡核苷酸探针提高了免疫FISH的灵敏度。
由于Xist在X染色体失活过程中高度转录，且其转录本被发现强烈地在失活X染色体（Xi）上以顺式方式富集，因此利用相对较短的孵育时间，通过RNA FISH即可在分化及已分化细胞中轻松检测到Xist RNA信号。该免疫-FISH方案也可用于其他目标蛋白和丰度较高的RNA检测，但可能需要对免疫荧光和RNA FISH步骤进行优化。若将本方案应用于其他RNA，需考虑可设计的寡核苷酸探针数量，并通过试错法优化RNA FISH中探针的浓度、孵育时间和温度。一个其他应用的实例是，我们此前已成功使用单个LNA探针检测端粒RNA22。针对低丰度RNA靶标的探针设计与制备，请参考Raj和Tyagi的文章<sup...

哺乳动物X染色体失活（XCI）是一种用于补偿XX与XY之间X连锁基因剂量不平衡的策略，其中雌性个体的两条X染色体中的一条在转录水平上被沉默1。X染色体失活是研究长链非编码RNA（lncRNA）的理想模型系统。X染色体失活受多种lncRNA调控，在过去几十年中被广泛研究，以揭示lncRNA与转录、染色质结构及细胞核组织之间相互作用的机制2,3。
位于X染色体上的X失活中心（XIC）是一个复杂的遗传位点，包含多个产生非编码RNA的基因4。在真兽亚纲哺乳动物中，X失活特异性转录本（Xist）长链非编码RNA（lncRNA）便是其中一种，在X染色体失活过程中发挥关键作用5,6。Xist转录本围绕未来失活X染色体（Xi）的位置聚集，启动X染色体失活过程，在RNA FISH检测下呈现为云状结构，这一结构被称为“Xist云”7。由于Xist RNA可与多种染色质修饰酶相互作用，因此在X染色体失活过程中，可观察到Xist云与沉默染色质及抑制性转录相关的不同表观遗传修饰共定位8。例如，Xist RNA与多梳抑制复合物2（PRC2）相互作用，后者负责介导H3K27me3修饰，从而诱导形成抑制性染色质状态9。Xist云在Xi上的出现及其与强烈的H3K27me3修饰的共定位，代表了Xi所具有的兼性异染色质特征10,11。
染色体技术，例如DNA/RNA荧光原位杂交（FISH），已从使用放射性标记探针的传统方法12发展到近年来采用多条寡核苷酸探针、灵敏度更高且具备荧光成像能力的先进方法13,14。DNA/RNA FISH与免疫荧光联合使用已成为常规的细胞学工具，用于研究细胞核在时空上的组织结构、RNA定位、染色质结构及其修饰。RNA FISH中最常用的探针制备方法是利用质粒或细菌人工染色体（BAC）克隆，并通过缺口平移法或随机引物标记法进行标记15。然而，小鼠中近70%的基因和人类中约40%的基因存在正义链与反义链转录本的重叠16，因此需要采用链特异性的FISH方法以区分正义和反义转录本。体外转录的RNA探针（核糖探针）常用于链特异性的RNA FISH17,18；但该方法需构建含有T7、SP6或T3启动子的质粒克隆或PCR产物，并进一步合成核糖探针。此外，来源于基因组DNA或cDNA的核糖探针常包含非特异性区域和重复元件，导致背景噪声较高。另一个问题是，长度为数百个核苷酸、末端携带多个荧光基团的核糖探针难以有效穿透细胞核。为克服这一问题，已开发出多种较短的寡核苷酸探针，每条探针仅在末端标记单个荧光基团，具有高灵敏度、信号强度均匀以及易于纯化和操作的优点14。此外，DNA寡核苷酸通常比RNA更稳定。我们采用类似策略，在Xist RNA FISH19中结合使用寡核苷酸探针与免疫荧光，以研究Xist长链非编码RNA（lncRNA）在X染色体失活过程中诱导的Xi染色体表观遗传动态变化。本实验方案详细描述了寡核苷酸探针的构建、细胞的适当制备，以及免疫荧光与RNA FISH技术的应用。若实验室需常规开展Xist RNA FISH，长期来看，使用多条寡核苷酸探针的方法具有较高的成本效益。该技术可用于在细胞中鉴定长链非编码RNA，同时绘制其与表观遗传修饰或相关因子的共定位关系。本方案的一大优势在于可根据研究需求轻松进行调整和优化。

<table><tbody><tr><td>5&amp;rsquo;-氨基修饰的寡核苷酸</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 活性染料</td><td>Life Technologies</td><td>A32750</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin G-25 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2</td><td>Shandon</td><td>59900102</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，分子生物学级（用于杂交缓冲液）</td><td>Roche</td><td>10715859103</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3K27me3 抗体</td><td>Active Motif</td><td>61017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠二抗，高度交叉吸附</td><td>Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

快速荧光 原位 x染色体失活中xist rna与组蛋白修饰免疫荧光联合杂交实验方案

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

结合RNA荧光 原位 杂交（FISH）与免疫荧光（immuno-FISH）相结合的技术可在单细胞水平上用于检测RNA定位的空间动态，同时通过免疫荧光揭示蛋白质定位、表观遗传修饰及其他相关特征。X染色体失活是长链非编码RNA（lncRNA）介导基因沉默的经典范例。在哺乳动物雌性个体的两条X染色体中，X失活特异性转录本（Xist）lncRNA在其中一条X染色体上的聚集（称为Xist云）是启动X染色体失活的关键步骤。Xist RNA直接或间接地与多种染色质修饰酶相互作用，从而在失活的X染色体（Xi）上建立独特的表观遗传景观。Xi的一个已知表观遗传标志是组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3）修饰。本文介绍一种简单快速的immuno-FISH实验方案，利用针对RNA的多重寡核苷酸探针进行FISH检测Xist RNA，并结合H3K27me3的免疫荧光染色，以同时观察Xist RNA及其相关表观遗传修饰的定位情况。与传统方法相比，使用寡核苷酸探针可显著缩短孵育时间，并提高Xist RNA检测的灵敏度 体外 转录的RNA探针（核糖探针）。本方案为研究lncRNA的动态变化及其相关的表观遗传修饰、染色质结构、细胞核组织和转录调控提供了强有力的工具。

快速免疫荧光原位杂交的代表性图像如图1A所示。在分化中的雌性细胞中，可检测到Xist RNA云与Xi染色体上的H3K27me3信号共定位。分化第12天时，超过90%的拟胚体细胞显示出Xist云信号（图1B）。短寡核苷酸探针可有效穿透细胞核，从而几乎可视化所有与Xist RNA共定位的H3K27me3信号（图1C；97%，n = 150）。
<img alt="Xist RNA 定位、H3K27me3 染色、DAPI 标记的细胞核；荧光显微镜结果。" src="/files/ftp_upload/52053/52053fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：Xist RNA 与 H3K27me3 在分化中的小鼠胚胎体（EB）的失活 X 染色体（Xi）上共定位。 <st...

我们开发了一种易于定制的链特异性荧光方法 原位 结合免疫荧光的荧光原位杂交（FISH）方案。该方法可在单细胞水平上对RNA动态进行详细分析，同时深入了解染色质结构、细胞核组织及转录调控。

快速荧光 原位 X染色体失活中Xist RNA与组蛋白修饰免疫荧光联合杂交实验方案

结合RNA荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（immuno-FISH）的技术可用于单细胞水平的研究……

本实验的总体目标是通过快速荧光原位杂交结合免疫荧光技术，研究长链非编码RNA及其在X染色体失活过程中相关的表观遗传修饰的动态变化。该方案需要制备正在分化的胚胎体细胞的载玻片标本，细胞经通透和固定后用于染色。随后，通过抗体标记的荧光探针定位组蛋白H3三甲基化赖氨酸27，该修饰在失活的X染色体上富集。最后一步使用含有5'端氨基修饰并标记了AM活性荧光染料的寡核苷酸探针进行exist RNA FISH。最终通过荧光显微镜观察exist RNA云及组蛋白修饰在胚胎干细胞（EES细胞）分化过程中的定位情况。与现有方法相比，该技术的主要优势在于我们使用了多种独特的寡核苷酸，这些寡核苷酸仅标记一种荧光素。这使我们能够实现转录特异性检测，从而降低背景信号，同时还能增强探针向细胞核的渗透，并提高信号强度。此外，当我们提高探针浓度时，可显著缩短完成该免疫荧光原位杂交实验所需的时间。尽管该方法可揭示存在于失活X染色体上的RA的定位及其相关的染色质修饰，也可应用于其他生物系统，用于检测RA及其相关的表观遗传修饰、核定位和跨代调控。首先准备探针时，需获得多个长度为20至30个核苷酸、熔解温度为63至65摄氏度的寡核苷酸，这些寡核苷酸应包含针对存在RNA的特异性反义序列以及5'端氨基修饰。将这些寡核苷酸悬浮于纯水中，各寡核苷酸等摩尔混合，总DNA量为4.5微克。随后按照制造商说明书，使用氨基反应性荧光染料对标寡核苷酸进行标记。标记完成后，通过G-25柱纯化。然后使用乙醇和醋酸钠沉淀寡核苷酸。这需要在负80摄氏度下放置半小时，随后在4摄氏度下以21,000 G离心。接下来，在洗涤后用70%乙醇洗涤沉淀物一次。将寡核苷酸溶解于 50 微升无核酸酶的水或 TE 缓冲液中，配制成终浓度为 10 微摩尔的 DNA 溶液。此溶液即为探针储备液；使用时，将其在杂交缓冲液中重新浓缩至 250 纳摩尔。实验开始时，准备正在六孔板中生长的 ES 细胞或 EB 分化细胞，吸去各孔中的培养基，然后用室温的缓冲液洗涤细胞。用 PBS 充分吸除 PBS。接着，向每个孔中加入 0.5 毫升胰蛋白酶溶液，并将培养板孵育 5 至 10 分钟。通过向每个孔中加入 5 毫升培养基并轻轻吹打以终止胰蛋白酶反应。然后将细胞转移至15毫升离心管中。在室温下以200 × g离心5分钟，弃去所有上清液，并将细胞沉淀重悬于2毫升PBS中。随后对细胞进行计数，并用PBS将细胞悬液稀释至每毫升400,000个细胞。现在，将每张载玻片与一张滤纸、一个样品室和一个夹子组装在一起。根据需要制备相应数量的载玻片，并将其放入细胞离心机的转子中。向每张载玻片加入 250 µL 细胞悬液，在室温下以 1500 RPM 离心 10 分钟。然后进行透化和固定。首先，将载玻片迅速转移至预冷的PBS中，冰上孵育5分钟，作为洗涤步骤。其次，将载玻片转移至预冷的CSK缓冲液中，孵育1分钟，以使细胞膨胀。第三步，将载玻片移入CSKT缓冲液中，孵育5分钟，以透化细胞。第四步，用冰冻的 CSK 缓冲液洗涤细胞 1 分钟。最后，在室温下用 PBS 配制的 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟。首先，将载玻片从 PFA 溶液中取出。然后将它们转移到含有PBST的共聚焦小瓶中浸泡数秒，随后倾斜放置以沥干。接着，在空的移液枪头盒中，在枪头架插件下方加入水。然后擦干载玻片的背面，并将其转移至该盒子中。现在每张载玻片上覆盖 40 微升封闭液，并轻轻盖上盖玻片。将载玻片置于盒子中，在室温下孵育 10 分钟。随后取下盖玻片，将载玻片倾斜放置。现在加入 40 µL 一抗溶液。盖上盖玻片，室温孵育 30 分钟。孵育结束后，用 PBST 缓冲液在共聚焦染色缸中洗涤载玻片两次，以去除未结合的一抗。轻轻振荡，每次洗涤持续五分钟。然后将玻片放回倾斜位置，使 PBST 流尽。接着用纸巾擦去玻片背面多余的液体，再将玻片放回盒中。现在向每张载玻片加入 40 微升 1:500 的二抗溶液。用盖玻片覆盖载玻片，并在避光条件下于室温孵育 15 分钟。此后所有步骤均需始终避光。使用 PBST 按照之前的方法去除抗体，然后将玻片倾斜放置以沥干。进行免疫荧光染色时，提前将装有水的盒子预热至 37 摄氏度。擦去玻片背面的洗涤缓冲液后，将其放入装有预热至该温度水的移液器吸头盒中，并向每张玻片加入 500 微升鱼体洗涤缓冲液。让其孵育五分钟。五分钟后，在室温下从每个载玻片旁吸取溶液，并加入八微升工作探针溶液，然后加盖盖玻片。接着将载玻片转移至预热的载玻片盒中，在37摄氏度下孵育一至两小时。孵育结束后，将载玻片放入盛有鱼类洗涤缓冲液的共聚焦染色缸中，在37摄氏度下浸泡。当盖玻片脱落时（通常需要几分钟），移除盖玻片，并让载玻片继续孵育5分钟。随后将载玻片转移至另一个含有鱼洗缓冲液的染色缸中，其中添加0.5 纳克/毫升的DAPY染料，同样在37摄氏度下进行。将玻片在此溶液中孵育5分钟。随后在37摄氏度下用2×SSC洗涤玻片5分钟。最后，将玻片倾斜放置，以沥干多余的2×SSC。用四微升含有DPI的Antifa溶液擦拭并封片。采用快速免疫荧光法观察exist RNA和组蛋白修饰的定位。在分化中的雌性EB细胞中，exist RNA呈现为绿色云状物，覆盖整条失活的X染色体。在这些细胞中，组蛋白H3三甲基化赖氨酸27修饰呈红色，细胞核则用DPI染为蓝色。在分化第12天处理雌性小鼠EB细胞。此时，超过90%的细胞在细胞核中显示出Xist RNA云状结构。短寡核苷酸探针能够有效穿透细胞，几乎所有的组蛋白H3三甲基化赖氨酸27信号均被染色，并与Xist RNA云共定位。在150个细胞核中，97%的Xist RNA信号被发现与这些甲基化组蛋白共定位。一旦掌握该技术，可在不到五小时内完成轻微的样品制备。针对孕晚期27周和存在类风湿性关节炎（RA）的组织样本进行免疫荧光染色。如果操作得当，该免疫荧光（immuno-FISH）方案也可应用于其他RNA表观遗传修饰及目标蛋白的研究。若将本方案应用于不同的生物体系，可能需要进行一定的优化。祝您的实验顺利成功。

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快速荧光原位对于Xist的RNA杂交组合议定书组蛋白修饰免疫荧光X染色体失活

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此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

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本视频展示了双色整体原位杂交技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化两种不同基因的空间和时间表达模式。该方法最初由 David Wilkinson、Domingos Henrique、Phil Ingham 和 David Ish-Horowicz...

早期鸡胚双重整体原位杂交

学习快速荧光原位杂交结合免疫荧光技术，用于研究X染色体失活过程中长链非编码RNA动态变化与组蛋白修饰的关系。该方法可在单细胞水平分析RNA与染色质结构的相互作用。

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