Name: 支持的脂双层云母制备的高分辨率光学显微成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学习制备云母支撑脂双层的简易方法，仅需30微升脂质囊泡即可形成高质量膜结构。该技术适用于高分辨率显微成像和单分子追踪研究，为生物物理学与神经科学研究提供稳定可靠的实验平台。

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作者无致谢。

1. 云母和&#160;载玻片&#160;准备
<ol>
	<li>将1½号（0.17 mm）盖玻片放入染色架中。</li>
	<li>在60 °C下，用2%去污剂超声处理30分钟。</li>
	<li>用去离子水清洗20次。</li>
	<li>用镊子取出载玻片，并用压缩空气或氮气吹干。</li>
	<li>用剪刀或刀片将云母片切成10 × 10 mm的正方形小片。</li>
	<li>用刀片将每片云母进一步切成2–3片更薄的云母薄片。 
	注意：此步骤需使用锋利的刀片。</li>
</ol>
2. 云母片组装与腔室安装
<ol>
	<li>用乙醇清洁显微镜载玻片。</li>
	<li>使用光学胶将步骤1.6中切割好的云母小片粘附到载玻片上。建议使用低粘度胶水，以便更好地铺展液滴并牢固粘合云母。</li>
	<li>在紫外灯下固化，10分钟。 
	注意：该胶水通过紫外光固化，最大吸收波长范围为350至380 nm，完全固化所需的推荐能量为4.5 J/cm2。然而，此步骤也可使用不同的光源（参见胶水供应商提供的材料）。</li>
	<li>用透明胶带剥离云母表面的最外几层，暴露出新鲜洁净的云母表面。</li>
	<li>在云母表面放置一小滴（约20 μm）光学胶。 
	注意：此步骤建议使用高粘度且自荧光水平低的胶水。我们的经验表明，结合使用低粘度胶（步骤2.2）和高粘度胶可显著提高云母剥离的效果（步骤2.7）。</li>
	<li>将 freshly cleaned 盖玻片轻轻放置在胶滴上，避免产生气泡，静置1分钟。</li>
	<li>在紫外灯下固化，10分钟。 
	注意：此步骤完成后，由载玻片、云母和盖玻片组成的三明治结构可保存相对较长时间（长达数周）。请在实际进行SLB制备前再进行下一步操作，以确保云母表面新鲜。 
	注意：该胶水通过紫外光固化，最大吸收波长范围为350至380 nm，完全固化所需的推荐能量为4.5 J/cm2。然而，此步骤也可使用不同的光源（参见胶水供应商提供的材料）。</li>
	<li>使用手术刀，如视频所示，从侧面轻轻拆下盖玻片。大多数情况下，一层薄而平整的云母会保留在盖玻片上。粘附在载玻片上的云母可重复使用（从步骤2.4开始重复操作）。</li>
	<li>通过肉眼或解剖显微镜检查表面质量，确保云母层仍附着在盖玻片上，并未在步骤2.8的剥离过程中完全脱落。用镊子或解剖针划出轻微划痕有助于区分胶水与云母，因为胶水的质地明显不同于云母。</li>
	<li>取下1.5 ml小瓶盖上的橡胶密封圈，将瓶盖倒置，用光学胶或指甲油将其粘附到表面，随后分别用紫外灯固化，或静置晾干10分钟。 
	注意：若样品需同时用于光学成像（如TIRFM或共聚焦显微镜）与AFM成像，1.5 ml小瓶盖可能过小，无法在显微镜载物台上安装AFM探头。此时可用直径更大的塑料O型圈替代该瓶盖，以适配AFM探头的安装。若实验过程中需要在不损伤云母表面的前提下移除盖子，可用硅脂代替胶水或指甲油。</li>
</ol>
3. 支持性脂质双层（SLB）的形成
<ol>
	<li>将新制备的脂质体溶液加入含有表面的腔室中。形成支持性脂双层（SLB）所需的最小体积约为 30 μl。 
	注意：有关脂质体及支持性脂双层（SLB）形成的更多细节，请参考已发表的实验方案，例如 Bag et&#160;al., 201415。</li>
	<li>按照所选实验方案进行支持性脂双层（SLB）的形成。在孵育和成像过程中，可将腔室置于加热块或加热显微镜载物台上，以维持所需温度，确保所用脂质始终高于其相变温度。</li>
</ol>

<ol><li>Giocondi, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+topography+of+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Surface topography of membrane domains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+analysis+of+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Surface analysis of membrane dynamics.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).</li>
<li>Plochberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+slows+down+the+lateral+mobility+of+an+oxidized+phospholipid+in+a+supported+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer.</a> Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).</li>
<li>El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+analysis+of+supported+lipid+bilayers+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).</li>
<li>Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+induced+phase+separation+in+supported+bilayers+of+glycosphingolipid+and+phospholipid+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures.</a> Biointerphases. 5, 120-130 (2010).</li>
<li>Strulson, M. K., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+for+creation+of+patterned+lipid+bilayers+on+tetraethylene+glycol+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).</li>
<li>Satriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+oxidized+polyhydroxymethylsiloxane--a+new+smooth+surface+for+supported+lipid+bilayer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation.</a> Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).</li>
<li>Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+and+limits+of+camera-based+fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+a+supported+lipid+bilayer+study%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%3A+a+European+Journal+of+Chemical+Physics+and+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study.</a> Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).</li>
<li>Singh, S., Keller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+of+supported+planar+membrane+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers.</a> Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).</li>
<li>Przybylo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Diffusion+in+Giant+Unilamellar+Vesicles+Is+More+than+2+Times+Faster+than+in+Supported+Phospholipid+Bilayers+under+Identical+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions.</a> Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).</li>
<li>Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+supported+lipid+bilayers%3A+influence+of+substrate+and+preparation+technique+on+the+internal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).</li>
<li>Oreopoulos, J., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+scanning+probe+and+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods. 46, 2-10 (2008).</li>
<li>Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+in+situ+total+internal+reflectance+fluorescence%2Fatomic+force+microscopy+studies+of+DPPC%2FdPOPC+microdomains+in+supported+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers.</a> J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).</li>
<li>Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+anomalous+diffusion+with+lipid+bilayer+membrane+structure+using+single+molecule+tracking+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy.</a> J Chem Phys. 134, (2011).</li>
<li>Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+diffusion+in+model+and+live+cell+membranes+characterized+by+imaging+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).</li>
<li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).</li>
<li>Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+microscopy+on+model+membranes+reveals+anomalous+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion.</a> Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).</li>
<li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackArt%3A+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7, (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种制备光滑且薄云母表面的方法，用于脂双层沉积和高分辨率成像。该技术所需的手动操作技能较少，主要涉及玻璃-云母-玻璃三明治结构的小心拆解（步骤2.8），这是获得高质量云母表面的关键步骤。在此阶段必须始终检查新解理的云母表面，因为云母有可能未发生解理而直接从光学胶上脱落，暴露出部分光学胶区域。这可能导致脂双层意外沉积在胶体上而非云母表面。根据我们获得的均匀高光学成像质量判断，采用本方法制备的云母表面在绝大多数情况下与盖玻片表面平行；因此我们认为无需额外验证。
安装腔室的最后一步可根据需要进行定制。视频教程中展示使用一个1.5 ml玻璃小瓶的塑料盖作为腔室，但也可替换为任何形状相似且尺寸合适的物体，例如在同时进行原子力显微镜-全内反射荧光显微镜/共聚焦显微镜（AFM-TIRFM/共聚焦）成像时，需确保样品及其支架能够放入AFM探头中。如果使用标准的35 mm金属细胞腔室进行成像，则可跳过定制腔室的安装步骤。但在此情况下，必须使用直径为25 mm的圆形盖玻片，并且需要更大体积的脂质体溶液以形成支持性脂双层（SLB）。
<p class="jove_c...

本实验方案的总体目标是展示一种制备云母表面的方法，用于通过光学全内反射荧光显微镜（TIRFM）或共聚焦显微镜对云母支撑的脂双层（SLBs）进行高分辨率成像，该方法也可与原子力显微镜（AFM）联用。
支撑脂双层（SLBs）被广泛用作研究脂质聚集、相分离、双层组分动力学或其与肽、蛋白质及其他化合物相互作用的模型系统1-5。根据研究性质的不同，可用于形成SLB的基底材料也有所不同（例如玻璃、云母、二氧化硅、聚合物）4,6-8。典型的膜研究依赖于基于显微镜的成像技术，如全内反射荧光显微镜（TIRFM）和原子力显微镜（AFM）。因此，对于TIRFM成像而言，通常选择玻璃表面，因为玻璃具有良好的透光性。玻璃的制备相对简便，实验结果的质量主要取决于脂质囊泡沉积前对表面的彻底清洁。由于AFM具有较高的轴向分辨率，通常需要使用云母表面。云母是一种硅酸盐矿物，具有近乎完美的基底解理特性，因此新鲜解理的云母表面在原子级别上是平坦的，能够实现对膜高度差异的观测，甚至达到亚纳米尺度9。
然而，使用荧光相关光谱（FCS）、单分子示踪（SMT）和光漂白后荧光恢复（FRAP）等方法进行的扩散研究表明，脂质膜的动力学行为在很大程度上取决于其沉积的表面类型，例如玻璃和云母可能导致显著不同的结果10,11。这些差异不仅体现在膜探针的扩散系数上，还包括检测到以不同速率扩散的多个粒子亚群，以及粒子可能在不同状态之间转换的现象。
因此，除非使用相同的表面（在本例中为云母），否则利用TIRFM和AFM技术获得的结果进行直接比较通常是困难的。尽管已有少数研究在相同的云母表面上同时进行了TIRFM和AFM双层成像12,13，但云母很少用于光学显微镜观察，主要原因是其操作上的困难。云母的制备需要手工将其切割成薄片，然后使用光学胶将其粘附到盖玻片上12。然而，该方法需要一定的操作经验才能获得理想的结果。此外，所获得的表面常常不平整且较厚，难以与工作距离短、数值孔径高的物镜配合使用。
按照本方案所述方法制备的云母表面非常薄（约220 μm，包括170 μm的盖玻片厚度），且极为平整，可避免“波浪形”形变，这对于成功实现高分辨率成像至关重要。这些表面可用于全内反射荧光显微镜（TIRFM）或共聚焦显微镜系统。此外，同一样品可转移至原子力显微镜（AFM）进行检测，甚至可同时与TIRFM/共聚焦显微镜和AFM联用成像。结合这两种技术，可实现扩散行为与双层膜结构之间的直接关联14。由于云母表面是 freshly cleaved（新鲜解理）的，因此表面洁净，无需耗时、重复性差且潜在危险的清洗步骤（玻璃清洗方案通常涉及piranha溶液、硫酸、氢氧化钠/氢氧化钾等化学品）。本方案中所述的小型腔室的安装，可将有效形成双层膜所需的囊泡体积减少至不足50 μl。最后，整个表面组装过程耗时较短（制备时间少于30分钟），且不需要传统云母解理和粘附所要求的高难度手工操作技能。

<table><tbody><tr><td>浴式超声仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15051</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24 × 50 mm - 无 H1.5</td><td>Marienfeld</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850357</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III（洗涤剂）</td><td>Hellma Analytics</td><td>320.003</td><td></td></tr><tr><td>云母 V-1 级</td><td>SPI Suppliers</td><td>1872-CA</td><td></td></tr><tr><td>光学胶粘剂（高黏度）</td><td>Norland Products</td><td>NOA63</td><td></td></tr><tr><td>光学胶粘剂（低黏度）</td><td>Norland Products</td><td>NOA60</td><td></td></tr><tr><td>鞘磷脂-ATTO647N</td><td>AttoTec</td><td>AD 647N-171</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>Synoptics Ltd.</td><td>GelVue GVM20</td><td>将灯设置为100%功率</td></tr></tbody></table>

用于高分辨率光学显微成像的云母支撑脂双层的制备

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

支撑脂双层（SLB）被广泛用作研究膜特性（如相分离、聚集、动力学）及其与其他化合物（如药物或肽）相互作用的模型。然而，SLB的特性会因所使用的支撑材料不同而有所差异。
用于SLB成像和测量的常用技术包括单分子荧光显微镜、FCS以及原子力显微镜（AFM）。由于大多数光学成像研究是在玻璃基底上进行的，而AFM则需要极为平整的表面（通常为云母），因此这些技术所得结果无法直接比较，因为基底材料的电荷和表面平整度会显著影响扩散行为。遗憾的是，将云母薄片切割并粘接到玻璃载玻片上所需的高度手动操作技巧，成为在SLB制备中常规使用云母的一大障碍。尽管这种方法是理想选择，但如此制备的云母表面往往不平整（呈波浪状），难以成像，尤其是使用工作距离短、高数值孔径物镜时更为困难。本文介绍一种简单且可重复的方法，用于制备适用于脂质囊泡沉积和SLB制备的薄而平整的云母表面。此外，我们自制的样品腔仅需极少量的囊泡即可实现SLB形成。该整体方案能够高效、简便且低成本地制备高质量的脂双层表面，其质量可与AFM研究中所使用的表面直接相比。

荧光脂质探针在支撑脂双层（SLB）中的扩散行为因基底材料的不同而有所差异。全内反射荧光显微镜（TIRFM）结合单分子示踪（SMT）技术是一种用于可视化颗粒运动并提取其扩散系数的有效方法。附带动画图展示了鞘磷脂-ATTO647N探针在玻璃和云母表面支撑的DOPC（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱）双层膜中扩散的单分子信号。云母表面按照本文所述方案进行制备。为评估光学像差，使用Mosaic 2D PSF Size ImageJ插件16,17测量并计算了20个点扩散函数（PSF）的半高全宽（FWHM）平均值。测得玻璃和云母的FWHM分别为441 nm和464 nm（图1）。在玻璃和云母上成像时，分辨率之间22 nm的差异并不显著。在这两种情况下，均可在连续帧中定位每个单荧光分子的PSF质心，并利用Mosaic Particle Tracker ImageJ插件16,17将其连接成随时间变化的颗粒轨迹。图2展示了颗粒在两种基底支撑的双层膜中扩散的代表性轨迹。在玻璃和云母支撑的DOPC膜中扩散的荧光探针的均方...

我们介绍一种制备云母支撑脂双层用于高分辨率显微镜观察的方法。云母在原子尺度上透明且平整，但由于操作困难而很少用于成像；我们的制备方法实现了云母片的均匀沉积，并减少了脂双层制备所需的材料用量。

支撑脂质双层（SLBs）被广泛用作研究膜特性（相分离、聚集、动力学）及其相互作用的模型……

本文介绍了一种制备适用于高分辨率成像（如单分子追踪研究）的云母支撑脂质双层的简便方法。通过使用光学胶将一片云母粘附在玻璃载玻片与盖玻片之间形成三明治结构，再将其剥离，从而获得平整且极薄的新鲜云母表面。通过安装由一个1.5毫升小瓶杯制成的小型塑料腔室，形成双层脂膜所需的脂质囊泡体积可低至30微升。首先，取供应商提供的多层云母片，用剪刀将其剪成较小的碎片。用新的刀片将一片云母分成两到三层较薄的薄片。然后彻底清洗盖玻片。将0.17毫米的盖玻片放入玻璃培养瓶中，每个盖玻片放入一个独立的槽位，在60°C条件下用洗涤剂超声处理30分钟。清洗盖玻片。用微量水清洗10至20次，并用气流或氮气吹干。取一张显微镜载玻片，用丙酮清洁。在显微镜载物台上滴加约15微升低粘度光学胶，然后将眼球预先放置其上。将切开的叶片置于紫外光箱中数分钟。使用透明胶带剥离少量云母层。最初的几层会呈碎片状，因此需重复操作，直至观察到附着在透明胶带上的各层均匀且完整地覆盖胶带。在 Micah 表面滴加一滴高黏度光学胶。确保表面无气泡。将洁净的盖玻片轻轻放置在胶滴上。使用镊子轻轻敲击玻璃，以铺展 ahe。再次用紫外光照射数分钟，使粘合剂固化。使用刀具将由玻璃组成的三明治结构切开。滑动云母片并覆盖睡眠盖片。大多数情况下，仅有极薄的一层云母会粘附在睡眠盖片上。使用解剖显微镜，用针尖或镊子尖轻轻划出微小划痕，以检查云母表面。你可以轻松判断表面是否为真正的云母：如果表面被均匀划伤，如这里的区域，或像此处光学胶表面呈现光泽，则可加以区分。取一个1.5毫升玻璃小瓶的瓶盖，去除悬臂上的气体卡，然后使用指甲油将瓶盖粘附到云母表面。静置数分钟使其干燥。现在，您可以按照此处的标准方案，通过逐层堆叠的方式制备脂双层修复脂膜。将 30 微升脂质体液滴加入小瓶盖腔室中，并在更换缓冲液前孵育 60 分钟。洗涤后，样品即可用于成像。在此情况下，样品被安装到定制的样品台中。单个分子可以很容易地在制备好的云母表面上观察到。在此，我们比较了玻璃和云母支撑的 A-D-O-P-C 单层。请注意，这两种表面上的运动类型存在显著差异。右侧图中以不同颜色标记的单个分子运动轨迹清楚地表明，MICA 表面上的扩散行为与玻璃表面上的不同。然而，成像质量之间没有显著差异。20个位点的直线函数在半高最大强度处的平均宽度在两种基底上几乎相同，表明MICA表面可被光完全穿透，且不会引入明显的光学像差。总体而言，MSDS在扩散行为上表现出明显差异。然而，在每种情况下，均可观察到以不同速率扩散的两类颗粒群体。从累积平方位移概率的双指数拟合中提取出两个不同的扩散系数：快速和慢速。对于该 DOPC 双层膜，MICA 表面上的两种扩散组分均更快，MICA 上慢速运动的颗粒比快速组分慢约 10 到 20 倍。然而，玻璃表面上的慢速组分几乎接近静止。我们发现，表面类型可能会影响脂双层的扩散行为。因此，在比较不同基底上支撑脂双层的研究结果时需格外谨慎，例如云母与玻璃之间的比较。由于制备过程复杂，在云母上成像脂双层通常相当困难；然而，我们展示了一种简单而有效的方法，可用于制备此类高质量表面。

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生物工程

支持的脂双层云母制备的高分辨率光学显微成像

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用于免疫突触与运动突触研究的支撑性平面双层膜的构建

在本视频中，我们演示一种在玻璃支撑脂双层上研究 septin 组织结构的方法 体外...

平面支撑脂双层实验：一种基于显微镜的体外技术，用于研究Septin在生物膜模拟物上的组装

我们介绍一种制备支撑脂双层的方案，并利用原子力显微镜和力谱技术对其进行表征。...

原子力显微镜成像与支持性脂双层的力谱分析

我们提出了一种在固体基底上形成支持性脂双层的实验方案，该方法无需使用脂质体。我们展示了一种一步法，可在二氧化硅和金表面形成脂双层，并可制备富含胆固醇结构域的支持性膜，适用于多种生物应用。...

利用溶剂辅助脂质双层（SALB）法构建生物膜

本文展示了蛋白质功能化的平面玻璃支持脂双层的制备、蛋白质在脂双层内的流动性测定以及蛋白质密度的测量方法。同时概述了构建低噪声全内反射显微镜的路线图，该显微镜能够以高时空分辨率对脂双层中单个荧光染料分子进行可视化观察。...

单分子荧光显微镜在平面支撑双层膜上的应用

本方案描述了模拟细胞的单脂质和多脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层的制备方法。这些 体外 模型可进行调整以包含多种脂质类型，并可用于研究各种分子和大分子间的相互作用。...

用于研究分子相互作用的模拟细胞支撑及悬浮脂双层模型的构建

数十年来，脂质单层膜一直被用作形成二维（2D）蛋白质晶体以进行结构研究的基础。它们在空气-水界面处稳定，可作为电子成像的薄层支撑材料。本文介绍了制备用于生物学研究的脂质单层膜的成熟步骤。...

使用脂单层法进行电子晶体学研究的样品制备

本方案描述了支撑脂双层的形成，以及细胞骨架丝和马达蛋白的添加，用于通过荧光显微镜研究重建的膜锚定细胞骨架网络的动力学。...

在支撑脂双层上重建膜锚定的最小肌动蛋白皮层

本文介绍了一种利用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜技术，在人工拥挤的脂质膜上对单个分子的结合、运动性和组装行为进行观测与分析的实验方案。...

单分子在聚合物拥挤的脂质膜上的扩散与组装

本方案描述了如何使用全内反射荧光显微镜（TIRF）追踪支撑脂质膜中的单个离子通道并测定其活性，从而阐明侧向膜运动与通道功能之间的相互作用。方案详细介绍了如何制备膜样品、记录数据以及分析结果。...

使用全内反射荧光显微技术对脂双层中单分子侧向迁移及离子通道活性进行成像

本文详细介绍了如何制备用于固相支撑脂双层中单蛋白追踪的样品。同时阐述了一种具有单分子灵敏度和高帧率的简易荧光显微镜。最后，我们概述了提取单蛋白轨迹的实验步骤。...

使用荧光显微镜追踪脂双层中的单个蛋白质

学习制备云母支撑脂双层的简易方法，仅需30微升脂质囊泡即可形成高质量膜结构。该技术适用于高分辨率显微成像和单分子追踪研究，为生物物理学与神经科学研究提供稳定可靠的实验平台。

用于高分辨率光学显微成像的云母支撑脂双层的制备

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