用于高分辨率光学显微成像的云母支撑脂双层的制备

本文介绍了一种制备适用于高分辨率成像（如单分子追踪研究）的云母支撑脂质双层的简便方法。通过使用光学胶将一片云母粘附在玻璃载玻片与盖玻片之间形成三明治结构，再将其剥离，从而获得平整且极薄的新鲜云母表面。通过安装由一个1.5毫升小瓶杯制成的小型塑料腔室，形成双层脂膜所需的脂质囊泡体积可低至30微升。

首先，取供应商提供的多层云母片，用剪刀将其剪成较小的碎片。用新的刀片将一片云母分成两到三层较薄的薄片。然后彻底清洗盖玻片。

将0.17毫米的盖玻片放入玻璃培养瓶中，每个盖玻片放入一个独立的槽位，在60°C条件下用洗涤剂超声处理30分钟。

清洗盖玻片。用微量水清洗10至20次，并用气流或氮气吹干。取一张显微镜载玻片，用丙酮清洁。

在显微镜载物台上滴加约15微升低粘度光学胶，然后将眼球预先放置其上。将切开的叶片置于紫外光箱中数分钟。使用透明胶带剥离少量云母层。

最初的几层会呈碎片状，因此需重复操作，直至观察到附着在透明胶带上的各层均匀且完整地覆盖胶带。

在 Micah 表面滴加一滴高黏度光学胶。确保表面无气泡。将洁净的盖玻片轻轻放置在胶滴上。

使用镊子轻轻敲击玻璃，以铺展 ahe。再次用紫外光照射数分钟，使粘合剂固化。使用刀具将由玻璃组成的三明治结构切开。

滑动云母片并覆盖睡眠盖片。大多数情况下，仅有极薄的一层云母会粘附在睡眠盖片上。使用解剖显微镜，用针尖或镊子尖轻轻划出微小划痕，以检查云母表面。

你可以轻松判断表面是否为真正的云母：如果表面被均匀划伤，如这里的区域，或像此处光学胶表面呈现光泽，则可加以区分。取一个1.5毫升玻璃小瓶的瓶盖，去除悬臂上的气体卡，然后使用指甲油将瓶盖粘附到云母表面。静置数分钟使其干燥。

现在，您可以按照此处的标准方案，通过逐层堆叠的方式制备脂双层修复脂膜。将 30 微升脂质体液滴加入小瓶盖腔室中，并在更换缓冲液前孵育 60 分钟。洗涤后，样品即可用于成像。

在此情况下，样品被安装到定制的样品台中。单个分子可以很容易地在制备好的云母表面上观察到。在此，我们比较了玻璃和云母支撑的 A-D-O-P-C 单层。

请注意，这两种表面上的运动类型存在显著差异。右侧图中以不同颜色标记的单个分子运动轨迹清楚地表明，MICA 表面上的扩散行为与玻璃表面上的不同。然而，成像质量之间没有显著差异。

20个位点的直线函数在半高最大强度处的平均宽度在两种基底上几乎相同，表明MICA表面可被光完全穿透，且不会引入明显的光学像差。总体而言，MSDS在扩散行为上表现出明显差异。然而，在每种情况下，均可观察到以不同速率扩散的两类颗粒群体。

从累积平方位移概率的双指数拟合中提取出两个不同的扩散系数：快速和慢速。对于该 DOPC 双层膜，MICA 表面上的两种扩散组分均更快，MICA 上慢速运动的颗粒比快速组分慢约 10 到 20 倍。然而，玻璃表面上的慢速组分几乎接近静止。

我们发现，表面类型可能会影响脂双层的扩散行为。因此，在比较不同基底上支撑脂双层的研究结果时需格外谨慎，例如云母与玻璃之间的比较。由于制备过程复杂，在云母上成像脂双层通常相当困难；然而，我们展示了一种简单而有效的方法，可用于制备此类高质量表面。