应用荧光纳米颗粒研究细胞内细菌对内体-溶酶体系统的重塑

本实验的总体目标是利用荧光纳米颗粒作为示踪剂，研究细胞内细菌对晚期内体-溶酶体系统的重塑作用。首先将HeLa细胞接种于八孔腔室载玻片中，并过夜培养。第二步是用沙门氏菌（Salmonella）和志贺氏菌（Shigella）感染细胞。

接下来，通过将感染的宿主细胞与金标记的BSA Rumine纳米颗粒共孵育，进行脉冲-追踪标记实验。最后一步是利用共聚焦显微镜观察宿主细胞内涵体系统的改变。最终，使用MRS软件包对纳米颗粒在细胞内的分布进行定量分析。

与现有的免疫显微技术相比，该技术的主要优势在于能够分析未感染的细胞，从而深入了解泰里卡（terica）的胞内生活方式。然而，该方法也可应用于其他胞内病原体，如盖亚属（Gaia species）、埃拉增殖体（Ella Prolia）或结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis）。此外，该方法还可适用于其他宿主细胞类型，如巨噬细胞、细胞系或原代细胞。

合成10纳米金纳米颗粒（NPS）需要两种溶液：溶液A和溶液B。制备溶液A时，将2毫升1%的氯金酸水溶液加入160毫升Milli-Q水中。制备溶液B时，将8毫升1%的柠檬酸三钠二水合物溶液和160微升1%的单宁酸溶液加入32毫升Milli-Q水中。将溶液A和溶液B加热至60摄氏度，然后在搅拌条件下混合。

大约15分钟后应立即观察到深蓝色。此时溶液应变为红色。将溶液加热至95摄氏度。

在 95 摄氏度下保持五分钟，然后将溶液冷却至室温。通过向 1.5 毫升离心管中加入 900 微升金 MPS 并在 15,000 ×g 下离心 30 分钟，制备用于包被和标记的金颗粒。弃去上清液，并将沉淀重悬于 900 微升灭菌 MQ 水中。

加入100 µL的BSA溶液，并在800 RPM下涡旋混匀30分钟。将样品在4 °C条件下以15,000 ×g离心60分钟，去除多余的BSA。弃去上清液，将金-BSA纳米颗粒重悬于125 µL的PBS中。

加入12.5 µL的一摩尔碳酸氢盐。R domine n 羟基CIN酯或NHS溶液需在使用前立即用DMSO配制。取15 µL的R DOMINE N-H-S-D-M-S-O溶液加入0.5 mL的金-BSA纳米颗粒悬液中使用。

将反应液在室温下孵育两小时，同时以800 RPM转速混匀，并避免光照。接下来，将金-BSA RUMINE NPS在4°C条件下通过透析法用PBS缓冲液纯化，36至48小时内更换五次缓冲液。纯化后，向每1毫升金-BSA RUMINE NPS中加入10微升BSA-PBS，以稳定NPS并去除游离或释放的BSA RUMINE，随后在4°C下以15,000 ×g离心16分钟。离心后，将沉淀重悬于含2毫克/毫升BSA-PBS的溶液中，并在520纳米波长处测定光密度（OD520）。

将金-BSA Rod Domine NPS 在 4°C 下避光保存。本实验所用的 HeLa 细胞永久表达一种带有绿色荧光蛋白标签的溶酶体糖蛋白 LAMP1-GFP，并在含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，于 37°C、含 5% 二氧化碳的环境中培养。以每孔 50,000 个细胞的密度将细胞接种至八孔腔室载玻片中，过夜培养。用于感染 HeLa 细胞的细菌为人胃肠道病原体 Salmonella enterica。作为对照，使用两种突变菌株进行比较。

三种菌株均含有一个用于组成型表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP）的质粒，并在含有相应抗生素的LB液体培养基中培养，以维持各菌株中质粒的稳定性。取单个细菌菌落接种于3毫升含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C过夜培养。次日在振荡条件下进行通气培养，将每种菌液按1:31比例稀释至新鲜LB液体培养基中，继续培养3.5小时。

开始此实验步骤时，测定亚培养细菌的 OD 600 值，并稀释至 OD 600 为 0.2。在 1 毫升 PBS 中加入适量细菌，接种到 12 孔板中的 HeLa 细胞，使感染复数达到 100。在细胞培养箱中孵育 30 分钟。

用 PBS 清洗 HeLa 细胞三次，以去除未被内化的细菌。此时间点设定为感染后零小时（即零小时 pi）。向细胞中加入 300 微升含有 100 微克/毫升庆大霉素的新鲜培养基，并维持一小时。

一小时后，将培养基更换为含有 10 微克/毫升庆大霉素的成像培养基。向 HeLa 细胞中加入金标记 BSA 鲁米诺 NPS，使其终浓度达到 OD520 为 0.1。

孵育一小时后，再继续孵育一小时。移除培养基，用PBS洗涤三次。最后加入300微升新鲜成像培养基，其中含有10% FCS和10微克/毫升庆大霉素。

在剩余的孵育时间内，使用共聚焦成像系统（例如带有加湿环境腔室的共聚焦激光扫描显微镜或转盘式显微镜）对细胞在不同时间点进行高分辨率成像，开启温控系统并等待其温度稳定。优化成像参数，包括放大倍数、扫描速度、分辨率和Z轴步进大小。在感染后的指定时间点，针对GFP和金标记BSA荧光NPS采用适当的激发和发射设置。

将含有感染细胞的12孔腔室载玻片置于显微镜载物台上，采集图像以分析沙门氏菌对内体系统的重塑作用。使用图像分析软件，在Surpass视图的对象工具栏中点击“打开”并选择文件来载入数据。

单击图标以添加新的表面项。要分析感兴趣区域（ROI），请仅选择感兴趣区域，然后单击“下一步”作为源通道。选择通道三。

选中平滑选项可设置生成区域的平滑程度。可手动定义数值，或接受系统自动生成的数值。适用于阈值处理。

选择阈值调整的绝对强度选项。选择手动选项，并在查看区域中设置一个数值。表面阈值预览将以灰色显示。

单击“分类表面”选项卡中的下一步。所得表面可通过多种条件进行筛选。默认筛选条件为V型孔数量大于10，也可通过单击“添加”包含其他筛选条件。

在此示例中，使用默认滤波器完成曲面创建。在对象列表中单击“完成”。取消勾选“体积”项目对应的复选框。

现在在查看区域中显示了一个新创建的表面。以红色标注，通过点击保存将统计结果导出至 Excel 文件。本方案合成的金纳米颗粒呈准球形，尺寸约为 10 纳米。

BSA 涂层和 rho 结构域标记不影响其形态或大小。为研究细胞内沙门氏菌对宿主细胞内涵体系统的重塑作用，用野生型沙门氏菌或两种突变株对 HeLa 细胞进行模拟感染或感染，并用 10 纳米金颗粒进行脉冲追踪。

在未感染的细胞中，BSA棒状结构域与核周颗粒（n peas）共定位，核周颗粒（NPS）均匀分布于晚期内体或溶酶体中。相比之下，在感染野生型沙门氏菌8小时后的细胞中，NPS发生了显著重排。沙门氏菌诱导形成了稳定的丝状结构网络（sifts），大多数mps聚集在这些管状结构内。

感染后八小时，突变菌株表现出明显不同的行为。SSAV 突变菌株被限制在含有沙门氏菌的 VAE 或 SCV 内。尽管没有形成 sif 结构，大部分 mps 仍位于游离的晚期内体或溶酶体中。

沙门氏菌突变株逃逸至细胞质中，且未观察到NPS与细菌之间的关联。当检测沙门氏菌感染不同阶段内溶酶体系统的可及性时，结果显示，在所有情况下，大部分内化的NPS均积聚在SCV或SIFs中。在此步骤之后，可进行其他方法，如透射电子显微镜观察。

这可能回答一些额外的问题，例如某些纳米颗粒感染的宿主细胞中的超微结构或膜区室。观看本视频后，您应能充分了解如何制备荧光纳米颗粒。这些颗粒可用于标记由胞内沙门氏菌修饰的宿主细胞区室。