Name: 通过胞内细菌，研究内溶酶体系统的改造荧光纳米粒子中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 探索利用荧光纳米颗粒示踪技术研究胞内细菌对宿主细胞内溶酶体系统的改造机制。该方法结合活细胞成像与MRS软件定量分析，为研究沙门氏菌等胞内病原体的宿主相互作用提供了新工具。

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本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）资助，项目编号为Sonderforschungsbereich 944“细胞微区室的生理学与动态”中的Z项目，以及优先计划1580中的HE1964/18项目。

1. 10 nm 金纳米颗粒（Gold NPs）的合成15
<ol>
	<li>配制溶液A：将2 ml 1%氯金酸水溶液加入160 ml Milli-Q水或重蒸馏水中。</li>
	<li>制备溶液B：加入8 ml 1% 三水合柠檬酸三钠2O 和 160 µl 1% 鞣酸溶于32 ml Milli-Q水或双蒸水中。</li>
	<li>将溶液 A 和 B 加热至 60 °C 搅拌下混合，立即观察到深蓝色，约15分钟后观察到红色。随后加热至 95°C，静置5分钟，将溶液冷却至室温。</li>
	<li>将一滴纳米颗粒悬浮液滴加到碳支持膜上，自然晾干。通过透射电子显微镜观察纳米颗粒的尺寸和形貌。</li>
</ol>
2. 采用牛血清白蛋白（BSA）包被金纳米颗粒并用罗丹明N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）16进行标记
<ol>
	<li>取900 μl金纳米颗粒（gold NPs）加入1.5 ml离心管中，在15,000 × g条件下离心30分钟。可选：可同时准备多个样品管。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀用900 μl灭菌的Milli-Q水重悬，并加入100 μl浓度为2 mg/ml的BSA/PBS溶液，在涡旋振荡器上以800 rpm混合30分钟。</li>
	<li>为去除过量BSA，将样品在15,000 × g条件下离心60分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将金-BSA纳米颗粒用125 μl PBS重悬，加入12.5 µl的1 M碳酸氢盐缓冲液。</li>
	<li>使用前立即配制10 mg/ml的罗丹明NHS/DMSO溶液，取30 µl该溶液加入1 ml金-BSA纳米颗粒悬液中。在室温下以800 rpm持续混合反应2小时（或过夜），避免光照。</li>
	<li>将金-BSA-罗丹明纳米颗粒在4 ºC条件下用PBS进行透析纯化，36–48小时内更换缓冲液5次。</li>
	<li>为稳定纳米颗粒，向每1 ml金-BSA-罗丹明纳米颗粒中加入10 μl浓度为200 mg/ml的BSA/PBS溶液。为去除游离或未结合的BSA-罗丹明，于15,000 × g离心60分钟。将沉淀重悬于2 mg/ml BSA/PBS溶液中，测定OD520，避光保存于4 °C。</li>
	<li>用Milli-Q水或双蒸水将纳米颗粒稀释10倍，取一滴样品滴加至碳支持膜载网上，自然晾干。通过透射电子显微镜（TEM）检测纳米颗粒的粒径与形貌。 
	注意：纳米颗粒制备过程中所用所有材料均经过灭菌处理，操作在细胞培养超净台内或火焰旁的实验台上进行。</li>
</ol>
3. 培养 HeLa 细胞
<ol>
	<li>稳定表达 LAMP1-GFP 的 HeLa 细胞在含有 10% 胎牛血清（FCS）的 DMEM 培养基中培养，并于含 5% CO2 的环境中在 37 °C 下生长。</li>
	<li>将细胞以每孔 50,000 的密度接种至 8 孔腔室载玻片（Ibidi）中，并过夜培养。</li>
</ol>
4. 细菌培养
<ol>
	<li>使用 沙门氏菌肠亚种 血清型 Typhimurium NCTC 12023 野生型（WT）菌株。作为对照，使用突变菌株 ΔssaV SPI2-T3SS 缺陷且 ΔsifA 缺乏形成SIF的关键效应蛋白SifA。使用含有质粒pFPV25.1的菌株以实现增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP）的组成型表达。 
	注意：细菌菌株通常在添加了的Luria-Bertani培养基（LB）中常规培养 50 µg/ml 羧苄青霉素（WT）和添加物的LB培养基 50 µg/ml 羧苄青霉素和/或 50 µg/ml 卡那霉素（ΔssaV，ΔsifA) 以维持质粒所需。</li>
	<li>接种单个细菌菌落于3 ml含有适当抗生素的LB培养基中，37 ºC振荡培养过夜以实现通气，随后以1:31比例转接至新鲜LB培养基，继续培养3.5小时。此时，菌液达到对数生长后期，细菌具有高度侵袭性。使用“滚筒摇床”孵育试管培养物可方便实现通气培养。</li>
</ol>
5. 感染HeLa细胞 沙门氏菌 金-BSA-罗丹明纳米颗粒脉冲追踪标记（示意图见图1）
<ol>
	<li>测定继代培养细菌的OD600值，并用1 ml PBS稀释至OD600 = 0.2（约3 × 108 cfu/ml），按感染复数（MOI）为100的比例将适量细菌加入8孔腔室载玻片中的HeLa细胞中。</li>
	<li>在细胞培养箱中孵育30分钟，用PBS洗涤3次以去除未被内化的细菌（此时间点定义为感染后0小时，即0 hr p.i.）。加入300 µl含100 µg/ml庆大霉素的新鲜培养基，继续孵育1小时。随后更换为含10 µg/ml庆大霉素的新鲜培养基，并在后续孵育期间维持该浓度。</li>
	<li>在含100 µg/ml庆大霉素的培养基中孵育1小时后，更换为成像培养基（不含FCS、L-谷氨酰胺、酚红和碳酸氢钠的Eagle's MEM，添加30 mM HEPES，pH 7.4），其中含10 µg/ml庆大霉素。向HeLa细胞中加入金-BSA-罗丹明纳米颗粒（Gold-BSA-rhodamine NPs），使其终浓度达到OD520 = 0.1。 
	注意：Gold-BSA-rhodamine NPs也可在感染前或感染后不同时间点加入细胞。</li>
	<li>孵育1小时后，移除培养基，用PBS洗涤3次，再加入300 µl含10% FCS和10 µg/ml庆大霉素的新鲜成像培养基，继续后续孵育。 
	注意：孵育时间可根据纳米颗粒浓度和所用细胞系的不同而调整。对于RAW264.7巨噬细胞，我们观察到在OD520 = 0.05的浓度下孵育30分钟即可实现充分的内化。</li>
</ol>
6. 成像
<ol>
	<li>使用共聚焦成像系统，例如带有加湿环境腔室的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或转盘（SD）显微镜，以在不同时间点进行高分辨率成像。</li>
	<li>开启温控系统，并等待其温度稳定。优化成像参数，如放大倍数、扫描速度、分辨率、Z轴步进等。针对GFP和金-BSA-罗丹明纳米颗粒（NPs）设置合适的激发/发射波长。在本方案中，采用400 Hz的扫描速度、512 × 512像素的分辨率以及0.25 µm的Z轴步进。分别使用氩离子激光器（488 nm）激发GFP，使用氦氖激光器（543 nm）激发金-BSA-罗丹明。添加明场（BF）通道以观察细胞形态。对于其他显微系统或感染条件，需相应调整参数。 
	注意：使用相同的氩离子激光器作为明场通道的光源，并通过光电倍增管（PMT）检测器采集信号。</li>
	<li>在指定的感染后时间点，将含有感染细胞的8孔腔室载玻片置于显微镜载物台上，并采集图像。</li>
</ol>
7. 图像分析
<ol>
	<li>使用显微图像分析软件（参见材料与设备表）分析细胞内沙门氏菌（Salmonella）对内体-溶酶体系统的重塑。点击“打开”并选择文件以载入数据。 
	注：也可使用开源软件包（如 ImageJ 或 FIJI）进行定量图像分析。</li>
	<li>在 Surpass 视图的对象工具栏中，点击图标<img alt="H₂的分子轨道图，展示量子化学中的成键与反键轨道。" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Icon">以添加新的表面项。然后点击<img alt="静力平衡图，ΣFx=0，力学系统，力平衡，物理教学，矢量分析" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Icon">（下一步）。</li>
	<li>如需分析感兴趣区域（ROI），请选择并划分一个 ROI。在视图区域中，图像上叠加的矩形边框部分即代表 ROI。在相应的 x、y 和 z 字段中输入数值，或直接点击预览矩形中的箭头来调整 ROI 的大小和位置。然后点击<img alt="静力平衡图，ΣFx=0，力学系统，力平衡，物理教学，矢量分析" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Icon">（下一步）。</li>
	<li>选择通道 3 作为源通道（金-BSA-罗丹明纳米颗粒信号）。勾选“平滑”选项以设置生成区域的平滑度。可手动定义数值，或接受系统自动生成的数值。对于阈值，选择“绝对强度”选项。</li>
	<li>在阈值调整中，选择“手动”模式并设定一个数值。在视图区域中，将以灰色显示表面阈值的预览效果。</li>
	<li>在“分类表面”选项卡中，可根据多种标准对生成的表面进行筛选。默认筛选条件为“体素数量 &gt;10”，也可通过点击“添加”加入其他筛选条件。若无需筛选，则点击删除按钮移除所有筛选条件。然后点击<img alt="静力平衡图，ΣFx=0，力学系统，力平衡，物理教学，矢量分析" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Icon">（下一步）。</li>
	<li>完成表面创建时，点击<img alt="静力平衡图；方程 ΣFx=0，ΣFy=0；杠杆系统分析；物理教学。" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Icon">（完成）。在对象列表中，取消勾选“体积”项，新创建的表面将在视图区域中显示。</li>
	<li>导出统计数据。此时，在 Surpass 视图中，对象的颜色将根据其面积从紫色到红色变化。“面积编号图”表格将显示统计信息（例如，对象的编号和面积）。通过点击<img alt="光谱学图示：光学数据记录；蓝色光盘，数字存储表示。" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Icon">（保存），将表面 1 的所有统计数据导出至 Excel 文件。</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

哺乳动物细胞的内体-溶酶体系统调控着多种重要的生理过程，包括营养吸收、激素介导的信号转导、免疫监视以及抗原呈递17。迄今为止，已有多种标记物被用于内吞途径的标记和示踪研究。例如，LysoTracker探针是由Molecular Probes（Life Technologies，美国）开发的一类荧光酸嗜性探针，可用于溶酶体标记，其能够在细胞内低pH区室中选择性积累，并在纳摩尔浓度下有效标记活细胞18。然而，LysoTracker探针与细胞长时间孵育可能引起溶酶体pH升高，从而导致溶酶体潜在的生理变化19。一些大分子生物分子，如荧光标记的葡聚糖，也常被用于内体/溶酶体的标记。但其光稳定性差、循环寿命短以及固定过程中保留效果不佳，限制了其在长期活细胞成像和相关显微镜研究中的应用16,19。本研究中，采用金-BSA-罗丹明纳米颗粒（gold-BSA-rhodamine NPs）作为流体示踪剂来标记宿主细胞的内体-溶酶体系统，观察到高效的摄取效率和强烈的细胞内荧光信号。纳米颗粒与溶酶体相关膜蛋白LAMP1（在晚期内体/溶酶体膜上高度富集）几乎完全共定位，证实了...

荧光纳米颗粒（NPs），包括金属纳米颗粒、量子点、聚合物纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、碳点 等等。在过去的几十年中，引起了广泛关注1,2与传统有机染料相比，荧光纳米颗粒表现出理想的化学、光学和机械性能，例如信号强度高、抗光漂白性强以及生物相容性高。3,4这些优势使它们成为细胞内传感和活细胞成像的首选方法。此外，多种电子致密纳米颗粒在电子显微镜（EM）下可见，便于用于关联显微分析，从而可将活细胞示踪与光学显微镜（LM）相结合，并利用EM在超微结构水平上实现更高分辨率的观察5例如，金纳米颗粒长期以来被高效地用作活细胞中的生物传感器，以实现高灵敏度的诊断，同时也广泛应用于免疫标记领域。6近期研究表明，不同尺寸和形状的金纳米颗粒可被多种细胞系有效摄取，并常规通过内体途径转运，因此在细胞内囊泡运输示踪及内体-溶酶体系统标记方面具有巨大应用潜力7,8.
微生物病原体，例如 鼠伤寒沙门氏菌, 志贺氏菌 flexneri 和 单核细胞增生李斯特菌，已进化出不同的机制以侵入非吞噬性宿主细胞9病原体被内化后，无论存在于细胞质中还是被隔离在膜结合区室内，都会与其宿主环境广泛相互作用，并调控这些环境以利于自身的存活。10例如， 肠道沙门氏菌 存在于并复制于一种称为胞内吞噬体区室的结构中 沙门氏菌含液泡（SCV）在感染过程中11成熟的 SCV 向高尔基体运输，持续与内吞途径相互作用，并诱导形成广泛的管状结构，例如 沙门氏菌诱导的细丝（SIF）、分选连接蛋白小管 沙门氏菌诱导的分泌载体膜蛋白3（SCAMP3）小管， 等等。12-14研究这些细菌病原体如何操控宿主细胞通路，对于理解传染病至关重要。
本研究中，采用金-牛血清白蛋白-罗丹明纳米颗粒（gold-BSA-rhodamine NPs）作为流体示踪剂标记宿主细胞的内体-溶酶体系统，并以人胃肠道病原体肠炎沙门氏菌鼠伤寒血清型（Salmonella enterica serovar Typhimurium，简称Salmonella）作为模式细菌，研究该病原体与宿主内吞途径的相互作用。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对未感染细胞以及感染了野生型Salmonella或突变株的细胞中的胞内金-BSA-rhod明纳米颗粒进行成像。随后使用Imaris软件定量分析纳米颗粒的分布情况，结果表明Salmonella感染可诱导内体/溶酶体发生显著重排。在本方法描述的基础上，可设计类似实验以追踪内化纳米颗粒的长期命运，并探究各种外源物质或内源因子对真核细胞内吞途径的影响。

<table><tbody><tr><td>氯金酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>单宁酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>三钠柠檬酸盐</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NHS-罗丹明</td><td>Pierce</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Applichem</td><td>A1492</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Roth</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>8孔细胞培养板</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>经组织培养处理，无菌</td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Bitplane</td><td>version 7.6</td><td>提供多种配置</td></tr></tbody></table>

应用荧光纳米颗粒研究细胞内细菌对内体-溶酶体系统的重塑

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

具有理想化学、光学和机械性能的荧光纳米颗粒（NPs）是标记细胞内细胞器的有力工具。本文介绍一种利用金-BSA-罗丹明纳米颗粒标记真核细胞内溶酶体系统，并监测胞内病原体对宿主细胞通路调控作用的方法 沙门氏菌肠炎亚种纳米颗粒被HeLa细胞迅速内化，并定位于晚期内体/溶酶体中。 沙门氏菌 感染诱导囊泡重排及纳米颗粒在其中的聚集 沙门氏菌-诱导膜结构。我们使用 Imaris 软件包对共聚焦显微镜图像进行定量分析。未感染细胞中的物体数量及其大小分布与感染细胞中的明显不同。 沙门氏菌-感染细胞，表明野生型病毒对内体-溶酶体系统造成了极度重塑 沙门氏菌.

金纳米颗粒通过柠檬酸钠和单宁酸还原氯金酸的经典方法制备而成。如图2A所示，合成的金纳米颗粒呈准球形，尺寸约为10 nm。牛血清白蛋白（BSA）包覆和罗丹明标记未对其形貌或尺寸产生影响（图2B）。
据报道，金纳米颗粒（NPs）可被多种哺乳动物细胞迅速摄取，并最终进入内吞系统7。与先前研究一致，在HeLa细胞与金-BSA-罗丹明纳米颗粒共孵育1小时后，观察到明显的红色荧光信号（图3，WT 感染后5小时），表明纳米颗粒被细胞有效内化。大多数红色信号与绿色信号共定位，显示纳米颗粒被限制在晚期内体或溶酶体中。然而，与未感染细胞中纳米颗粒在晚期内体/溶酶体中的均匀分布不同（图3，模拟感染组），在野生型Salmonella感染的细胞中，其分布位置发生了显著重排。在感染早期（图3，WT 感染后5小时），Salmonella在SCV内复制，SIF发生快速延伸或收缩运动。在此时...

本文介绍了纳米颗粒（NPs）的合成及其荧光标记方法。这些纳米颗粒被用于脉冲-追踪实验，以标记真核细胞的内体-溶酶体系统。通过活细胞成像并进行定量分析，追踪了胞内病原体Salmonella enterica对内体-溶酶体系统的调控作用。

具有理想化学、光学和机械性能的荧光纳米颗粒（NPs）是标记细胞内细胞器的有力工具。本文中，我们……

本实验的总体目标是利用荧光纳米颗粒作为示踪剂，研究细胞内细菌对晚期内体-溶酶体系统的重塑作用。首先将HeLa细胞接种于八孔腔室载玻片中，并过夜培养。第二步是用沙门氏菌（Salmonella）和志贺氏菌（Shigella）感染细胞。接下来，通过将感染的宿主细胞与金标记的BSA Rumine纳米颗粒共孵育，进行脉冲-追踪标记实验。最后一步是利用共聚焦显微镜观察宿主细胞内涵体系统的改变。最终，使用MRS软件包对纳米颗粒在细胞内的分布进行定量分析。与现有的免疫显微技术相比，该技术的主要优势在于能够分析未感染的细胞，从而深入了解泰里卡（terica）的胞内生活方式。然而，该方法也可应用于其他胞内病原体，如盖亚属（Gaia species）、埃拉增殖体（Ella Prolia）或结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis）。此外，该方法还可适用于其他宿主细胞类型，如巨噬细胞、细胞系或原代细胞。合成10纳米金纳米颗粒（NPS）需要两种溶液：溶液A和溶液B。制备溶液A时，将2毫升1%的氯金酸水溶液加入160毫升Milli-Q水中。制备溶液B时，将8毫升1%的柠檬酸三钠二水合物溶液和160微升1%的单宁酸溶液加入32毫升Milli-Q水中。将溶液A和溶液B加热至60摄氏度，然后在搅拌条件下混合。大约15分钟后应立即观察到深蓝色。此时溶液应变为红色。将溶液加热至95摄氏度。在 95 摄氏度下保持五分钟，然后将溶液冷却至室温。通过向 1.5 毫升离心管中加入 900 微升金 MPS 并在 15,000 ×g 下离心 30 分钟，制备用于包被和标记的金颗粒。弃去上清液，并将沉淀重悬于 900 微升灭菌 MQ 水中。加入100 µL的BSA溶液，并在800 RPM下涡旋混匀30分钟。将样品在4 °C条件下以15,000 ×g离心60分钟，去除多余的BSA。弃去上清液，将金-BSA纳米颗粒重悬于125 µL的PBS中。加入12.5 µL的一摩尔碳酸氢盐。R domine n 羟基CIN酯或NHS溶液需在使用前立即用DMSO配制。取15 µL的R DOMINE N-H-S-D-M-S-O溶液加入0.5 mL的金-BSA纳米颗粒悬液中使用。将反应液在室温下孵育两小时，同时以800 RPM转速混匀，并避免光照。接下来，将金-BSA RUMINE NPS在4°C条件下通过透析法用PBS缓冲液纯化，36至48小时内更换五次缓冲液。纯化后，向每1毫升金-BSA RUMINE NPS中加入10微升BSA-PBS，以稳定NPS并去除游离或释放的BSA RUMINE，随后在4°C下以15,000 ×g离心16分钟。离心后，将沉淀重悬于含2毫克/毫升BSA-PBS的溶液中，并在520纳米波长处测定光密度（OD520）。将金-BSA Rod Domine NPS 在 4°C 下避光保存。本实验所用的 HeLa 细胞永久表达一种带有绿色荧光蛋白标签的溶酶体糖蛋白 LAMP1-GFP，并在含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，于 37°C、含 5% 二氧化碳的环境中培养。以每孔 50,000 个细胞的密度将细胞接种至八孔腔室载玻片中，过夜培养。用于感染 HeLa 细胞的细菌为人胃肠道病原体 Salmonella enterica。作为对照，使用两种突变菌株进行比较。三种菌株均含有一个用于组成型表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP）的质粒，并在含有相应抗生素的LB液体培养基中培养，以维持各菌株中质粒的稳定性。取单个细菌菌落接种于3毫升含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37°C过夜培养。次日在振荡条件下进行通气培养，将每种菌液按1:31比例稀释至新鲜LB液体培养基中，继续培养3.5小时。开始此实验步骤时，测定亚培养细菌的 OD 600 值，并稀释至 OD 600 为 0.2。在 1 毫升 PBS 中加入适量细菌，接种到 12 孔板中的 HeLa 细胞，使感染复数达到 100。在细胞培养箱中孵育 30 分钟。用 PBS 清洗 HeLa 细胞三次，以去除未被内化的细菌。此时间点设定为感染后零小时（即零小时 pi）。向细胞中加入 300 微升含有 100 微克/毫升庆大霉素的新鲜培养基，并维持一小时。一小时后，将培养基更换为含有 10 微克/毫升庆大霉素的成像培养基。向 HeLa 细胞中加入金标记 BSA 鲁米诺 NPS，使其终浓度达到 OD520 为 0.1。孵育一小时后，再继续孵育一小时。移除培养基，用PBS洗涤三次。最后加入300微升新鲜成像培养基，其中含有10% FCS和10微克/毫升庆大霉素。在剩余的孵育时间内，使用共聚焦成像系统（例如带有加湿环境腔室的共聚焦激光扫描显微镜或转盘式显微镜）对细胞在不同时间点进行高分辨率成像，开启温控系统并等待其温度稳定。优化成像参数，包括放大倍数、扫描速度、分辨率和Z轴步进大小。在感染后的指定时间点，针对GFP和金标记BSA荧光NPS采用适当的激发和发射设置。将含有感染细胞的12孔腔室载玻片置于显微镜载物台上，采集图像以分析沙门氏菌对内体系统的重塑作用。使用图像分析软件，在Surpass视图的对象工具栏中点击“打开”并选择文件来载入数据。单击图标以添加新的表面项。要分析感兴趣区域（ROI），请仅选择感兴趣区域，然后单击“下一步”作为源通道。选择通道三。选中平滑选项可设置生成区域的平滑程度。可手动定义数值，或接受系统自动生成的数值。适用于阈值处理。选择阈值调整的绝对强度选项。选择手动选项，并在查看区域中设置一个数值。表面阈值预览将以灰色显示。单击“分类表面”选项卡中的下一步。所得表面可通过多种条件进行筛选。默认筛选条件为V型孔数量大于10，也可通过单击“添加”包含其他筛选条件。在此示例中，使用默认滤波器完成曲面创建。在对象列表中单击“完成”。取消勾选“体积”项目对应的复选框。现在在查看区域中显示了一个新创建的表面。以红色标注，通过点击保存将统计结果导出至 Excel 文件。本方案合成的金纳米颗粒呈准球形，尺寸约为 10 纳米。BSA 涂层和 rho 结构域标记不影响其形态或大小。为研究细胞内沙门氏菌对宿主细胞内涵体系统的重塑作用，用野生型沙门氏菌或两种突变株对 HeLa 细胞进行模拟感染或感染，并用 10 纳米金颗粒进行脉冲追踪。在未感染的细胞中，BSA棒状结构域与核周颗粒（n peas）共定位，核周颗粒（NPS）均匀分布于晚期内体或溶酶体中。相比之下，在感染野生型沙门氏菌8小时后的细胞中，NPS发生了显著重排。沙门氏菌诱导形成了稳定的丝状结构网络（sifts），大多数mps聚集在这些管状结构内。感染后八小时，突变菌株表现出明显不同的行为。SSAV 突变菌株被限制在含有沙门氏菌的 VAE 或 SCV 内。尽管没有形成 sif 结构，大部分 mps 仍位于游离的晚期内体或溶酶体中。沙门氏菌突变株逃逸至细胞质中，且未观察到NPS与细菌之间的关联。当检测沙门氏菌感染不同阶段内溶酶体系统的可及性时，结果显示，在所有情况下，大部分内化的NPS均积聚在SCV或SIFs中。在此步骤之后，可进行其他方法，如透射电子显微镜观察。这可能回答一些额外的问题，例如某些纳米颗粒感染的宿主细胞中的超微结构或膜区室。观看本视频后，您应能充分了解如何制备荧光纳米颗粒。这些颗粒可用于标记由胞内沙门氏菌修饰的宿主细胞区室。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

通过胞内细菌，研究内溶酶体系统的改造荧光纳米粒子中的应用

来源：Zhang, Y., 等. 荧光纳米颗粒在研究胞内细菌介导的内体-溶酶体系统重塑中的应用. J. Vis. Exp.

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