病毒浓度的测定通过空斑试验：用传统的和新型覆盖系统

该程序的总体目标是通过计数细胞培养物中的离散噬菌斑来定量感染性变异来确定病毒浓度。这是通过首先对细胞进行铺板以形成用于感染的汇合单层来实现的。第二步是对要定量的未知病毒样本进行连续稀释。

接下来，使用病毒原液的连续稀释液感染汇合的单层，然后应用固定覆盖层。最后一步是在相关病毒的适当潜伏期后固定和染色斑块，以便计算不显眼的斑块。最终，噬菌斑测定可以以多种不同的方式使用和修饰，以确定未知病毒样品的病毒滴度。

与现有方法（如半固体覆盖层）相比，该技术的主要优点是，在高通量和传统应用中，应用和去除都要简单得多。此外，不需要加热试剂。该技术的含义延伸到许多不同裂解病毒的研究，如使用液体覆盖。

在 96 孔规格中，可以快速筛选新的治疗化合物，这可以大大减少在实验室中进行传统噬菌斑测定所花费的时间 在检测板的前一天，为相关病毒选择合适的细胞，以便在感染当天达到 90% 至 100% 的 co 流畅度。储备溶液也可以在测定前一天制备：首先通过将 5.56 毫升 36% 原液甲醛与 14.44 毫升蒸馏水混合，在蒸馏水中制备 10% 甲醛的固定溶液。然后制备由 1% 结晶紫在 20% 乙醇中用蒸馏水稀释而成的结晶紫染色剂。

接下来，在无菌条件下工作时，为所使用的细胞类型准备适当的 2 x 噬菌斑培养基。如果任何试剂不是无菌的，则通过 0.2 微米过滤器过滤溶液。制备用于噬菌斑测定的液体覆盖物，将 2.4 克 avy 细胞放入装有 97.6 毫升蒸馏水的培养瓶中，该蒸馏水与搅拌棒快速混合。

在室温下混合溶液，直到它变得对搅拌棒来说太粘稠。此时，将培养瓶转移到培养瓶摇床上，并强烈搅拌 30 分钟，以确保均匀均质化。最后，在 121 摄氏度下以 14 PSI 高压灭菌溶液 30 分钟。

程序完成后，在室温下密封存放以备覆盖。在蒸馏水中制备 0.6% agro 储备溶液。与搅拌棒和高压灭菌器混合，使其加入溶液或羧甲基纤维素覆盖层。

在蒸馏水中制备 2% 羧基甲基纤维素溶液，并在电镀后第二天像以前一样与高压釜混合。在开始检测之前，使用倒置显微镜检查细胞的共流畅性和活力。确保细胞表现出标准的细胞形态和大约 90% 的 co fluency。

细胞生长培养基中对感染性样品进行 10 倍连续稀释，根据相关病毒的预期滴度改变所需的稀释次数。此外，准备未感染的对照样品，以独立确保细胞活力并有助于噬菌斑鉴定。将未感染的对照和连续稀释液移液到板的孔中，小心避免破坏单层。

使用足够体积的接种物覆盖细胞，同时保持尽可能低的体积，以最大限度地增加病毒与单层的接触。将板放入组织培养箱中，每 20 分钟感染细胞 45 分钟至 1 小时。轻轻摇动板以确保均匀覆盖并防止细胞单层在感染期间干燥。

准备液体覆盖层的覆盖层工作溶液。将加热的噬菌斑培养基和 1.2 至 2.4% 室温 avy 细胞储备液以一比一的比例混合，以获得 0.6 至 1.2% avy 细胞覆盖培养基或 AROS 或 CMC 覆盖混合加热的噬菌斑培养基的工作溶液，以及加热的 0.6% AROS 或 2% CMC 储备溶液以一比一的比例。然后置于 56 摄氏度的水浴中，30 分钟以保持温度平衡。

确保溶液是温热的，但摸起来不热，以防止细胞死亡和降低病毒滴度。感染后，添加覆盖层后将覆盖层涂抹在感染的单层上 根据被分析的病毒，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育板 2 至 14 天，以用液体覆盖层固定细胞，倒出或吸出 e 细胞覆盖层，然后将 10% 甲醛溶液移液到孔中，在室温下固定 30 分钟至过夜或直接固定或 aros 或 CMC。固定后，将甲醛溶液添加到覆盖层中 1 小时至室温过夜，丢弃甲醛，然后用抹刀手动去除 aros 处的半固体塞子。

染色前用水冲洗 aby 细胞斑块以去除残留的覆盖固定剂。要染色，请用少量结晶紫溶液覆盖细胞约 15 分钟。如有必要，摇动板以确保均匀覆盖。

固定、染色并无限期干燥后，用水轻轻洗去结晶紫染色剂以备将来分析。计算每个孔中的斑块数，忽略斑块少于 5 个或大于 100 个斑块的孔。取相同稀释度的任何技术重复的平均值。

注意斑块的大小和形态。通过取稀释的平均噬菌斑数和总稀释因子的倒数来确定储备液样品的病毒滴度。该图显示了使用 12 孔板的裂谷热病毒噬菌斑叠加比较，将 12 孔板中的第五个细胞的 2.5 倍接种在 12 孔板中，并使用相同的连续稀释的 MP 12 起始样品用 200 μL 感染。

感染后，应用 1.5 毫升 0.3%aros 0.6% AVY 或 1%CMC 覆盖层，直接比较覆盖层。此直方图显示所有三个叠加的噬菌斑计数和滴度结果。这里。使用 12 孔板的 ViiV 噬菌斑叠加比较显示，像以前一样铺板，并在感染后使用相同的连续稀释的 ViiV TC 83 疫苗株起始样品用 200 微升的体积感染，像以前一样应用 1.5 毫升 0.3%aros 0.6%avy 细胞或 1% CMC 覆盖。

同样，直方图显示了所有三个叠加的噬菌斑计数和滴度结果。此图显示了高吞吐量噬菌斑叠加的示例。用 50 微升接种物感染 96 孔板，每孔 10 个细胞的 10 倍，使用相同的连续稀释的裂谷热病毒 MP 12 起始样品一式一组，一式两份，叠加 0.6% 和 1.2% 试验 avy 细胞的最终浓度，以确定以高通量方式使用液体覆盖的可行性和可重复性。

此直方图显示从每个叠加确定的滴度。在尝试此程序时，请务必记住，每种病毒都是不同的，可能需要进行优化，包括使用不同的细胞类型、孵育时间和/或生长培养基。观看此视频后，您应该对如何利用液体和半固体覆盖层进行基本噬菌斑测定有很好的了解。