病毒浓度的测定通过空斑试验：用传统的和新型覆盖系统
2014年11月4日
噬菌斑检测是病毒定量的金标准，利用宿主细胞单层上的包埋叠加来确定病毒滴度。虽然传统上使用各种半固体覆盖层，但在这里我们展示了将半固体覆盖层与几个病毒家族中的新型液晶微晶纤维素进行比较的噬菌斑技术。
该程序的总体目标是通过计数细胞培养物中的离散噬菌斑来定量感染性变异来确定病毒浓度。这是通过首先对细胞进行铺板以形成用于感染的汇合单层来实现的。第二步是对要定量的未知病毒样本进行连续稀释。
接下来，使用病毒原液的连续稀释液感染汇合的单层，然后应用固定覆盖层。最后一步是在相关病毒的适当潜伏期后固定和染色斑块，以便计算不显眼的斑块。最终，噬菌斑测定可以以多种不同的方式使用和修饰，以确定未知病毒样品的病毒滴度。
与现有方法（如半固体覆盖层）相比，该技术的主要优点是，在高通量和传统应用中，应用和去除都要简单得多。此外，不需要加热试剂。该技术的含义延伸到许多不同裂解病毒的研究，如使用液体覆盖。
在 96 孔规格中，可以快速筛选新的治疗化合物，这可以大大减少在实验室中进行传统噬菌斑测定所花费的时间 在检测板的前一天，为相关病毒选择合适的细胞，以便在感染当天达到 90% 至 100% 的 co 流畅度。储备溶液也可以在测定前一天制备：首先通过将 5.56 毫升 36% 原液甲醛与 14.44 毫升蒸馏水混合，在蒸馏水中制备 10% 甲醛的固定溶液。然后制备由 1% 结晶紫在 20% 乙醇中用蒸馏水稀释而成的结晶紫染色剂。
接下来，在无菌条件下工作时，为所使用的细胞类型准备适当的 2 x 噬菌斑培养基。如果任何试剂不是无菌的，则通过 0.2 微米过滤器过滤溶液。制备用于噬菌斑测定的液体覆盖物，将 2.4 克 avy 细胞放入装有 97.6 毫升蒸馏水的培养瓶中，该蒸馏水与搅拌棒快速混合。
在室温下混合溶液，直到它变得对搅拌棒来说太粘稠。此时，将培养瓶转移到培养瓶摇床上，并强烈搅拌 30 分钟，以确保均匀均质化。最后，在 121 摄氏度下以 14 PSI 高压灭菌溶液 30 分钟。
程序完成后，在室温下密封存放以备覆盖。在蒸馏水中制备 0.6% agro 储备溶液。与搅拌棒和高压灭菌器混合，使其加入溶液或羧甲基纤维素覆盖层。
在蒸馏水中制备 2% 羧基甲基纤维素溶液，并在电镀后第二天像以前一样与高压釜混合。在开始检测之前，使用倒置显微镜检查细胞的共流畅性和活力。确保细胞表现出标准的细胞形态和大约 90% 的 co fluency。
在细胞生长培养基中对感染性样品进行 10 倍连续稀释，根据相关病毒的预期滴度改变所需的稀释次数。此外，准备未感染的对照样品，以独立确保细胞活力并有助于噬菌斑鉴定。将未感染的对照和连续稀释液移液到板的孔中，小心避免破坏单层。
使用足够体积的接种物覆盖细胞，同时保持尽可能低的体积，以最大限度地增加病毒与单层的接触。将板放入组织培养箱中，每 20 分钟感染细胞 45 分钟至 1 小时。轻轻摇动板以确保均匀覆盖并防止细胞单层在感染期间干燥。
准备液体覆盖层的覆盖层工作溶液。将加热的噬菌斑培养基和 1.2 至 2.4% 室温 avy 细胞储备液以一比一的比例混合，以获得 0.6 至 1.2% avy 细胞覆盖培养基或 AROS 或 CMC 覆盖混合加热的噬菌斑培养基的工作溶液，以及加热的 0.6% AROS 或 2% CMC 储备溶液以一比一的比例。然后置于 56 摄氏度的水浴中，30 分钟以保持温度平衡。
确保溶液是温热的，但摸起来不热，以防止细胞死亡和降低病毒滴度。感染后，添加覆盖层后将覆盖层涂抹在感染的单层上 根据被分析的病毒，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育板 2 至 14 天，以用液体覆盖层固定细胞，倒出或吸出 e 细胞覆盖层，然后将 10% 甲醛溶液移液到孔中，在室温下固定 30 分钟至过夜或直接固定或 aros 或 CMC。固定后，将甲醛溶液添加到覆盖层中 1 小时至室温过夜，丢弃甲醛，然后用抹刀手动去除 aros 处的半固体塞子。
染色前用水冲洗 aby 细胞斑块以去除残留的覆盖固定剂。要染色，请用少量结晶紫溶液覆盖细胞约 15 分钟。如有必要，摇动板以确保均匀覆盖。
固定、染色并无限期干燥后，用水轻轻洗去结晶紫染色剂以备将来分析。计算每个孔中的斑块数，忽略斑块少于 5 个或大于 100 个斑块的孔。取相同稀释度的任何技术重复的平均值。
注意斑块的大小和形态。通过取稀释的平均噬菌斑数和总稀释因子的倒数来确定储备液样品的病毒滴度。该图显示了使用 12 孔板的裂谷热病毒噬菌斑叠加比较，将 12 孔板中的第五个细胞的 2.5 倍接种在 12 孔板中，并使用相同的连续稀释的 MP 12 起始样品用 200 μL 感染。
感染后，应用 1.5 毫升 0.3%aros 0.6% AVY 或 1%CMC 覆盖层，直接比较覆盖层。此直方图显示所有三个叠加的噬菌斑计数和滴度结果。这里。使用 12 孔板的 ViiV 噬菌斑叠加比较显示，像以前一样铺板，并在感染后使用相同的连续稀释的 ViiV TC 83 疫苗株起始样品用 200 微升的体积感染，像以前一样应用 1.5 毫升 0.3%aros 0.6%avy 细胞或 1% CMC 覆盖。
同样，直方图显示了所有三个叠加的噬菌斑计数和滴度结果。此图显示了高吞吐量噬菌斑叠加的示例。用 50 微升接种物感染 96 孔板，每孔 10 个细胞的 10 倍，使用相同的连续稀释的裂谷热病毒 MP 12 起始样品一式一组，一式两份，叠加 0.6% 和 1.2% 试验 avy 细胞的最终浓度，以确定以高通量方式使用液体覆盖的可行性和可重复性。
此直方图显示从每个叠加确定的滴度。在尝试此程序时，请务必记住，每种病毒都是不同的，可能需要进行优化，包括使用不同的细胞类型、孵育时间和/或生长培养基。观看此视频后，您应该对如何利用液体和半固体覆盖层进行基本噬菌斑测定有很好的了解。
概览
本文讨论了用于病毒定量的噬斑测定法，比较了传统的半固态覆盖物与一种新型液态微晶纤维素。该研究突出了液态覆盖物在简化应用和移除过程方面的优势。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 细胞培养技术
- 病毒定量
背景
- 噬斑测定法对于确定病毒滴度至关重要。
- 传统方法通常涉及复杂的半固态覆盖物程序。
- 液态覆盖物的引入可能提高效率。
- 了解病毒浓度对于治疗研究至关重要。
研究目的
- 比较半固态覆盖物与液态微晶纤维素覆盖物的有效性。
- 简化高通量应用的噬斑测定法过程。
- 便于对各种病毒的治疗化合物进行快速筛选。
使用的方法
- 为病毒感染准备全覆盖细胞单层。
- 对病毒样品进行系列稀释以进行定量。
- 感染后应用固定覆盖物。
- 固定和染色噬斑以进行计数。
主要结果
- 液态覆盖物相比半固态覆盖物在应用和移除方面更为简便。
- 使用液态覆盖物方法增强了高通量能力。
- 使用新技术成功定量了病毒滴度。
- 结果表明该方法在病毒学研究中具有更广泛的应用潜力。
结论
- 液态微晶纤维素覆盖物是传统方法的可行替代方案。
- 该技术可以简化病毒定量过程。
- 未来的研究可能受益于该方法提供的快速筛选能力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Plaque assays provide a direct, quantitative measure of infectious viral particles, supporting robust target validation and antiviral screening in early discovery. The adoption of novel liquid overlays streamlines assay workflows, enabling higher throughput and operational efficiency for portfolio-scale compound evaluation. This methodological advance enhances predictive confidence in viral quantification, directly impacting decision points in antiviral R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of infectious virions for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing antiviral effects from cytotoxicity.
- Facilitates comparative evaluation of overlay systems for optimal assay performance.
- Improves predictive confidence in viral titer measurements for downstream studies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cell-based systems for reliable antiviral compound screening.
- Standardizes plaque formation and counting for reproducible quantitative outputs.
- Enables high-throughput screening formats using liquid overlays in microplates.
- Reduces manual handling and reagent heating, increasing operational safety and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns viral quantification with translational biomarker requirements for infectious disease models.
- Ensures continuity from discovery-stage screening to preclinical efficacy studies.
- Supports risk-adjusted advancement of antiviral candidates based on robust titer data.
Pipeline & Workflow Integration
This plaque assay workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting both mechanistic studies and high-throughput antiviral screening.
- Discovery Biology: Provides direct measurement of viral infectivity for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers standardized, reproducible plaque counts for compound evaluation and assay readiness.
- Analytics: Generates quantitative viral titers and comparative overlay performance data for informed decision-making.
- Translational Research: Maintains assay continuity for preclinical model validation and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform adaptable to various viruses and screening formats.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral quantification.
- Operational Value: Streamlines workflows, enhances reproducibility, and supports high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling rapid, reliable data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, virology, and quantitative assay analysis.
- Needs access to standard tissue culture facilities and plate readers for high-throughput formats.
- Demands cross-team standardization of overlay preparation and plaque counting protocols.
- May require optimization for different virus-cell system combinations.
- Overlay selection and incubation parameters must be tailored to virus-specific characteristics.
