Name: 隔离和线粒体从培养细胞和小鼠组织功能分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学习从培养细胞和小鼠组织中分离具有呼吸功能的线粒体，并使用TMRE荧光染料评估线粒体膜电位，以反映细胞健康状态。该方法通过差速离心技术实现高效分离。

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本研究部分得到了美国国家科学基金会（NSF）CHE-1229562 项目资助（VDGM）、伊隆大学本科研究办公室、伊隆大学化学系以及伊隆大学Lumen奖（TL 和 TAD）、伊隆大学学院研究员项目（JAC）和伊隆大学学院荣誉项目（TAD）的支持。

所有动物实验均符合美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）指南，并经维克森林大学动物护理与使用委员会批准。SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] 小鼠模型的繁殖对购自杰克逊实验室（The Jackson Laboratory，缅因州巴港）。将非转基因野生型（WT）雌鼠与 SOD1G93A 雄鼠 [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] 杂交，以产生 SOD1G93A 小鼠及其非转基因野生型同窝对照，用于后续实验。
1. 研究模型
<ol>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下，使用含10%热灭活胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1% L-谷氨酰胺的DMEM培养基培养人胚胎肾细胞（HEK-T293）。</li>
		<li>在T75培养瓶中培养细胞，使其达到90%融合度。&#160;</li>
		<li>通过胰蛋白酶消化法进行细胞传代：加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C、5% CO2条件下消化3–5分钟，随后加入等体积的完全培养基终止消化反应，并在4 °C下以700 × g离心5分钟。</li>
		<li>吸除培养基，将细胞沉淀用新鲜培养基重悬。</li>
		<li>在细胞因子处理前48小时，以每T75培养瓶7 × 104个细胞的密度接种细胞。处理时细胞密度应约为70%。</li>
		<li>24小时后进行血清饥饿处理：吸除培养基，更换为等体积无血清的DMEM培养基（无菌）。</li>
		<li>用超纯水将TNF-α、IL1-β和IFN-γ从冻干粉配制成工作浓度分别为5 pg/µl、10 ng/µl和10 ng/µl的溶液，并加入至相应的孔或培养瓶中。</li>
		<li>将溶解后的细胞因子直接加入相应培养瓶的细胞培养基中，对血清饥饿处理的细胞进行刺激。处理方式包括单独使用每种细胞因子、三种细胞因子混合物（记为“*3”）或无菌水作为对照（记为“0”）。</li>
		<li>处理后的细胞在24、48或72小时后进行评估和收集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞活力评估
	<ol>
		<li>用1× PBS配制5 mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）溶液。</li>
		<li>对于12孔板，每孔加入100 µl MTT溶液，并轻轻混匀以确保均匀分布。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育15分钟至1小时，在显微镜下观察紫色沉淀的形成。若未见紫色，再次轻摇后每隔5分钟继续孵育直至出现紫色。具体孵育时间由各研究者自行确定。</li>
		<li>使用多通道移液器向每孔加入700 µl MTT溶剂（含4 mM HCl和0.1% NP40的异丙醇溶液），室温下轻摇板子5–10分钟，直至细胞中所有紫色完全溶解。若紫色未完全溶出，可额外加入200 µl溶剂并继续轻摇。</li>
		<li>用于分析时，从每孔取100 µl溶液转移至96孔板，在酶标仪上以570 nm为检测波长、630 nm为参比波长读取吸光度；也可使用595 nm作为检测波长，但须保证所有读数在相同设置下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肌萎缩侧索硬化（ALS）动物模型
	<ol>
		<li>
		所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指导原则，并经维克森林大学动物护理与使用委员会批准。SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] 小鼠模型的繁殖对购自杰克逊实验室（Bar Harbor, ME）。将非转基因野生型（WT）雌鼠与SOD1G93A雄鼠 [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] 杂交，以获得用于实验的SOD1G93A转基因小鼠及其非转基因野生型同窝小鼠。
		</li>
		<li>使用针对突变型SOD125的标准引物进行基因分型。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 线粒体的分离
注意：操作过程中需迅速进行，并始终将所有物品置于冰上。
<ol>
	<li>线粒体分离缓冲液（MIB）、脊髓分离缓冲液（SC MIB）和实验缓冲液（EB）的制备
	<ol>
		<li>提前配制好用于MIB和EB的以下储备溶液。</li>
		<li>通过将12.1 g Tris碱溶解于70 ml H₂O中制备1 M Tris/MOPS2O. 加入干燥的MOPS，调节pH至7.4。定容至100 ml。过滤除菌，4 °C保存。</li>
		<li>通过将 80.2 ml 的 K 与相应溶剂混合制备 1 M Kphos2HPO4 和 19.8 ml 的 KH2PO4室温保存。</li>
		<li>将3.8 g EGTA加入10 ml H₂O中，配制0.2 M EGTA/Tris2O. 加入 1 M Tris/MOPS 至溶解，约 30–40 ml。定容至 50 ml，经无菌滤膜过滤后室温保存。注意 pH 值约为 6.7。</li>
		<li>配制1 M谷氨酸溶液：取10 ml谷氨酸溶液配制成1 M溶液，过滤除菌后于4 °C保存。</li>
		<li>配制1 M苹果酸溶液：将10 ml的1 M苹果酸溶液加入Tris/MOPS至终浓度50 mM。过滤除菌后，于4 °C保存。</li>
		<li>配制MIB溶液，其成分为200 mM蔗糖、10 mM Tris/MOPS（pH 7.4）和1 mM EGTA/Tris。过滤除菌后，4 °C保存。</li>
		<li>配制SC MIB溶液，浓度为250 mM蔗糖、20 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、10 mM KCl、1.5 mM MgCl₂21 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM DTT 和蛋白酶抑制剂混合物。</li>
		<li>配制EB缓冲液，组成为125 mM KCl、10 mM Tris/MOPS（pH 7.4）、5 mM谷氨酸、2.5 mM苹果酸、1 mM&#160;K磷酸盐缓冲液，pH 7.4，含10 mM EGTA/Tris。过滤除菌后于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收获细胞前的设备准备
	<ol>
		<li>用无菌水将小型玻璃容器和匀浆杵各冲洗三次，然后置于冰上。</li>
		<li>准备必要的物品，例如标准钻孔机、细胞刮刀、1.5 ml、15 ml 和 50 ml 离心管以及溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线粒体分离
	<ol>
		<li>培养细胞
		<ol>
			<li>每种样本类型使用两瓶 T175 培养瓶的细胞。</li>
			<li>确保细胞融合度约为90%，用于对照实验，或按照上述步骤1.2所述进行铺板和处理。</li>
			<li>在实验台面上，吸除培养基，再用 15 ml 1x PBS 对贴壁细胞洗涤两次，每次 15 ml。</li>
			<li>吸出缓冲液，刮取培养瓶以使贴壁细胞从瓶底脱落。</li>
			<li>向每个烧瓶中加入 15 ml 的 1x PBS，轻轻摇晃混匀，转移至各 15 ml 圆锥形离心管中，置于冰上。</li>
			<li>刮取完成后，使用带有摆动桶转子的台式离心机，在 4 °C 条件下以 700 x g 离心 5 分钟。</li>
			<li>吸弃上清液，将每份沉淀物重悬于1 ml MIB中。</li>
			<li>将两种悬液合并后转移至小型玻璃容器中进行匀浆。</li>
			<li>将MIB加入容器中，直至缓冲液达到第一条刻度线。使用连接在钻机上的研杵，以中等速度匀浆三次。此步骤中需确保容器置于冰上，研杵不得移出液面之上，并保持稳定速度进行连续操作。</li>
			<li>将匀浆后的溶液转移至50 ml锥形离心管中。&#160;</li>
			<li>使用18号1½英寸针头将溶液吸入3 ml注射器中，再用27号½英寸针头将溶液回注至冰上的锥形管中。&#160;注意将溶液推出至管内壁，利用该作用力破坏细胞膜。</li>
			<li>重复注射器操作步骤，共进行五次。&#160;</li>
			<li>将溶液转移至15 ml锥形管中，在台式离心机中使用水平转子，于4 °C、600 x g条件下离心5 min。</li>
			<li>小心吸除上清液，并分装至三个1.5 ml离心管中。 
			注意：经过首次低速离心后，线粒体位于上清液中，而细胞膜和未破碎的细胞则沉淀于沉淀物中。</li>
			<li>在4 °C条件下，以10,000 × g离心5分钟，使用固定角转子。</li>
			<li>吸弃上清液，将沉淀物收集于100 µl MIB中，立即置于冰上。 
			注意：经过高速离心后，线粒体位于沉淀中。线粒体在分离后通常可维持其膜电位约2-3小时，以MIB中的浓缩储存液形式最为稳定。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从小鼠组织中分离线粒体
		<ol>
			<li>根据IACUC方案对小鼠进行麻醉。设置挥发器浓度为5.0%以诱导麻醉。通过轻捏足部无反应或当棉签接近或轻触眼睛时无眨眼反射，确认动物已处于麻醉状态。在整个手术过程中，将挥发器浓度维持在1.5%至2.0%之间，以保持小鼠处于麻醉状态。</li>
			<li>从每只动物中切除肝脏和脊髓，分别置于预冷的1x PBS -/- 中，以冲洗去除血液。</li>
			<li>将肝脏组织转移至冰上的称重皿中，使用新的剃刀片冰上切碎1分钟。</li>
			<li>将组织和适当的缓冲液（肝脏用 MIB，脊髓用 SC MIB）加入容器中，直至缓冲液达到第一条刻度线。用手动研杵进行五次研磨均质化。此步骤中需确保容器置于冰上，研杵不得移出液面，并以稳定速度连续操作。</li>
			<li>将匀浆液转移至洁净的15 ml离心管中。</li>
			<li>在4 °C、750 × g条件下，使用固定角转子离心管离心10分钟。</li>
			<li>将上清液转移至干净的离心管中，并置于冰上。 
			注意：经过首次低速离心后，线粒体位于上清液中，而细胞膜和未破碎的细胞则沉淀于沉淀物中。</li>
			<li>将脊髓沉淀物重悬于 500 µl SC MIB 中。</li>
			<li>每次用SC MIB填充容器至一半，将每份样品重新匀浆三次。</li>
			<li>将新的匀浆转移至新的离心管中。</li>
			<li>在4 °C条件下，使用固定角转子以750 × g离心10分钟。</li>
			<li>将这些含有更多线粒体的新上清液与各样本的第一次上清液合并。</li>
			<li>在4 °C、10,000 × g条件下，使用固定角转子离心管离心5分钟。</li>
			<li>吸弃上清液，将肝组织沉淀重悬于500 µl MIB中，脊髓组织沉淀重悬于50 µl SC MIB中，并立即置于冰上。 
			注意：经过高速离心后，线粒体位于沉淀中。线粒体通常在分离后可维持其膜电位约 2–3 小时，且在 MIB 中作为浓缩储存液时最为稳定。</li>
			<li>使用商用蛋白质检测试剂盒或类似方法检测蛋白质浓度，以估算溶液中线粒体的浓度26线粒体的典型浓度为：2个T175培养瓶可获得约2 mg/ml，1只小鼠肝脏可获得约3-5 mg/ml，1只小鼠脊髓可获得约1-3 mg/ml。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞色素 c 使用 R 的检测&amp;#38;D 大鼠/小鼠细胞色素c Quantikine ELISA试剂盒（根据制造商提供的方案改编）
	<ol>
		<li>反应体系设置前立即用EB缓冲液将线粒体稀释至0.5 mg/ml的工作浓度，并将稀释后的线粒体分装至1.5 ml离心管中用于反应（通常每管30–50 μl）。</li>
		<li>向稀释后的线粒体中加入终体积1%的EB或DMSO，在室温下孵育反应7-10分钟。若需要更长时间，反应在室温下可稳定维持长达30分钟。</li>
		<li>在固定角转子中，于4 °C、10,000 x g离心5 min，沉淀线粒体，小心分离上清液，并分别置于不同的1.5 ml离心管中。 
		注意：试管可于 -20 °C 冻存以备后续分析，或立即使用。</li>
		<li>测定细胞色素的释放 c 通过比较细胞色素的浓度 c 在沉淀和上清液中27.
		<ol>
			<li>通过在原始反应体积的1×PBS中加入0.5% Tx-100溶解沉淀物来制备样品。</li>
			<li>为每个样本在ELISA板上准备2个孔，分别用于加入100 μl细胞色素后溶解的沉淀物以及反应后的上清液 c 结合物（直接使用原瓶装）加100 μl含0.5% Tx-100的1x PBS，然后加入全部沉淀或上清液样品。</li>
			<li>轻轻涡旋混匀，设置为低速（2-4档），持续20秒，盖好后于37 °C孵育1小时。</li>
			<li>接下来，用按照制造商说明稀释的洗涤缓冲液洗涤平板4次。将孔板在纸巾上轻拍，去除多余的液体。</li>
			<li>接着，向每孔加入150 μl 1:1的A+B显色液，在室温避光条件下孵育20-30分钟。</li>
			<li>最后，向每孔加入50 μl终止液，并使用酶标仪在540 nm处测定吸光度。计算细胞色素的含量 c 通过比较细胞色素的释放量 c 在每个反应中，沉淀与上清液中的情况。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 线粒体（功能障碍）功能的评估
<ol>
	<li>反应体系设置前，立即将线粒体用EB缓冲液稀释至0.5 mg/ml的工作浓度，并分装至1.5 ml离心管中用于反应（每管通常使用30–50 μl线粒体）。</li>
	<li>线粒体治疗
	<ol>
		<li>加入相应的处理物（EB对照、1 μM FCCP与50 nM缬氨霉素混合液、10 μM鱼藤酮、5 μM寡霉素、2 mM KCN或200 μM ADP，终浓度），分别加入至不同的反应体系中，体积比为1/10th 稀释后线粒体的总体积。将反应液在室温下孵育7分钟。 
		注意：操作这些物质时应谨慎，因为意外摄入或经皮肤吸收可能有害。</li>
		<li>将TMRE用无菌水稀释至工作浓度100 μM，于-20 °C保存，使用时稀释至2 μM，并加入与线粒体反应体系等体积的该溶液。</li>
		<li>将反应在室温下孵育 7 分钟。</li>
		<li>在4 °C条件下，使用固定角转子以10,000 × g离心5 min，沉淀线粒体。</li>
		<li>将每个样本上清液的一半体积加入396孔板中，并检测荧光。 
		注意：TMRE 的激发和发射波长应根据所用检测板的类型和体积，参照制造商说明书进行优化。使用标准的 384 孔黑色板，加入 25 µl 1 µM TMRE（终反应浓度）时，通过激发/发射波长组合获得最强信号&#160;波长&#160;485 nm/535 nm</li>
		<li>通过将实验样本在酶标仪上测得的相对荧光值（RFU）除以对照样本的RFU，计算对照（EB）与各处理组之间的荧光倍数差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用重组细胞因子处理HEK-293T细胞，在48小时后可引起中等程度的细胞死亡（图1）。经TNF-α处理所诱导的细胞死亡程度与先前报道的研究结果相似30，而联合给予多种细胞因子后细胞活力的下降程度大于单用任一细胞因子时的叠加效应，这也与文献报道一致31,32。该细胞培养模型允许灵活调整细胞因子的种类和剂量，并可将细胞因子组合与单个因子进行比较，因而适用于研究细胞因子暴露对肾细胞产生的特异性影响。此外，实验结果具有高度可重复性且易于实现（图2）。需注意的因素包括细胞的融合度。例如，在100%融合度下处理的细胞，相较于在70–80%融合度下处理的细胞，对相同浓度细胞因子的反应较弱。此外，应记录细胞传代次数，因为细胞在培养中存留时间过长（自复苏后超过8–12周）可能会影响其反应性。尽管用细胞因子处理培养细胞会导致细胞活力下降及线粒体功能受损，但该模型本身并非脓毒症的完整模拟。然而，采用更具临床相关性的模型，例如使用从小鼠分离的原代肾细胞，或采用经刺激的THP1细胞自然分泌的细胞因子进行处理33，是本研究工作的自...

活细胞以脂肪和碳水化合物的形式储存代谢能量，并利用这些能量进行生物合成、膜转运和运动。部分能量通过糖酵解过程中将饮食中的糖类直接转化为ATP而在细胞质中获得。然而，细胞中ATP生成的主要来源是在线粒体内通过线粒体呼吸链实现的1。线粒体的结构为其高效、有效地生成ATP提供了必要的空间取向。线粒体具有双层膜结构，两层膜之间为膜间隙，与最内层的线粒体基质共同容纳了参与ATP生成的各种组分，并协调相关化学反应。内膜上含有多个膜结合蛋白复合物，构成呼吸链，同时还包含ATP合酶——这一蛋白复合物可将ADP和Pi结合生成ATP。内膜向内折叠形成嵴，电子通过细胞色素c（一种可溶性电子载体）在膜间隙中于各复合物之间传递，沿呼吸链逐级转移。随着电子的传递，还原当量被氧化，同时氢离子从基质被泵入膜间隙。由于膜间隙中离子浓度升高，形成跨线粒体内膜的电化学梯度，从而产生膜电位（∆ψ）2。氧气是电子传递链的最终电子受体，氢离子通过ATP合酶从膜间隙回流至基质，此过程直接驱动ATP的生成。上述整个过程被称为氧化磷酸化。嵴的折叠结构增加了内膜的表面积，使每个线粒体内部的电子传递和ATP生成达到最大化。参与氧化磷酸化的蛋白质、酶及其他分子由核基因和线粒体基因共同编码。线粒体含有自身的环状DNA，编码13种蛋白质以及ATP生成所必需的tRNA和mRNA3。然而，还需要更多的蛋白质，因此这些蛋白质由细胞核基因编码。大多数核编码的蛋白质通过前体蛋白N端的前序列被靶向输送至线粒体基质，其导入过程部分依赖于∆ψ4,5。
线粒体不仅参与细胞的生物能量代谢，还影响三羧酸循环（TCA）和β-氧化等重要代谢过程，通过调节钙离子参与细胞信号传导，并在细胞凋亡中发挥关键作用6。具体而言，在细胞应激状态下，定位于线粒体外膜或与之相互作用的BCL-2家族蛋白可导致线粒体外膜通透性增加（MOMP）7,8。在MOMP过程中，细胞色素c及其他蛋白被释放到细胞质中，并与多种胞质蛋白共同形成一种称为凋亡体（apoptosome）的复合物9,10。凋亡体可激活caspase，进而在细胞凋亡的执行阶段切割细胞内的蛋白质和DNA。一旦发生MOMP，线粒体膜电位（∆Ψ）即崩溃，ATP合成停止。因此，随着凋亡的启动，线粒体功能受损，∆Ψ的变化可作为评估线粒体及细胞健康状况的指标12。尽管凋亡是许多疾病模型的终末事件，但线粒体功能及其∆Ψ的变化同样可为疾病的发生和/或进展提供重要信息。例如，在神经退行性疾病发展过程中，已观察到线粒体结构和功能的改变13,14。
在本实验方案的第一部分，描述了保持其膜电位（ΔΨ）完整的线粒体的分离方法。将HEK-293T细胞暴露于不同浓度和组合的重组TNF-α、IL1-β和IFN-γ中，以诱导细胞凋亡。选择这些细胞因子是因为它们在原代人脓毒症样本中常被报道水平升高15，且TNF-α与其受体结合可触发细胞凋亡的外源性通路6。由于从原代组织中分离功能性线粒体的操作与培养细胞存在细微差异，且许多研究使用动物模型，因此本方案还描述了如何从前侧索硬化症（ALS）小鼠模型的肝脏和脊髓组织中分离线粒体。
本方案的第二部分旨在利用对电位敏感的荧光染料，通过荧光酶标仪监测线粒体膜电位的变化。通过定量检测分离线粒体在解偶联剂、呼吸链抑制剂、复合物抑制剂和离子载体作用下的ΔΨ强度，可区分细胞状态（即，健康与非健康状态）。线粒体越健康，使用线粒体抑制剂处理后其∆Ψ的变化幅度越大，因此线粒体的反应可作为线粒体（功能障碍）的指标。
使用分离的线粒体而非对功能进行原位评估，能够提供明确证据，表明某种病理状态或治疗手段可直接调控细胞器的变化16-18。尽管文献中已有从培养细胞中分离线粒体的方法，但这些方法往往描述模糊17，和/或依赖专用设备16。本方案详细描述了线粒体分离方法，并可轻松适用于其他细胞系，包括原代组织及培养细胞13,14,19,20。许多使用分离线粒体的研究采用了与本方案相同的线粒体解偶联剂和抑制剂，但使用的是克拉克电极（21为文献中众多论文的代表性示例），而该设备同样属于高度专业化的仪器。此外，这种传统方法存在通量低、操作复杂等局限性22,23，且需要大量线粒体（约500 µg/反应）。在本方案中，采用荧光膜电位探针TMRE结合荧光酶标仪进行检测，后者是许多实验室中的常规设备。TMRE被广泛认可，因其可快速进入细胞和分离的线粒体，并可在低浓度下使用24。利用本方案可快速并行设置多个反应，并进行批量分析。此外，该方法所需分离线粒体的用量显著减少（约10 µg/反应）。由于所需材料更少，可使用更小的组织或细胞培养样本作为线粒体分离的起始材料，可设置更多重复或反应，且可能留有足够材料用于其他分离线粒体实验，如ATP生成、耗氧量或蛋白导入检测等。

<table><tbody><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Sigma</td><td>G1251</td><td>可使用钾盐替代。</td></tr><tr><td>苹果酸</td><td>Sigma</td><td>M8304</td><td>可使用钾盐替代。</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Trisma 碱基</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>用乙醇稀释至 100&amp;nbsp;&amp;#956;M 作为工作液，-20&amp;nbsp;&amp;#176;C 保存。</td></tr><tr><td>缬氨霉素</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>用 DMSO 配制，使用浓度为 5&amp;nbsp;&amp;#956;M 的工作液，-20&amp;nbsp;&amp;#176;C 保存。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>Mallinckrodt</td><td>6379</td><td>用乙醇配制高浓度储备液，然后用水稀释&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>剧毒，用乙醇配制。</td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>剧毒，用乙醇配制。</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Sigma</td><td>8717-25mg</td><td>使用前立即用 EB 稀释 100&amp;nbsp;&amp;#956;M 储备液。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>1× 常规（高葡萄糖）。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Fisher</td><td>SH3002101</td><td>分装后于 -20&amp;nbsp;&amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td>美国来源，优质。热灭活后分装，-20&amp;nbsp;&amp;#176;C 保存。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIgma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>蛋白检测试剂（5×）</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>可使用任何蛋白检测试剂替代。</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>用纯水配制 2 mg/ml 储备液用于蛋白检测。</td></tr><tr><td>MTT 粉末</td><td>Sigma</td><td>M2128</td><td>用 PBS 配制 5 mg/ml 储备液，过滤除菌。分装后 -20&amp;nbsp;&amp;#176;C 保存；4&amp;nbsp;&amp;#176;C 可保存一周。</td></tr><tr><td>Tergitol 溶液（NP-40）</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-1β</td><td>Gibco</td><td>PCH08014</td><td>开启后分装，-20&amp;nbsp;&amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>重组人 TNF-α</td><td>Gibco</td><td>PHC3015L</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IFN-γ</td><td>Gibco</td><td>PHC4031</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco 磷酸盐缓冲液（-/-）</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>确保不含 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 离子。</td></tr><tr><td>细胞色素 &lt;em&gt;c&lt;/em&gt; ELISA 试剂盒</td><td>R&amp;D systems</td><td>DTC0</td><td>适用于 HEK-293T 细胞的人源试剂。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

从培养细胞和小鼠组织中分离线粒体及其功能分析

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

为了确定细胞状态，有必要对两个或多个不同组别（如健康与疾病）进行比较。线粒体因其在细胞代谢、能量生成以及凋亡调控中的关键作用，处于细胞健康的核心地位。因此，直接评估分离得到的线粒体及其功能扰动情况，有助于判断是否存在细胞器特异性的功能异常。本实验方案中所述方法包括从HEK培养细胞以及小鼠肝脏和脊髓中分离完整且具有功能的线粒体，这些方法也可轻松适用于其他培养细胞或动物组织。通过TMRE检测线粒体功能，并结合使用常见的线粒体解偶联剂和抑制剂，配合荧光酶标仪进行分析，不仅使本方案具有良好的通用性并易于大多数研究实验室开展，还可实现高通量检测。

用 200 pg/ml TNF-α、40 ng/ml IL1-β 和 75 ng/ml IFN-γ（*3）处理 HEK-293T 细胞 24–48 小时，可导致细胞死亡程度逐渐增加（图 1A）。通过 MTT 法检测细胞活力，结果一致显示，处理 24 小时后细胞活力下降约 10%，处理 48 小时后下降约 20%。使用相似浓度（100 pg/ml TNF-α、40 ng/ml IL1-β 和 75 ng/ml IFN-γ）处理细胞 48 小时也得到类似的细胞死亡结果，而单独使用各细胞因子处理则表明细胞活力的下降是由多种细胞因子联合作用所致（图 1B）。图 1B 中的活力数据代表了三次独立实验（每组实验均设三个重复）的平均值 ± 标准差，误差线的紧密程度表明数据具有良好的可重复性。在该处理方案中，可调整细胞因子的用量以进一步阐明每种细胞因子对细胞死亡的贡献，也可加入其他细胞因子或因素，前提是需设置适当的对照组。
自20世纪40年代以来，文献中已有从细胞和组织中分离线粒体的描述...

比较样品间线粒体膜电位可提供有关细胞状态的重要信息。本文详细描述了分离线粒体以及利用荧光法检测其对抑制剂和解偶联剂反应的实验步骤。通过细胞培养和细胞应激动物模型的应用，展示了该实验方案的方法学特点及其应用价值。

健康与疾病等不同组别之间的比较对于确定细胞状态至关重要。线粒体处于……

本实验的总体目标是从培养的细胞或小鼠组织中分离出具有呼吸活性的线粒体，然后通过评估其膜电位强度来反映细胞状态。对于培养的细胞，首先进行细胞接种并加以处理，随后将细胞匀浆，并使匀浆液通过针头进一步释放线粒体。对于小鼠组织，从小鼠中取出肝脏，并在冰上对两种起始材料进行匀浆。随后通过差速离心法将线粒体从其他细胞组分中分离出来。在线粒体经过一定处理（包括加入膜电位敏感性荧光染料TMRE）后，进行TMRE荧光检测，以计算膜电位的强度。最终，可通过膜电位敏感型荧光染料结合荧光酶标仪来评估线粒体功能及线粒体膜电位的变化。当使用常见的线粒体解偶联剂和抑制剂处理时，该方法可揭示细胞因子诱导的凋亡及线粒体功能障碍，适用于LS模型。该方法也可应用于其他需要比较两种或多种不同样本的体系，例如健康与疾病状态的对比，或具有不同代谢速率的两种不同动物物种之间的比较。该方法的可视化演示至关重要，因为线粒体分离步骤较难掌握。这是因为在执行该技术时存在许多细微之处，而这些细节在传统的实验方法部分中容易被忽略。在细胞因子处理前48小时，按照文本方案开始培养人胚胎肾细胞，将160,000个细胞接种至T175培养瓶中，使处理时细胞密度约为70%。24小时后进行血清饥饿处理，吸除培养基，并替换为等体积的无血清培养基。最后，通过将溶解的细胞因子直接加入细胞培养基中，处理饥饿血清的细胞，以进行线粒体的分离。首先吸除培养基，用15毫升的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁细胞两次。每次洗涤后，吸除缓冲液，并刮取培养瓶底部，以使贴壁细胞脱落。然后向每个培养瓶中加入 15 毫升 1× PBS，轻轻晃动混匀，转移至预冷的 15 毫升圆锥形离心管中，置于冰上。刮取细胞完成后，将离心管在 4°C 条件下，以 700 × g 离心 5 分钟（使用配备摆动吊篮转子的台式离心机）。离心结束后，吸除上清液并重悬。每管沉淀物用 1 毫升线粒体分离缓冲液重悬。接下来，合并两种悬液并转移至一个小玻璃容器中，用于匀浆。将重悬的线粒体和线粒体分离缓冲液加入玻璃容器中，直至溶液达到第一条刻度线。将研杵连接到电钻上，在冰上以中等速度匀浆三次。操作时应注意：将研杵插入溶液中时需去除气泡，研杵不得移出液面之上，并应保持稳定速度连续操作。将匀浆后的溶液转移至50毫升锥形管中。然后使用18号、1.5英寸针头将溶液吸入一个3毫升注射器中，再用27号、0.5英寸针头将溶液重新推回置于冰上的锥形管中。注意将溶液推至管内壁，以利用该作用力破坏细胞膜。重复此注射器操作共五次，随后将溶液转移至15毫升锥形管中，在台式离心机中使用摆桶转子，于4°C、600 × g条件下离心5分钟。经过第一次低速离心后，线粒体存在于上清液中，而一些膜结构和未破碎的细胞则沉淀下来，小心移除上清液，并分装到三个1.5毫升的离心管中。然后将这三个离心管在4°C条件下，以固定角转子于10,000 × g离心5分钟。培养细胞中的线粒体呈白色或浅白色。将每只动物的肝脏切除，并用预冷的不含钙和镁的1×PBS冲洗以去除血液。将肝脏组织转移至冰上的培养皿中，用新的刀片切碎约一分钟。随后，将组织和适量缓冲液加入容器中，直至液面达到第一条刻度线。将组织置于冰上，用手持研杵进行研磨均质，共研磨五次。将研杵插入溶液时应注意去除气泡，研磨过程中研杵不得移出液面，并以稳定的速度连续操作。随后按照文本方案中的要求，继续通过离心和均质步骤处理样品。将新获得的上清液与各样本的第一次上清液合并后，将离心管置于固定角转子中，在4°C条件下以10,000 × g离心5分钟。使用移液器吸头小心吸除顶部的白色絮状层，或将其推至管壁一侧。随后轻轻倒出剩余的上清液并重悬沉淀。将肝线粒体沉淀重悬于500微升线粒体分离缓冲液中。来自肝脏的线粒体呈棕色。在准备反应前，立即将样品迅速置于冰上。将线粒体稀释至0.5毫克/毫升。用实验缓冲液配制工作浓度。根据文本方案中列出的处理方法，向不同的试管中加入相当于稀释后线粒体总体积十分之一的适当处理试剂。接下来，将稀释后的线粒体加入各反应管中，并轻轻振荡各管以确保充分混匀。在室温下孵育反应7分钟。然后向线粒体反应体系中加入等体积的2 µM四乙基罗丹明乙酯（tetraethylrodamine ethyl ester，简称TMRE）。再次轻轻振荡每个试管，以确保充分混匀。室温孵育反应体系额外七分钟后，将样品在固定角转子中以10,000 × g、4 °C离心五分钟，沉淀线粒体。随后，取每份样品上清液体积的一半，加入到一个3 84。将培养板进行样品荧光读数，然后根据文本方案中所述方法计算对照组与各处理组之间的荧光倍数差异。用TNFα、IL-1β和IFNγ处理HEK 293T细胞24至48小时，可导致逐渐增加的细胞死亡量。通过MTT检测评估细胞活力，结果一致表明，经24小时处理后细胞活力约下降10%，经48小时处理后约下降20%。在相同浓度处理下，48小时时细胞死亡结果相似。而单独细胞因子处理表明，活力下降是由于协同作用所致。活力数据代表三次独立实验的平均标准差，每次实验均设三个重复，误差线的紧密程度证明了数据的可重复性。从细胞因子处理的细胞中分离出的线粒体，其膜电位降低的百分比表明线粒体健康受到细胞因子处理的影响，这与后续的细胞活力数据相互印证。此外，还可采用其他方法，如检测总ATP生成量或氧气消耗量，以进一步探讨不同样本之间在能量代谢和呼吸功能上的差异。观看本视频后，您应能够充分理解如何分离完整且具有功能的线粒体，并通过评估其膜电位强度来反映细胞的状态。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

隔离和线粒体从培养细胞和小鼠组织功能分析

本方案描述了一种用于研究从骨骼肌中分离的线粒体呼吸作用的方法。该方法改编自 Scorrano et al.

从骨骼肌中分离线粒体

本文介绍了一种从哺乳动物组织活检样本中快速分离线粒体的方法。大鼠肝脏或骨骼肌样品使用商用组织解离仪进行匀浆，并通过尼龙滤网过滤实现差速分离线粒体。线粒体分离时间小于&lt;30分钟，而采用其他方法通常需要60至100分钟。...

通过组织解离与差速过滤快速分离与纯化用于移植的线粒体

本文介绍了一种对先前报道方法的改进，该方法能够从小鼠骨骼肌的较小组织量中分离出高质量且高纯度的线粒体。该实验流程所获得的线粒体具有高度偶联性，在基于微孔板的呼吸测定实验中表现出良好的呼吸功能。...

从小鼠骨骼肌微量样本中分离线粒体用于高通量微孔板呼吸测定

本文介绍了一种从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后利用基于微孔板的呼吸测定实验，通过氧消耗率（OCR）分析线粒体呼吸功能。该技术流程可用于研究多种环境或遗传干预对线粒体代谢的影响。...

从小鼠骨骼肌中分离线粒体用于呼吸测定实验

我们提出了一种两步法高纯度线粒体分离方案，适用于蛋白质组水平的蛋白质鉴定与定量分析。该方案无需基因工程操作，因此适用于从任何原代细胞和组织中提取线粒体进行研究。...

无标记两步法分离线粒体以提升蛋白质发现与定量

本方案描述了一种在样品量有限的情况下分析呼吸链超级复合物的技术。...

从小型组织和细胞培养样品中分离线粒体用于线粒体超复合物分析

线粒体的生物能量学和代谢组学研究揭示了其在多种疾病中的多重作用，但这些细胞器的分离方法各不相同。本文详述的方法能够从多种组织来源中纯化出高质量的线粒体。其质量通过高分辨率呼吸测定法评估的呼吸控制比及其他指标来确定。...

从啮齿类动物心脏组织中稳健分离线粒体

我们已确定胎盘是发育过程中的主要造血器官。研究发现，造血干细胞（HSCs）在胎盘内独特的微环境生态位中生成并扩增。本文描述了从小鼠胎盘中分离和可视化造血干细胞所需的实验技术。...

从胎盘中分离和分析造血干细胞

我们介绍一种从酵母Saccharomyces...

从酵母细胞中纯化线粒体

本视频记录的实验方案演示了在体视显微镜下从成年小鼠中分离齿状回的解剖技术。...

成年小鼠海马齿状回的分离

学习从培养细胞和小鼠组织中分离具有呼吸功能的线粒体，并使用TMRE荧光染料评估线粒体膜电位，以反映细胞健康状态。该方法通过差速离心技术实现高效分离。

从培养细胞和小鼠组织中分离线粒体及其功能分析

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