隔离和线粒体从培养细胞和小鼠组织功能分析

该程序的总体目标是从培养的细胞或小鼠组织中分离呼吸线粒体，然后评估它们的膜电位强度作为细胞状态的量度。对于培养的细胞，这是通过首先铺板然后处理细胞来实现的。接下来，将细胞匀浆，匀浆通过针头以进一步从细胞中释放线粒体。

对于小鼠组织，从小鼠身上切除肝脏，然后在冰上用两种类型的起始材料匀浆。然后使用差速离心将线粒体与其余细胞内容物分离。在线粒体进行一些加工后，包括添加膜电位敏感的荧光染料，进行 TMRE 荧光测量以计算膜电位的强度。

最终，线粒体功能和线粒体膜电位的扰动可以使用膜电位敏感荧光染料和荧光读板器进行评估 当用偶联剂和抑制剂上的常见线粒体处理时，尽管这种方法可以深入了解细胞因子诱导的细胞凋亡和线粒体功能障碍，但 LS.It 也可以应用于任何其他系统，其中两个或多个不同样品之间的比较健康与疾病或具有不同代谢率的两种不同物种的动物。这种方法的视觉演示至关重要。由于线粒体分离步骤很难学习。

这是因为在执行该技术时有很多细微差别，这些细微差别在传统方法部分中可能会被忽略。在细胞因子处理板前 48 小时，按照文本方案中的说明，从生长人胚胎肾细胞开始此过程，将 160， 000 个细胞放入 T 1 75 培养瓶中，以在处理时产生约 70% 的密度。然后，24 小时后通过吸出培养基并用相同体积的无血清培养基替换它来使细胞饥饿。

最后，通过将溶解的细胞因子直接添加到细胞培养基上来处理血清饥饿的细胞，以分离线粒体。首先吸出培养基，用 15 毫升 1 x 磷酸盐缓冲盐水或 PBS 洗涤贴壁细胞两次。每次洗涤后，吸出缓冲液并刮擦培养瓶，以从底部去除贴壁细胞。

然后向每个培养瓶中加入 15 mL的 1 XPBS，涡旋并转移到冰上单独的 15 mL 锥形管中。刮擦完成后，使用带有摆动吊篮转子的台式离心机在 4 摄氏度下以 700 倍 G 离心管 5 分钟，离心后吸出上清液并复苏。将每个沉淀悬浮在 1 毫升线粒体分离缓冲液中。

接下来，合并两种悬浮液并转移到一个小玻璃容器中，在线粒体重悬，线粒体分离缓冲液到玻璃容器中，直到溶液到达第一行 将研杵连接到钻头上，继续在冰上以中速匀浆细胞三遍。将研杵放入溶液中时，应注意去除气泡，不要将研杵移开液体上方，并使用稳定的速度连续通过。将匀浆溶液转移到 50 mL 锥形管中。

然后使用 18 号、1 合 1 半英寸针头将溶液吸入 3 毫升注射器中，并用 27 号半英寸针头将其吹回冰上的锥形管中。小心将溶液排到管的内壁上，以利用该力破坏细胞膜。重复注射器步骤总共 5 次，然后将溶液转移到 15 毫升锥形管中，并在台式离心机中使用摆动吊篮转子以 600 倍 G 4 摄氏度离心 5 分钟。

线粒体在第一次低速旋转后位于上清液中，同时一些膜和未破碎的细胞沉淀，小心地去除上清液并分布在三个 1.5 毫升的试管中。然后将三管放入定角转子中，以 10， 000 倍 G 4 摄氏度离心 5 分钟。来自培养细胞的线粒体呈白色。

切除每只动物的肝脏，并放入冰冷的 XPBS，一个不含钙或镁的 XPBS 以冲洗掉任何血液。将肝组织转移到加冰的外培养皿中，用新鲜的剃须刀片将其切成细块一分钟。接下来，向容器中加入组织和适当的缓冲液，直到缓冲液到达第一行。

继续用杵用手在冰上匀浆组织五次。将研杵放入溶液中时，应注意去除气泡，不要将研杵移开液体上方，并使用稳定的速度连续通过。按照文本方案中的要求继续离心和均质化处理样品。

将新的上清液与每个样品的第一个上清液混合后，将试管放入固定角转子中，以 10， 000 倍 G 4 摄氏度离心 5 分钟。使用移液器吸头小心吸出顶部的白色蓬松层，或将其推到试管的侧面。然后轻轻倒出其余的上清液并复苏。

将肝脏线粒体沉淀悬浮在 500 微升线粒体分离中。来自肝脏的缓冲线粒体是棕色的。在反应构建前立即将样品置于冰上。

将线粒体稀释至 0.5 毫克/毫升。用实验缓冲液工作浓度。按照文本方案中列出的方式添加适当的处理，以在第 10 分之一（稀释的线粒体的总体积）处分离试管。

接下来，将稀释的线粒体放入每个反应管中，轻轻搅拌每个反应管以确保正确混合。在工作台上孵育反应物 7 分钟。然后加入等体积的两微摩尔四乙基、棒状多米、乙酯、缩写为TMRE的线粒体反应体积中。

再次轻轻搅拌每根试管以确保正确混合。在工作台上再孵育反应物 7 分钟后，在固定角转子中以 10， 000 倍 G 4 摄氏度离心 5 分钟，使线粒体沉淀。然后将每个样品的一半上清液体积加载到 3 84 上。

孔板继续读取样品的荧光，然后计算对照和每种处理之间的荧光倍数差异，如文本方案中所述，用 TNF、α、IL、一个 β 和 IFN γ 处理 HEK 2、93 T 细胞 24 至 48 小时导致细胞死亡进行性。使用 MTT 测定法评估细胞活力，该测定一致表明，处理 24 小时后细胞活力降低约 10%，降低约 20%。处理 48 小时后，用相似浓度处理的细胞在 48 小时时产生相似的细胞死亡结果。

用单个细胞因子处理表明，活力的降低是由于组合效应。活力数据表示三个独立实验的平均标准差。每次一式三份的运行和误差线的紧密性证明了数据的可重复性。

从细胞因子处理的细胞中分离的线粒体中膜电位降低的百分比表明线粒体健康受到细胞因子处理的影响，证实了此程序后的活力数据。可以形成其他方法，例如评估 TP 生成、总 TP 或耗氧量，以评估其他问题，例如不同样品之间的能量和呼吸差异。看完这个视频，你应该对如何分离完整的功能性线粒体有一个很好的了解，并评估它们的膜电位强度作为细胞状态的反映。