从培养细胞和小鼠组织中分离线粒体及其功能分析

本实验的总体目标是从培养的细胞或小鼠组织中分离出具有呼吸活性的线粒体，然后通过评估其膜电位强度来反映细胞状态。对于培养的细胞，首先进行细胞接种并加以处理，随后将细胞匀浆，并使匀浆液通过针头进一步释放线粒体。

对于小鼠组织，从小鼠中取出肝脏，并在冰上对两种起始材料进行匀浆。随后通过差速离心法将线粒体从其他细胞组分中分离出来。在线粒体经过一定处理（包括加入膜电位敏感性荧光染料TMRE）后，进行TMRE荧光检测，以计算膜电位的强度。

最终，可通过膜电位敏感型荧光染料结合荧光酶标仪来评估线粒体功能及线粒体膜电位的变化。当使用常见的线粒体解偶联剂和抑制剂处理时，该方法可揭示细胞因子诱导的凋亡及线粒体功能障碍，适用于LS模型。该方法也可应用于其他需要比较两种或多种不同样本的体系，例如健康与疾病状态的对比，或具有不同代谢速率的两种不同动物物种之间的比较。该方法的可视化演示至关重要，因为线粒体分离步骤较难掌握。

这是因为在执行该技术时存在许多细微之处，而这些细节在传统的实验方法部分中容易被忽略。在细胞因子处理前48小时，按照文本方案开始培养人胚胎肾细胞，将160,000个细胞接种至T175培养瓶中，使处理时细胞密度约为70%。24小时后进行血清饥饿处理，吸除培养基，并替换为等体积的无血清培养基。

最后，通过将溶解的细胞因子直接加入细胞培养基中，处理饥饿血清的细胞，以进行线粒体的分离。首先吸除培养基，用15毫升的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁细胞两次。每次洗涤后，吸除缓冲液，并刮取培养瓶底部，以使贴壁细胞脱落。

然后向每个培养瓶中加入 15 毫升 1× PBS，轻轻晃动混匀，转移至预冷的 15 毫升圆锥形离心管中，置于冰上。刮取细胞完成后，将离心管在 4°C 条件下，以 700 × g 离心 5 分钟（使用配备摆动吊篮转子的台式离心机）。离心结束后，吸除上清液并重悬。每管沉淀物用 1 毫升线粒体分离缓冲液重悬。

接下来，合并两种悬液并转移至一个小玻璃容器中，用于匀浆。将重悬的线粒体和线粒体分离缓冲液加入玻璃容器中，直至溶液达到第一条刻度线。将研杵连接到电钻上，在冰上以中等速度匀浆三次。操作时应注意：将研杵插入溶液中时需去除气泡，研杵不得移出液面之上，并应保持稳定速度连续操作。将匀浆后的溶液转移至50毫升锥形管中。

然后使用18号、1.5英寸针头将溶液吸入一个3毫升注射器中，再用27号、0.5英寸针头将溶液重新推回置于冰上的锥形管中。注意将溶液推至管内壁，以利用该作用力破坏细胞膜。重复此注射器操作共五次，随后将溶液转移至15毫升锥形管中，在台式离心机中使用摆桶转子，于4°C、600 × g条件下离心5分钟。

经过第一次低速离心后，线粒体存在于上清液中，而一些膜结构和未破碎的细胞则沉淀下来，小心移除上清液，并分装到三个1.5毫升的离心管中。然后将这三个离心管在4°C条件下，以固定角转子于10,000 × g离心5分钟。培养细胞中的线粒体呈白色或浅白色。

将每只动物的肝脏切除，并用预冷的不含钙和镁的1×PBS冲洗以去除血液。将肝脏组织转移至冰上的培养皿中，用新的刀片切碎约一分钟。随后，将组织和适量缓冲液加入容器中，直至液面达到第一条刻度线。

将组织置于冰上，用手持研杵进行研磨均质，共研磨五次。将研杵插入溶液时应注意去除气泡，研磨过程中研杵不得移出液面，并以稳定的速度连续操作。随后按照文本方案中的要求，继续通过离心和均质步骤处理样品。

将新获得的上清液与各样本的第一次上清液合并后，将离心管置于固定角转子中，在4°C条件下以10,000 × g离心5分钟。使用移液器吸头小心吸除顶部的白色絮状层，或将其推至管壁一侧。随后轻轻倒出剩余的上清液并重悬沉淀。

将肝线粒体沉淀重悬于500微升线粒体分离缓冲液中。来自肝脏的线粒体呈棕色。在准备反应前，立即将样品迅速置于冰上。

将线粒体稀释至0.5毫克/毫升。用实验缓冲液配制工作浓度。根据文本方案中列出的处理方法，向不同的试管中加入相当于稀释后线粒体总体积十分之一的适当处理试剂。

接下来，将稀释后的线粒体加入各反应管中，并轻轻振荡各管以确保充分混匀。在室温下孵育反应7分钟。然后向线粒体反应体系中加入等体积的2 µM四乙基罗丹明乙酯（tetraethylrodamine ethyl ester，简称TMRE）。

再次轻轻振荡每个试管，以确保充分混匀。室温孵育反应体系额外七分钟后，将样品在固定角转子中以10,000 × g、4 °C离心五分钟，沉淀线粒体。随后，取每份样品上清液体积的一半，加入到一个3 84。

将培养板进行样品荧光读数，然后根据文本方案中所述方法计算对照组与各处理组之间的荧光倍数差异。用TNFα、IL-1β和IFNγ处理HEK 293T细胞24至48小时，可导致逐渐增加的细胞死亡量。通过MTT检测评估细胞活力，结果一致表明，经24小时处理后细胞活力约下降10%，经48小时处理后约下降20%。在相同浓度处理下，48小时时细胞死亡结果相似。

而单独细胞因子处理表明，活力下降是由于协同作用所致。活力数据代表三次独立实验的平均标准差，每次实验均设三个重复，误差线的紧密程度证明了数据的可重复性。

从细胞因子处理的细胞中分离出的线粒体，其膜电位降低的百分比表明线粒体健康受到细胞因子处理的影响，这与后续的细胞活力数据相互印证。此外，还可采用其他方法，如检测总ATP生成量或氧气消耗量，以进一步探讨不同样本之间在能量代谢和呼吸功能上的差异。观看本视频后，您应能够充分理解如何分离完整且具有功能的线粒体，并通过评估其膜电位强度来反映细胞的状态。