利用酵母蛋白病变模型分离增强型Hsp104变体

以下实验的目的是筛选HSP104文库，以获得能够抑制与蛋白质错误折叠疾病相关蛋白毒性的变体。该目标通过将HSP104变体文库与一种疾病相关底物共同转化至酵母中，并在第二步中共表达这两种蛋白来实现。随后，利用5-氟乳清酸（5-FOA）处理所筛选的酵母，以对抗性筛选去除HSP104质粒。

接下来，通过菌落PCR扩增诱变区域，或鉴定HSP104基因中的突变，对筛选获得的阳性克隆进行测序。最终，可通过评估这些克隆对疾病相关底物毒性的抑制能力，筛选出最具潜力的HSP104变异体用于进一步表征。该技术相较于现有的基于结合的筛选方法，其主要优势在于能够筛选出可抑制疾病相关底物毒性的变异体。

该方法可通过鉴定能够逆转蛋白质错误折叠的蛋白质，帮助解答蛋白质折叠领域中的关键问题。尽管该方法可用于研究HSP104的增强作用，也可应用于筛选任何蛋白质文库，以寻找能够抑制酵母中任何毒性底物毒性的蛋白。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为可能需要筛选大量菌落才能获得有效的阳性结果。为筛选蛋白毒性抑制作用，首先使用添加了棉子糖的缺失培养基，结合血清移液管以及无菌木制涂布棒，将HSP104菌落从平板上冲洗下来，然后将洗脱液转移至50毫升锥形管中，并充分涡旋振荡，以彻底分散细胞团块。

接下来，将细胞悬液稀释至略显浑浊的培养状态，并在30摄氏度、摇床条件下，于棉子糖缺失培养基中过夜培养细胞。同时平行培养HSP104野生型及载体对照组。次日早晨，将不同浓度的细胞分别涂布于各自的半乳糖平板上，使每组至少获得一个含有单菌落的平板。

将载体和HSP104野生型菌株的OD600调整至文库和实验菌株的浓度一致，以比较文库相对于对照菌株的生长情况，从而评估筛选效果。同时，将文库接种于葡萄糖抑制性培养基上以增加筛选严谨性，并将所有平板在30°C下培养2至3天，直至菌落出现。使用含5-FOA的培养基筛选不再维持表达HSP104质粒的细胞。随后，将各菌株的单菌落分别平行划线接种至双缺和单缺培养基平板上，于30°C过夜培养。

这些平板将用于后续测序，为防止平板干燥，需用封口膜包裹SD his平板，并在进行5-FOA筛选时置于4摄氏度保存。随后，将SD his平板上的菌落划线接种至5-FOA平板上，获得单菌落，并在30摄氏度下培养一至两天，直至单菌落出现。下一步。

从每个五块 FOA 平板中挑选并划线接种。在 30 摄氏度下再培养一至两天后，对每个存活的菌落，将其分别接种到一块 SD Euro 平板和一块 SD his 平板上。失去 HSP 104 质粒的菌落将在 SD his 平板上生长，但不能在 SD Euro 平板上生长。

将这些菌株在30摄氏度、振荡条件下，于96孔深孔2毫升板中的棉子糖缺失培养基中过夜培养至饱和状态。随后，为消除任何假阳性结果，进行点板检测。

孵育即将结束时，使用多通道移液器将每孔200 µL的棉子糖缺失培养基分装至新的96孔板中，其中第一列和第七列保留用于原浓度培养物。接下来，将16种饱和培养物各250 µL分别分装至该板的第一列和第七列，并使用多通道移液器将培养物逐列进行5倍系列稀释，每次稀释后充分混匀。为确保点样均匀，从第六列和第十二列中各移除50 µL稀释后的培养物，使每孔最终体积均为200 µL。

然后使用96孔复制器工具将培养物以双份形式点样到SD hiss和escal hiss平板上。在30°C下培养2至3天后，筛选在escal hiss平板上表现出毒性的测序菌株。与对照组相比，假阳性菌株的毒性较弱，可予以剔除。

同时弃除在 sd. His 培养基平板上表现出生长缺陷的菌株，或表现出明显高于疾病底物单独作用毒性的菌株。为通过菌落 PCR 对 HSP 104 变体进行测序，首先用移液枪刮取约 10 微升酵母菌体至 PCR 无酶管中，加入 3 微升含 20 毫摩尔氢氧化钠的溶液，通过冻融法裂解细胞。

首先将条带置于–80摄氏度冰箱中。在冰箱中放置10分钟后，将试管在PCR仪中99摄氏度孵育10分钟，然后使用高浓度引物，用PCR级水将菌株稀释至100 µL。接着对样品进行标准PCR程序扩增，随后通过琼脂糖凝胶电泳分析样品，以确认扩增出适当大小的PCR产物。

最后，对PCR产物进行测序，并仔细分析测序色谱图以检测突变。由于酵母通常含有多个质粒，突变可能表现为某个位点出现两种核苷酸的混合信号。在本代表性实验中，在构建了中间结构域随机化的HSP104变异体文库后，将该文库转化至含有可诱导表达TDP-43的半乳糖质粒的酵母中。

随后将转化子回收，并涂布于葡萄糖和半乳糖平板上，以评估筛选的严格性。从半乳糖平板上挑选出阳性克隆。对初筛中选出的部分变异株进行五次FOA处理点种实验，结果表明，在所选的四个菌落中，有两个表现出HSP104介导的TDP-43毒性抑制作用。

其中一个为假阳性，另一个表现出增强的毒性。经过五轮 FOA 处理后，对两个真正的阳性克隆进行菌落 PCR 测序，以鉴定其中间结构域的突变。随后可通过定点突变技术，在亲本 HSP104 质粒中引入这些 HSP104 突变，以确认其毒性抑制功能。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一至两周内每次筛选多达 200 个阳性克隆，完成五轮 FOA 筛选步骤。

在进行该实验操作时，仔细分析测序结果非常重要，因为按照本方案操作后通常会获得质粒的混合物。可进一步采用其他方法（如荧光显微镜观察）来回答更多问题，例如：HSP104 变体如何影响与疾病相关底物的聚集？观看本视频后，您应能够充分理解如何筛选 HSP104 变体文库以获得毒性抑制子。