小RNA分子的高效连接用于基于高通量测序的微小RNA定量

本实验的总体目标是无偏倚地为高通量测序制备 microRNA。首先需制备或购买适用于与 microRNA 3' 端连接的 DNA 寡核苷酸。第二步是将该 3' 端 DNA 寡核苷酸连接至 microRNA 的 3' 端。

接下来，将连接产物进行凝胶纯化，并将5'端RNA寡核苷酸接头连接至microRNA的5'端。最后一步是将杂交分子转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA。最终，通过microRNA克隆与高通量测序，以单个核苷酸分辨率定量展示全转录组范围内microRNA的表达谱。

与现有的微测序、微阵列qPCR印迹等技术相比，本技术的主要优势在于，它能够以单核苷酸分辨率更真实地反映转录组范围内microRNA的实际水平。尽管该方法可为microRNA生物学研究提供深入见解，也可应用于其他高通量测序技术，如HC clip和RNA-Seq。本实验所用的DNA寡核苷酸专为3'端连接反应设计，应具备5'端磷酸基团、5'端随机二核苷酸以及3'端胞嘧啶。将DNA寡核苷酸用无核酸酶水稀释至100 µmol/L。

将以下试剂混合，配制一个连接反应体系：200 皮摩尔的 3' 连接子寡核苷酸、4 微升 5× DNA 连接缓冲液、4 微升 ATP、4 微升 M-MLV 反转录酶 RNA 酶抑制剂（M-TH-R-N-A）、连接酶以及无核酸酶水，最终体积为 40 微升。在 65 摄氏度孵育反应体系 1 小时。随后在 85 摄氏度加热 5 分钟以终止反应。

通过加入2.5倍体积的100%乙醇和三分之一体积的10摩尔醋酸铵，使TED连接子沉淀。为去除残留的a TP并防止后续反应中发生意外连接，将乙醇、盐和寡核苷酸溶液在4°C条件下于微量离心机中以最高速度离心20分钟，充分混匀。用70%乙醇洗涤沉淀，风干后将其重新悬浮于适量无核酸酶水中，得到浓度为50至100微摩尔的通气寡核苷酸。

通过18%聚丙烯酰胺凝胶电泳确认寡核苷酸的纯度。在室温下，使用1×XTBE电泳缓冲液，以每厘米凝胶宽度24伏的电压预电泳30分钟。30分钟后，用运行缓冲液冲洗加样孔。

本实验所用的DNA寡核苷酸设计用于三端连接反应，应具有5'端磷酸基团、5'端随机二核苷酸以及3'端催产素。用无核酸酶的水将DNA寡核苷酸稀释至100 µM。以每厘米24伏的电压进行凝胶电泳，直至溴酚蓝迁移至凝胶底部四分之三处。

将凝胶用一份 x cyber gold 溶液在一份 XTBE 中染色，并在紫外透射仪上观察。经 M-T-H-R-N-A 连接酶进行 3' 连接反应的 DNA 寡核苷酸应出现单个核苷酸的大小偏移。按以下顺序在冰上配制下列组分。

将1 µL 50% PEG 8,000、0.5 µL 10× RNA连接酶缓冲液、1 µL 通气的3'接头、0.5 µL RNase抑制剂、0.5–8 µg总RNA、0.5 µL T4 RNA连接酶2以及无核酸酶水混合，终体积为5 µL。用移液器吹打混匀一次，确保反应体系充分混匀。

将反应体系置于带有加热盖的PCR仪中。将模块温度设置为16摄氏度，孵育4小时。注意：反应体系可扩大至终体积20 µL，且连接效率不会降低。

在完成三端连接反应后，加入等体积的2×RNA上样缓冲液，于70摄氏度加热5分钟，随后立即在冰上快速冷却。接下来进行凝胶电泳。在15%聚丙烯酰胺凝胶上纯化样品。

以每厘米凝胶宽度24伏的电压预电泳至少30分钟。关闭电源，用运行缓冲液冲洗加样孔。上样后，在与预电泳相同的电压下继续电泳，直至溴酚蓝刚好迁出凝胶。

当聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后，目标产物将迁移至接近二甲苯青的位置。将凝胶放入一个洁净的托盘中，加入1×运行缓冲液和1× Cyber Gold，轻轻摇动染色15分钟。从染色容器中取出凝胶，置于覆盖有洁净塑料膜的紫外透射仪上进行观察。

连接产物的长度应约为45个核苷酸。由于该连接产物通常不可见，因此必须在相邻泳道中加入阳性对照合成RNA样本作为参照，并使用洁净的剃须刀片切下含有连接产物的区域，具体位置需根据合成RNA样本和大小标准品的条带位置确定。

将切下的凝胶片段放入一个0.5毫升的微量离心管中。用30号针头在0.5毫升微量离心管底部刺孔，并将该穿孔管放入另一个干净的低吸附性1.5毫升微量离心管中，于约15,000 × g离心5分钟。肉眼确认整个胶块已通过内管小孔进入外管。

如有必要，使用干净的移液器吸头将部分凝胶碎片推近孔洞。弃去空的0.5毫升离心管，向丙烯酰胺悬浊液中加入400微升高盐柱缓冲液。于4°C在摇床上孵育过夜，次日继续操作。

使用宽口移液器吸头将悬液转移至0.22微米醋酸纤维素旋转柱中，在室温下以约15,000 × g离心3分钟，以从丙烯酰胺凝胶基质中收集全部液体。将液体转移至含有1微升20毫克/毫升糖原溶液的洁净低吸附性1.5毫升离心管中。

加入等体积的异丙醇和十分之一体积的醋酸钠，通过反复倒置离心管数次来混匀溶液。在负80摄氏度的冰箱中沉淀20分钟。在4摄氏度下以最大速度离心20分钟。

为了沉淀核酸，去除上清液，并用70%乙醇洗涤。在室温下将沉淀干燥10分钟，随后直接进入5'端连接步骤。开始此操作时，向先前获得的核酸沉淀中加入以下组分：2 µL PEG 8,000、0.5 µL RNA连接酶缓冲液、0.5 µL ATP、0.5 µL连接子RNA寡核苷酸，以及水，至终体积为4 µL。

用移液器反复吹打此样品，持续最多五分钟，以确保沉淀已完全重新溶解。待沉淀完全溶解后，将溶液转移至一支洁净的PCR管中，该PCR管内含一微升RNAs抑制剂与T4 RNA连接酶1按1:1比例混合的混合液，混合时需用移液器反复吹打。将反应体系置于热循环仪中，在37摄氏度下孵育四小时。

当反应完成后，立即按照方案文本中所述，在RNA的3'端连接接头并进行反应产物的凝胶分析后，进行cDNA合成。凝胶中100至300个核苷酸区域出现清晰的高分子量条带，表明所用的总RNA样品质量较高。凝胶中25个核苷酸区域非常明亮的信号为过量未连接的3'接头合成RNA，表明该连接反应使用了5皮摩尔的合成microRNA与3'接头，并经过凝胶纯化。

此处显示的是使用 P 32 5 端标记的合成 micro RNA 进行的三个 3' 端连接反应的自显影图。顶部所示为反应进行的小时数，底部数字表示已连接产物占未连接与已连接总和的百分比。该自显影图来自使用 P 32 5 端标记的合成 micro RNA 与 3' 端连接子杂交体进行的五个 5' 端连接反应。

底部的数值表示连接产物占未连接与已连接总量的百分比，揭示了使用高浓度 PEG 8,000 小分子 R-N-A-D-N-A 的重要性。随后通过 PCR 生成适用于高通量测序的文库。PCR 循环次数需通过实验经验确定。

在此示例中，预期的DNA产物大小为146个碱基对。掌握该技术后，仅需两天即可正确完成操作。进行该技术操作时，重要的是要始终确保所有枪头和离心管无RNA污染。