Name: 在体内和昆虫病原线虫体外培育（ 斯氏和异小 ） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学习昆虫病原线虫的体内和体外培养技术，使用大蜡螟幼虫和肝肾琼脂培养基进行繁殖。该方法为生物防治研究提供了可靠的实验基础。

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作者谨此感谢 Stock 实验室的前成员：Ming-Min Lee、Kathryn Plichta、Victoria Miranda-Thompson 和 Sam-Kyu Kim，他们为改进这些实验方案中的许多部分作出了贡献。本研究工作部分由美国国家科学基金会资助，资助编号为 IOS-0840932 和 IOS-0724978，授予 S. P. Stock。

1. 在体 昆虫病原线虫及其共生细菌的培养
<ol>
	<li>将一个 100 x 15 mm 的塑料培养皿倒置，并在皿盖内放置两张滤纸（直径 90 mm）。</li>
	<li>将 1 ml 的感染性幼虫（IJ）水悬浮液（浓度为 1,000–2,000 IJ/ml）均匀地分布在滤纸上。 
	注意：感染性幼虫无需进行表面灭菌。</li>
	<li>向培养皿中加入 10 头大蜡螟 Galleria mellonella 的末龄幼虫。目标是每条幼虫提供约 100–200 条 IJ。</li>
	<li>用培养皿底部盖住皿盖（图 1），并标记培养皿。标注以下信息：线虫物种名称（如已知）；分离株编号/代号；感染陷阱设置日期。</li>
	<li>将培养皿放入松密封口的塑料袋中（以保持湿度），并在黑暗环境中于室温或 20–25 °C 的培养箱中培养。每天检查培养皿。 
	注意：黑暗环境有助于线虫感染，因其模拟了土壤中的自然感染条件。</li>
	<li>3–5 天后，将出现线虫感染迹象的虫尸转移至改良的怀特氏捕获装置（White trap）7。 
	注意：若虫尸散发腐败气味，可能表明培养未成功和/或存在污染。此时应使用新的一批线虫和&#160;昆虫重新设置感染装置。</li>
</ol>
2. 体外 昆虫病原线虫及其共生细菌的培养
<ol>
	<li>肝脏-肾脏琼脂法9,19
	<ol>
		<li>将肝脏和肾脏切成小块（2 cm3 或更小），放入搅拌机中，加入 NaCl、琼脂和 300 ml 水，搅拌至组织成为液态浆状物、浓稠糊状物或匀浆。然后将混合物转移至 1 L 锥形瓶中。</li>
		<li>向搅拌机容器中加入最后 200 ml 水，并将残留的培养基倾倒至锥形瓶中。在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。灭菌后，待琼脂冷却至可触碰温度后再进行倾注。 
		注意：不建议使用移液器操作该培养基，因为该培养基中常含有肉质块状物。</li>
		<li>在倾注过程中，边倒边手动搅拌或轻轻旋转锥形瓶，将约 20 ml 琼脂倒入 5（或 6）cm 的培养皿中，以获得更均匀的培养基。让琼脂凝固，并将培养皿储存于 4 °C，待用时取出。 
		注意：使用火焰灭菌的金属刮刀将倒入培养皿中的大块肉组织打碎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂质琼脂法9,19
	<ol>
		<li>通过混合营养肉汤、琼脂和酵母提取物制备脂质琼脂培养基，将混合物倒入 2 L 锥形瓶中。加入蒸馏 H2O 和 MgCl2•6H2O，在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。</li>
		<li>加入无菌的玉米油和玉米糖浆混合液，并充分搅拌或剧烈振荡，以使油滴均匀分散。 
		注意：通过将所需体积的玉米油和糖浆置于紫外交联仪中进行灭菌。油不会完全溶解于液体中，但应确保其形成微小油滴。</li>
		<li>将约 20 ml 琼脂倒入 5（或 6）cm 培养皿中，待琼脂凝固后，将培养皿储存于 4 °C，待用时取出。</li>
		<li>将目标共生菌划线接种至脂质琼脂平板上，在 28 °C 下培养 24–48 小时。 
		注意：可涂布 100–200 µl 过夜（12–16 小时）的 LB 亚培养液。</li>
		<li>次日，加入约 0.4 ml 表面灭菌的线虫悬浮液（卵或感染性幼虫），并将平板置于室温避光环境或 22 ±3 °C 的培养箱中继续培养。 
		注意：线虫悬浮液添加量不应超过 0.4 ml，以免造成环境过湿，不利于线虫生长。</li>
		<li>每日观察培养情况。通常约 12 天后可产生新一代感染性幼虫（IJs）（图 2）。</li>
		<li>当观察到线虫在培养皿壁上爬行时（图 3A），将底部含琼脂的培养皿转移至改良 White 捕获装置（参见 Orozco et al.12）以收集感染性幼虫（IJs）（图 3B）。此操作应在超净工作台中进行，以减少培养基污染。</li>
		<li>在线虫从改良 White 捕获装置中逸出后收集 IJs，并用无菌水冲洗 IJ 悬浮液以去除任何培养基残渣。将 IJs 储存于灭菌蒸馏水中，置于 10 °C（低温培养箱或冷藏室）中，或根据需要立即使用。 
		注意：根据研究目的，可使用携带共生菌或无共生菌的线虫接种平板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 体外 无共生体（无共生菌）昆虫病原线虫的培育
<ol>
	<li>用目标线虫物种的感染性幼虫（IJs）感染10-20只G. mellonella幼虫（参见第1节）。感染后3或4天（此时IJs应已发育为第一代成虫），收集死亡的幼虫尸体。 
	注意：不同物种的成熟时间以及获得足够数量卵所需的雌虫数量会有所不同。如有必要，可增加感染的G. mellonella幼虫数量，并可在感染后48小时即开始解剖，以评估其是否处于合适的发育阶段。</li>
	<li>将每具尸体单独放入含有生理盐水（M9缓冲液18）的培养皿中。用精细尖头镊子拉扯幼虫头部进行解剖。</li>
	<li>用细针（建议使用L形针）收集至少20只带有卵的 gravid 雌虫（体内含卵），并将其置于含有10 ml M9缓冲液的表玻璃皿中（图4A）。</li>
	<li>配制无菌化溶液，成分如下：6.75 ml 蒸馏水、1.25 ml 5 N NaOH 和 2.25 ml 市售漂白剂溶液（稀释至含3%次氯酸盐）。 
	注意：NaOH为强碱性溶液，操作时应佩戴手套、护目镜及其他适当的防护装备。 
	注意：每次均需新鲜配制无菌化溶液，因漂白剂在光照下易降解。建议配制多批次溶液，并在多个表玻璃皿中同时进行卵的表面灭菌与收集。</li>
	<li>用M9缓冲液冲洗雌虫至少三次：向表玻璃皿中加入缓冲液后，用移液器吸出。确保雌虫始终保留在表玻璃皿内。重复此步骤共三次。</li>
	<li>立即加入无菌化溶液，使雌虫在此溶液中停留不超过10–15分钟。观察线虫组织开始溶解，而卵（对无菌化溶液具有抗性）则保持完整。</li>
	<li>用针或解剖刀切割雌虫体以人工破坏其结构，加快组织溶解过程（图4B, C）。用移液器将卵转移至1.5 ml 微离心管中，避免带入未溶解的组织。 
	注意：根据需要使用多个微离心管，操作应迅速，因为卵在无菌化溶液中长时间暴露会降低其活力。</li>
	<li>使用“高速档”涡旋振荡器振荡管子15秒，以进一步去除附着在卵表面的线虫组织。若无涡旋振荡器，可用移液器反复吹打溶液数次作为替代。</li>
	<li>在约18,000 g下离心2分钟使卵沉淀。若卵未充分沉淀，可提高离心速度。弃去无菌化溶液，加入无菌蒸馏水清洗两次，每次加满微离心管后，在900 x g下再离心1分钟。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将卵重悬于300–500 µl无菌蒸馏水中，并转移至无菌的3 cm培养皿或已灭菌的表玻璃皿中。请注意，此时卵已实现表面灭菌，因此应使用无菌移液器、无菌吸头和无菌水以维持卵的洁净状态。</li>
	<li>在解剖显微镜下（30–50倍放大）检查卵，确认其完整性（图4D），然后将其转移至含肝肾琼脂的5 cm培养皿中（参见第2.1节）。 
	注意：每块培养皿中加入的卵悬液不得超过400 µl，否则会使琼脂过度湿润。</li>
	<li>标记培养皿并注明相关信息，将其直立存放于28 °C黑暗环境中。卵的孵化通常在过夜后即可观察到。 
	注意：培养皿盖上可能会有冷凝水，但1–2天后会自然蒸发。此时应将培养皿放入塑料袋中，以保持琼脂湿度，防止其干燥。</li>
	<li>定期观察培养皿，一旦发现真菌或细菌污染迹象即丢弃。当观察到感染性幼虫（IJs）开始沿培养皿壁迁移时，取下皿盖，将含琼脂的底部培养皿转移至改良White陷阱装置12中。转移过程中应注意无菌操作，避免暴露的培养基受到污染。</li>
	<li>持续监测White陷阱装置，并根据需要收集感染性幼虫（IJs）。 
	注意：无共生菌的线虫可在数天甚至数周内持续迁移到White陷阱的水中。</li>
</ol>

<ol><li>Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+dimorphism+in+Xenorhabdus+spp.%2C+bacteria+symbiotically+associated+with+the+insect+pathogenic+nematodes%2C+Neoaplectana+and+Heterorhabditis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis.</a> J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).</li>
<li>Dunphy, G. B., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monoxenic+culture+of+Neoaplectana+carpocapsae+DD+136+and+Heterorhabditis+heliothidis%5BTitle%5D)+AND+%22Revue+Nematol%22%5BJournal%5D)">The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis.</a> Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).</li>
<li>Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+N+%22Entomopathogenic+Nematology%22">Entomopathogenic Nematology</a>. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).</li>
<li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+NE+%22The+Prokaryotes%22">The Prokaryotes</a>. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, NY. 473-488 (2002).</li>
<li>Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+axenic+Steinernema+feltiae.+Xenorhabdus+bovienii.+and+the+bacto-helminthic+complex+to+larvae+of+Tipula+oleracea+%28Diptera%29+and+Galleria+mellonella+%28Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera).</a> Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).</li>
<li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaugler%2C+R+%22Entomopathogenic+Nematodes+in+Biological+Control.+Boca%22">Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca</a>. , CRC Press. Raton, FL. (1990).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaya%2C+HK+%22Manual+of+techniques+in+insect+pathology%22">Manual of techniques in insect pathology</a>. Lackey, L. A. , Academic Press. London. 281-324 (1997).</li>
<li>Koppenhöfer, H. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoppenh%C3%B6fer%2C+H+%22Entomopathogenic+Nematodes%3A+Systematics%2C+Phylogeny+and+Bacterial+Symbionts%22">Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts</a>. Nguyen, K. B., Hunt, D. J. , Brill. Leiden-Boston. 735-759 (2007).</li>
<li>Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+monoxenic+inocula+for+scaling+up+in+vitro+cultures+of+the+entomopathogenic+nematodes+Steinernema+spp+and+Heterorhabditis+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp.</a> Nematologica. 39, 385-399 (1993).</li>
<li>Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+sampling+and+isolation+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae%2C+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae).</a> J. Vis. Exp. (89), (2014).</li>
<li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+Achromobacter+nematophilus+in+the+infective+stage+of+a+Neoaplectana+sp+%28Steinernematidae%3A+Nematoda%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda).</a> Nematologica. 12, 105-108 (1966).</li>
<li>Poinar, G. O. Jr, Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+sp.+nov.+%28Achromobacteriaceae%3A+Eubacteriales%29+associated+with+a+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Bull.+Bacteriol.+Nomencl.+Taxon%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode.</a> Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).</li>
<li>Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+infection+during+the+tripartite+interaction+between+Xenorhabdus+nematophila%2C+its+nematode+vector%2C+and+insect+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).</li>
<li>Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+competition+between+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernema%29+is+modified+by+their+bacterial+symbionts+%28Xenorhabdus%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus).</a> BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).</li>
<li>Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+processes+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, C. .elegans.W. ormB. ook. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier. Yakima, WA. 373-426 (2012).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

选择合适的寄主是成功进行昆虫病原线虫（EPN）体内培养的关键因素。in vivo 培养中，斯氏线虫科（steinernematids）和异小杆线虫科（heterorhabditids）通常均可在大蜡螟幼虫 Galleria mellonella（鳞翅目：螟蛾科）体内繁殖并顺利完成其生活史。然而，也可考虑使用来自不同科或不同目昆虫的其他物种。目前已描述的少数线虫物种对特定昆虫寄主具有专一性。例如，S. kushidai 和 S. scarabaei 对鳞翅目幼虫的致病性较弱，需依赖鞘翅目幼虫（如金龟子幼虫，Scarabaeidae）才能在实验室中成功培养。另一个物种 S. scapterisci 则偏好直翅目昆虫，如蟋蟀或蝼蛄。
当没有合适的宿主或实验条件需要时，可采用体外（in vitro）方法培养昆虫病原线虫（EPN）。这些方法使用能够为线虫及其共生细菌提供丰富营养的培养基。在本演示中，我们介绍了两种可用于成功培养和繁殖EPN的琼脂培养基（肝脏-肾脏琼脂和脂质琼脂），无论是...

昆虫病原线虫（EPN） 斯氏线虫属 和 异小杆线虫属 spp.（斯氏科，异小杆科）及其细菌共生体， Xenorhabdus 和 Photorhabdus 肠杆菌科（Enterobacteriaceae）被认为是陆生动物与微生物共生关系的一个新兴模型2-4,6,10,19. Xenorhabdus 和 Photorhabdus spp. 作为共生体存在于线虫唯一自由生活的阶段（也称为感染性幼虫（IJ）或第三阶段）的肠道中rd 感染性幼虫阶段8,10,13该细菌-线虫组合对多种昆虫具有致病性，并已在全球范围内的生物防治和综合害虫管理项目中成功应用。6,8.
本文展示了一组精选的 体内 和 体外 在实验室条件下常用于饲养昆虫病原线虫的技术。 在体 方法考虑使用昆虫宿主来培育线虫。通常采用不同昆虫目中的未成熟阶段（即&#160;鳞翅目, 鞘翅目, 双翅目, 等等被认为适合的宿主。 体内 在实验室中，通常采用这些方法来维持线虫培养。然而，在需要大规模生产线虫时，该方法可能并不适用。由于需要大量昆虫宿主，因而会耗费更多时间，并增加与昆虫饲养相关的额外成本。
昆虫病原线虫也可进行培养 体外 在多种培养基上。根据研究目的； 体外 方法可能或需考虑在培养基中加入共生细菌。在本演示中，我们描述了两种常用于繁殖昆虫病原线虫（EPN）的方法。培养基的成分可为共生细菌提供营养来源，并为线虫提供固醇来源。 体外 方法具有无需昆虫寄主即可培育EPN的优势。
最初，许多 体外 开发的培养基被用于在缺乏合适昆虫宿主时扩增EPN。然而，近年来 体外 饲养方法已广泛应用于研究昆虫病原线虫与其共生细菌之间互惠关系的研究中17,19.
本演示中详述的技术对应于多位作者所描述的方法，并由亚利桑那大学（美国亚利桑那州图森市）Stock实验室进一步优化。这些技术不同于用于害虫管理目的的大规模生产这些生物体所采用的技术体系。

<table><tbody><tr><td colspan="4">用于&lt;em&gt;体内&lt;/em&gt;感染实验</td></tr><tr><td>100 × 15 培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>滤纸，9 cm，1号纤维素滤纸</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-081</td><td>推荐使用1号滤纸</td></tr><tr><td>昆虫宿主</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>&lt;em&gt;Galleria mellonella&lt;/em&gt;为推荐宿主</td></tr><tr><td colspan="4">肝脏-肾脏琼脂培养基（配制500 ml）</td></tr><tr><td>60 × 15 mm 培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>牛肝，50 g</td><td>本地采购；屠宰场或超市</td><td></td><td>剩余部分可冷冻保存，后续使用时解冻</td></tr><tr><td>牛肾，50 g</td><td>本地采购；屠宰场或超市</td><td></td><td>剩余部分可冷冻保存，后续使用时解冻</td></tr><tr><td>氯化钠 2.5 g（终浓度0.5%）</td><td>Acros/VWR</td><td>200002-434</td><td>可使用任意研究级NaCl</td></tr><tr><td>琼脂，7.5 g（终浓度1.5%琼脂）</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>可使用任意培养基级琼脂</td></tr><tr><td>500 ml 蒸馏 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">脂质琼脂培养基（配制1 L）</td></tr><tr><td>100 × 15 培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>营养肉汤，8 g</td><td>BD/VWR</td><td>90002-660</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物，5 g</td><td>EMD/VWR</td><td>EM1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁 10 ml（0.2 g/ml）</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-MX0045-1</td><td></td></tr><tr><td>玉米油，4 ml</td><td>任意品牌</td><td>本地采购；超市</td><td>可使用任意品牌的玉米油</td></tr><tr><td>玉米糖浆，96 ml：将7 ml玉米糖浆加入89 ml加热的H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O中，混匀</td><td>Karo</td><td>本地采购；超市</td><td></td></tr><tr><td>琼脂，15 g</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>可使用任意培养基级琼脂</td></tr><tr><td>蒸馏 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，890 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

体内与体外培养昆虫病原线虫（steinernematidae和heterorhabditidae）

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

昆虫病原线虫（EPN）（Steinernematidae 和 Heterorhabditidae）与肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的革兰氏阴性γ-变形菌具有互惠共生关系。Xenorhabdus 细菌与斯氏线虫共生，而 Photorhabdus 则是异小杆线虫的共生菌。线虫与细菌共同形成一种高效的杀虫复合体，通过密切且特异的协作杀死多种昆虫。本文中，我们展示了在实验室条件下培养这些线虫常用的体内（in vivo）和体外（in vitro）技术。此外，这些技术是成功建立EPN培养体系的关键步骤，也为利用这些生物体开展研究的其他生物测定奠定了基础。产生无共生菌（即无共生体）的线虫对于深入且多角度地研究共生关系往往至关重要。本方案无需添加抗生素，使用常规实验室设备即可在较短时间内完成。以此方法产生的线虫相对健壮，但其在储存期间的存活率可能因所用物种不同而有所差异。本演示中详述的技术对应于多位作者所描述的方法，并经美国亚利桑那大学（图森，亚利桑那州，USA）P. Stock 实验室优化。这些技术不同于用于害虫防治目的的大规模生产这些生物体的技术体系。

的 体内 饲养方法利用活体昆虫作为线虫生长和繁殖的宿主。感染室是一种使昆虫暴露于感染性幼虫（IJs）的高效方法。在线虫的生活史中，该阶段是唯一能够将细菌共生体从一个昆虫宿主传播到另一个昆虫宿主的阶段。 图1 展示了感染室的设置以及构建该室所需的材料。 体外 饲养方法可使EPN在无昆虫宿主的情况下生长，同时也可用于培养无共生体（无共生菌）的线虫。 图2 显示含有不同线虫发育阶段的脂质琼脂平板。在基于生物种概念验证线虫身份所需的杂交试验中，也可考虑使用脂质琼脂平板。肝脏肾脏琼脂法最初由 Poinar 描述。 &amp; 托马斯（1966）14该方法可使线虫在无昆虫宿主的条件下发育并繁殖，也可用于培养不含共生细菌的线虫即 产生无共生体线虫）。该方法的一个缺点是由于培养基营养丰富，容易发生污染，可能导致不需要的细菌或真菌生长。 图3A 显示带有IJS在平板侧面爬行的肝肾琼脂平板。在此阶段，可将培养皿的底部部分转移至改良的怀特陷阱中。 图3B</stron...

本演示的目的是展示 体内 和 体外 昆虫病原线虫的饲养技术 在体 方法考虑了利用昆虫宿主饲养这些线虫，而 体外 方法利用富含营养的琼脂培养基。

体内与体外培养昆虫病原线虫（Steinernematidae和Heterorhabditidae）

昆虫病原线虫（EPN）（斯氏线虫科 Steinernematidae 和异小杆线虫科 Heterorhabditidae）与革兰氏阴性γ-变形菌门（Gamma-Proteobacteria）中的细菌存在互利共生关系……

本实验的总体目标是展示体内和体外培养肠道致病性线虫的技术。体内方法首先通过将大蜡螟（Galleria mellonella）的幼虫与感染性幼虫（IJ）悬浮液共同孵育来实现。随后，将感染线虫的虫尸转移至改良的白色诱捕装置中，以便收集线虫。体外培养方法首先需修复肝脏、肾脏或脂质琼脂平板，并划线分离所需共生细菌。随后将IJ期悬浮液接种至平板上，使线虫发育。最后将琼脂培养皿转移至改良的白色捕获装置中，以收集线虫。最终，这些技术成功建立了EPN培养体系，并为利用这些生物体开展研究的其他生物测定奠定了基础。本展示中介绍的体内和体外方法不仅可用于致病性线虫的研究，还可广泛应用于旨在理解ProCard与早期相互作用的各种实验。演示这些实验操作的是我实验室的研究生John McMullen。开始体内培养致病性肠线虫时，将一个100 mm × 15 mm的塑料培养皿倒置，在皿盖内放置两张滤纸，并将1 mL感染期幼虫（IJ）悬浮液均匀分布在滤纸上。在滤纸上加入10只末期饥饿的蜡螟幼虫（Galleria mellonella），置于培养皿中，以产生约100至200条IJ/幼虫。用培养皿底部盖住皿盖，并做好标记。然后将培养皿放入塑料袋中，松散密封，并在20至25摄氏度的黑暗条件下培养。3到5天后，将出现线虫感染迹象的尸体移至改良的白色陷阱装置中，采用肝肾法在体外培养线虫及其共生细菌。将肝脏和肾脏切成小块，与氯化钠琼脂及300毫升水一同放入搅拌机中，搅拌至肉组织成为液态浆状物、浓稠糊状或泥状。将混合物转移至锥形瓶中，并用200毫升水冲洗搅拌器容器，将冲洗液倒入瓶中。在121摄氏度下高压灭菌15分钟。将约20毫升的琼脂倒入直径五至六厘米的培养皿中，待琼脂凝固后，于4摄氏度保存备用。采用脂质琼脂法准备线虫时，先将所需共生细菌划线接种至脂质琼脂平板上，在20至25摄氏度避光条件下培养24至48小时。次日，取约0.4毫升经表面灭菌的线虫悬液（含卵或感染性幼虫），接种至平板上，在室温避光环境或23±3摄氏度的培养箱中继续培养。每天监测培养物中感染性幼虫（IJs）的生成情况，通常约在 12 天左右出现。一旦在层流罩下观察到线虫在培养皿壁上爬行，立即进行收集：将含琼脂的培养皿底部转移至改良的白色陷阱装置中。当侵染性线虫幼虫（IJs）从白色诱捕器中逸出后，收集它们，并用无菌水冲洗IJs悬浮液。为去除任何培养基残渣，可将IJs置于4°C的无菌蒸馏水中冷藏保存，或立即使用所需种类的线虫IJs。侵染10至20克蜡螟幼虫，或使用足量幼虫以获得所需数量的卵。三到四天后，收集尸体。将每具尸体单独放入含有生理盐水或M9缓冲液的培养皿中。解剖尸体时，用尖头镊子牵拉头部。使用L形细针收集至少20条带有卵的GRD雌虫，并将其放入含有10毫升M九缓冲液的表玻璃皿中。根据文本方案配制电离溶液后，用M九缓冲液冲洗雌虫至少三次：

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

在体内和昆虫病原线虫体外培育（ 斯氏和异小 ）

为了研究Xenorhabdus细菌与Steinernema线虫之间的共生关系，研究人员开发了用于监测细菌在线虫体内存在情况及定位的方法。该实验方法可应用于其他系统，其核心步骤是通过基因工程使细菌表达绿色荧光蛋白，并利用荧光显微镜观察透明线虫体内的荧光标记细菌。...

使用荧光显微镜观察线虫中的细菌

昆虫病原线虫是一类栖息于土壤中的线形蠕虫，可寄生多种昆虫。本文展示了利用两种技术从土壤中分离这些线虫的采样方法：昆虫诱捕法用于从土壤样品中回收线虫，改良White诱捕器法则用于从受感染的昆虫尸体中回收线虫。...

土壤采样及昆虫病原线虫（Steinernematidae, Heterorhabditidae）的分离

野生的Caenorhabditis线虫与多种微生物相关，这些微生物通常位于肠道腔内或感染肠道。本方案详细介绍了一种利用dauer幼虫角质层的抗性来富集定植于肠道中不可培养微生物的方法。...

选择性清洗野生 Caenorhabditis 线虫以富集肠道微生物组细菌

昆虫病原线虫与细菌共生，二者共同作用，通过破坏昆虫的先天免疫系统成功感染宿主。为了促进对线虫感染遗传基础的研究，本文描述了昆虫病原线虫的保种及遗传操作方法。...

培养与遗传操作昆虫病原线虫

本文展示了在雌雄同体斯氏线虫（Steinernema...

基于CRISPR-Cas9的昆虫病原线虫Steinernema hermaphroditum诱变及突变株系的保种

我们向农民介绍两种大规模繁殖昆虫病原线虫作为生物杀虫剂的方法。第一种方法采用聚丙烯酰胺凝胶作为线虫培养基质，第二种方法则使用聚合物包被的脱脂棉作为培养基质。两种方法均依赖于 体内...

基于种植者的 在体 内 昆虫病原线虫的繁殖

灌注脱细胞是一种新型技术，可用于制备保留肝脏细胞外基质成分和微结构的全肝支架。本文描述了利用灌注脱细胞法制备全器官支架并随后接种肝细胞的方法。通过该技术可生成具有功能且可移植的肝脏移植物。...

全肝脱细胞与再细胞化

在金表面由长链烷烃硫醇形成的自组装单分子层（SAMs）为蛋白质图案化和细胞限域提供了明确的基底。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章对十六烷硫醇进行微接触印刷，随后用端基为乙二醇的烷烃硫醇单体进行反向填充，可形成一种图案，其中蛋白质和细胞仅吸附于印章转移的十六烷硫醇区域。...

创建用于蛋白质和细胞限制的二维图案化基底

本文描述了一种定制的实时共聚焦扫描成像系统的完整构建方法。该系统可轻松用于视频速率显微镜和显微内窥镜检查，能够实现多种标准商用共聚焦系统无法达到的成像几何结构和应用，且成本仅为后者的一小部分。...

视频速率扫描共聚焦显微成像与微型内窥显微技术

本文详细介绍了在完整分离的Langendorff灌注小鼠心脏中进行跨膜电位（Vm）和细胞内钙瞬变（CaT）光学标测时的解剖操作、仪器设置及实验条件。...

小鼠心脏动作电位与钙瞬变的光学标测

学习昆虫病原线虫的体内和体外培养技术，使用大蜡螟幼虫和肝肾琼脂培养基进行繁殖。该方法为生物防治研究提供了可靠的实验基础。

体内与体外培养昆虫病原线虫（Steinernematidae和Heterorhabditidae）

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