小鼠耳蜗组织外植体的长期延时成像

本实验的总体目标是对来自荧光报告小鼠的胚胎耳蜗进行成像，时间跨度为五天，每30分钟成像一次。首先从荧光报告小鼠中获取胚胎第13天的耳蜗组织，随后将耳蜗进行体外培养以实现该目标。

然后将耳蜗外植体培养物置于培养箱显微镜中。最后，设置自动成像程序并对耳蜗外植体进行成像。最终，耳蜗外植体培养物的长期延时成像可用于展示耳蜗上皮整体的形态发生运动，以及报告基因表达随时间的变化，还有作用较慢的药理学试剂的影响。

与现有方法（如在一段时间内手动拍摄X基金培养物）相比，该技术的主要优势在于其完全自动化。它能够采集更多时间点的数据，并确保在每个时间点对耳蜗的同一区域或同一组细胞以相同的方向进行成像，同时样本仍在不规则的组织培养孵育箱中生长。在根据随附的文字方案补充KO改良的鹰号培养基（DMEM）和亨克平衡盐溶液（HBSS）后。

在超净工作台内，使用5毫升未添加血清的DMEM重悬，将200微升基底膜基质移液至直径35毫米、底部为玻璃的培养皿中每个10毫米孔的中央，每孔150微升。在35摄氏度的CO2培养箱中孵育40分钟。准备工作站和工具时，打开层流洁净台，并用70%乙醇喷洒台面，同时将镊子、勺子和黑色硅胶涂层培养皿浸泡于70%乙醇中。

在洁净的工作站中，将适当孕龄的胚胎置于冰上收集。使用添加了1%heaps的冷HBSS。利用荧光体视显微镜，识别体表或可见器官内具有报告基因活性的胚胎，并在冷光源和精细镊子的帮助下，将其转移至含有1%heaps的新鲜冰冻HBSS中，用于采集颞骨。

迅速操作，于颈椎和下颌下方剪切以收集胚胎头部。根据文本方案收集胚胎头部后，小心打开颅骨，切除头部前端的脑组织，并将后部颅骨转移至盛有新鲜冰浴的培养皿中。在冰冷的HBSS中，仔细解剖出呈花生状的颞骨，注意保持前庭系统的完整性。

解剖耳蜗时，将颞骨转移至盛有冰冷 HBSS 液的黑色硅胶弹性体包被培养皿中。通过以倾斜角度插入固定针固定颞骨的前庭区域，以稳定颞骨并为镊子操作留出空间。随后，将镊子的一侧尖端插入耳蜗基部外缘的软骨处，小心剪除围绕耳蜗的软骨组织，在软骨上剪出一个小孔。

水平横向剪开囊的顶部，再斜向剪开，小心掀开囊的前半部分。将镊子的一个尖端插入残留的软骨与导管之间，轻轻剪除剩余的软骨。此时耳蜗的顶端表面已暴露。

从基部开始，抓住蜗管顶部与耳蜗上皮相接的区域，打开蜗管。必要时轻轻剥离并修剪顶部结构，直至完全去除。修除残留在蜗管内侧的任何膜状组织。

然后清除导管中多余的间充质组织，并将导管从前庭系统上分离，以进行植块培养。将一个管腔面朝上放置于包被基质的玻璃底培养皿中央。小心吸去液体，静置两分钟。

然后逐滴加入150微升添加物的DMEM培养基至X explant，注意不要扰动组织，使其能够沉降到基质上。将玻璃底培养皿放入直径12厘米的深层培养皿中，并在其中放置一个盛有无菌水的小皿以维持湿度。

将培养物放入35摄氏度的培养箱中过夜，以使耳蜗组织贴附于基质并展平，以便进行活体成像。在选择样本后，使用荧光体视显微镜评估每个分离耳蜗的状态，仅选用从基部到顶端导管完整且已贴附于玻璃表面的组织样本。将培养箱设置为35摄氏度、5%CO2条件进行培养。

耳蜗组织：轻柔地吸去培养物中添加的DMEM，并替换为至少500 µL新鲜培养基。当组织块贴附不牢时，可用移液器在培养皿边缘周围滴加一圈培养基。这种额外液体将形成一个微型保湿环境，可在组织块继续附着于基质的同时，避免对其造成扰动。

本示例中的显微镜配备一个旋转平台，在层流罩下可容纳8个35毫米的样品培养皿。将塑料盖替换为玻璃盖，并将培养皿插入样品皿支架中。如果在实验过程中需要更换培养基。

为避免干扰外植体，使用带铰链的培养皿盖，以便在培养皿仍置于显微镜载物台上的情况下打开盖子。将样本培养皿放置于培养箱显微镜内时，需小心操作，避免使外植体从培养皿底部脱落或扰动培养基。设置成像程序时，打开显微镜紫外灯和相机，并启动成像软件。针对每个定位的样本，选择一个成像区域的焦平面和曝光参数，不仅要考虑实验开始时外植体的观察状态，还需预判组织在成像过程中的运动情况。

在荧光通道中，设置以选定焦平面为中心的Z轴层扫。然后设定实验的采样频率和采样时长。这将受限于采集图像所需的时间，因为最终需要在时间序列周期结束时生成一段视频。

使用 METAMORPH 等软件逐帧打开图像文件。选择最清晰的焦平面以展示目标细胞群体。最后，将图像转换为 dot avi 文件，或导出为图像拼接图，生成一组可在图像处理软件中打开和分析的图像，或将其转换为其他格式。

此处展示的视频演示了耳蜗类器官外植体在接种后如何生长。在胚胎13.5天（E 13.5）时，使用SOX2报告基因小鼠来显示前庭感觉区域，其中绿色代表非感觉区域的细胞分裂和移动。绿色的非增殖性感觉区域则经历组织重构和汇聚延伸运动。

另一个以不同耳蜗外植体中部基底区域为中心的时间推移实验表明，随着其在培养初期的延伸，感觉区域逐渐变窄。由于组织较厚，可以识别出表达区域，但无法分辨单个细胞。

然而，经过三天的培养后，组织已显著变平，使得在此操作步骤后能够观察到单个荧光细胞。此外，还可采用免疫荧光染色、蛋白质提取或RNA提取等其他方法，在分子水平上评估基因表达的变化。观看本视频后，您应已充分掌握如何解剖和培养耳蜗组织，以及如何利用培养箱显微镜对完整耳蜗组织进行连续数天的活体成像。