通过RNA测序分析鉴定调控EML造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

本实验的总体目标是利用RNA测序技术鉴定小鼠EML细胞自我更新与分化过程中潜在的关键调控因子。首先，根据细胞表面标志物将谱系阴性CD34阳性与谱系阴性CD34阴性的EML细胞进行分离；第二步，提取mRNA，将mRNA逆转录为cDNA，并构建测序文库。

接下来，对DNA文库进行高通量测序。最后一步是分析测序结果，寻找差异表达的转录因子。最终，利用RNA测序技术揭示谱系阴性CD34阳性与谱系阴性CD34阴性EML细胞中差异表达的转录因子。

相较于微阵列等其他基因表达谱分析方法，RNA测序的主要优势在于其更高的灵敏度、准确性和更宽的动态范围，且不依赖于已有的基因注释信息。该方法有助于回答干细胞研究领域中的关键问题，例如哪些是调控细胞自我更新与分化的关键转录因子。该技术的应用意义延伸至血液系统疾病的治疗，因为更深入地理解调控造血前体细胞自我更新与分化的关键因子，将有助于开发有效的治疗策略。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为测序分析需要使用多种生物信息学工具。用于收集干细胞因子的幼仓鼠肾细胞（BHK细胞）在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养，培养容器为25平方厘米的细胞培养瓶，培养条件为37°C及5% CO₂。当细胞融合度达到80%至90%时，使用胰蛋白酶消化，并在室温下以200 ×g离心5分钟收集细胞，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10毫升新鲜的BHK细胞培养基中。

将两毫升细胞悬液转移至一个新的75平方厘米的培养瓶中，并向培养瓶中加入48毫升新鲜的BHK细胞培养基。培养BHK细胞两天。

两天后，收集培养基，并通过 0.45 微米滤器传代。将培养基在 -20 °C 下保存。本方案中使用的小鼠红系、髓系和淋巴细胞（EML 细胞）在含有 BHK 细胞培养基的 EML 基础培养基中悬浮培养，培养条件为 37 °C 和 5% CO2。

将EML细胞维持在低密度培养，最高密度不超过每毫升600,000个细胞。每两到三天以1:5的传代比例进行细胞传代，轻柔操作，传代次数不超过10代，以耗尽谱系阳性细胞。通过在200 ×g下离心5分钟收集EML细胞。

用 PBS 洗涤细胞一次，弃去上清液后再次离心。将细胞重悬于 PBS 中，使用血细胞计数板对细胞进行计数。此细胞数量将用于确定后续步骤中的抗体浓度。

根据制造商说明书，使用谱系抗体混合物和磁性激活细胞分选系统分离谱系阴性或Lin阴性细胞。开始此操作时，将Lin阴性细胞在200 ×g下离心5分钟。用PBS重悬细胞沉淀，并用血细胞计数板计数细胞。

用fax缓冲液洗涤细胞两次。第二次洗涤后，在200 G下离心5分钟以收集细胞沉淀。将五个1.5毫升微量离心管分别标记为1、2、3、4和5。

用适量的染色缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度至每100微升含100万个细胞。随后将100微升细胞悬液分装至5个微量离心管中。向第1管和第2管中各加入1微克抗小鼠CD34 FE抗体。

轻轻混匀各管，将所有试管置于4°C避光孵育一小时。随后，向二号管中加入0.25微克PE标记的抗CA1抗体和20微升PC标记的谱系抗体混合物；向三号管中加入0.25微克PE标记的抗CA1抗体和20微升PC标记的谱系抗体混合物。

将混合抗体加入第四管。轻轻混匀各管，并在避光条件下于4°C孵育细胞额外30分钟。30分钟后，向所有管中加入300 µL固定缓冲液，于200 ×g离心5分钟以沉淀细胞。

最后一次洗涤后，用 500 微升 fax 缓冲液将细胞洗涤三次。将每份细胞沉淀重悬于 500 微升 fax 缓冲液中，通过荧光激活细胞分选法分离 1 号管中的 lin 阴性 SCA 阳性 CD34 阳性细胞以及 lin 阴性 SCA 阴性 CD34 阴性细胞。使用 triol 从 lin 阴性 CD34 阳性细胞和 lin 阴性 CD34 阴性细胞中提取总 RNA，并用脱氧核糖核酸酶 1 去除污染的 DNA。

根据制造商的说明书，使用生物分析仪评估总RNA的质量，仅使用RNA完整性数（RIN）大于9的RNA样品进行mRNA提取及后续文库构建。该图显示了一个高质量RNA样品的结果，其RIN值为9.4。此处使用的文库构建方案专用于Illumina RNA测序平台，并采用RNA样品制备试剂盒。

请遵循制造商提供的说明，因为本视频仅展示部分步骤。首先，使用寡聚dT磁珠对多聚MNA进行阳性选择。接着，对多聚mRNA进行片段化，并使用随机引物进行逆转录，将mRNA转化为cDNA。随后，利用合成的第二链cDNA生成双链DNA。

接下来，利用DNA聚合酶去除3'端突出，填补5'端突出。3'端使CD NA片段之间无法相互连接。在双链CD NA的两端添加多重测序索引接头。

最后，进行PCR以富集CD NA片段，并使用分光光度计测定扩增后DNA的260 nm处吸光度与280 nm处吸光度的比值。为获得文库浓度信息，需评估文库质量，并利用生物分析仪测定DNA片段的大小范围。RNA测序数据的分析方法详见配套的协议文本，包括用于下游分析的数据文件处理、新转录本的检测、表达水平的评估、差异表达基因的检测以及差异表达转录因子的鉴定。

Lin阴性EML细胞用抗CD34抗体和谱系混合抗体（lineage cocktail antibodies）进行染色，通过荧光激活细胞分选法分离出Lin阴性SCA-1阳性CD34阳性细胞以及Lin阴性SCA-1阴性CD34阴性细胞。分析SCA-1和CD34表达时，对Lin阴性细胞设门进行检测。

文库构建完成后观察到两群EML细胞。使用生物分析仪检测文库中DNA片段的大小。此代表性数据显示文库质量良好，但片段大小峰值约为300个碱基对。

采用 D-E-S-E-Q 算法进行差异表达分析，重点关注差异表达的转录因子，因为转录因子在硫酸盐测定中起关键作用。在 lin 阴性 CD34 阳性与 lin 阴性 CD34 阴性细胞之间，表达变化超过 1.5 倍的转录因子已被识别，并在此热图中展示。值得注意的是，TCF7 在 lin 阴性 CD34 阳性细胞中的相对表达水平比在 lin 阴性 CD34 阴性细胞中高出 100 倍以上。

因此，选择TCF7进行进一步的染色质免疫沉淀测序分析和功能验证，以确认其在EML细胞自我更新和分化调控中的功能。一旦掌握该技术，RNA文库可在数天内完成，若操作得当，整个实验流程在建立后约一个月内即可完成。该技术为研究人员探索不同类型细胞和组织（如B细胞与恶性B细胞）间的差异基因表达奠定了基础。

在进行该实验操作时，务必记住使用高浓度的CAR TRNA，因为它是整个RNA提取流程的基础。观看本视频后，您应能更好地理解如何鉴定调控EML细胞自我更新与分化的关键因子。