Name: 在EML造血前体细胞调节自我更新和分化的关键因素，通过RNA测序分析鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 了解如何使用RNA测序技术鉴定小鼠EML造血前体细胞自我更新和分化的关键转录因子。该方法通过分析Lin-CD34+和Lin-CD34-细胞亚群的差异表达基因，揭示调控干细胞命运的分子机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JQW、SZ、SD 和 KC 得到美国国立卫生研究院以及斯塔曼·奥格尔维基金—纪念赫尔曼基金会的资助。

1. 使用磁性细胞分选系统和荧光激活细胞分选法培养EML细胞并分离Lin-CD34+与Lin-CD34-细胞
<ol>
	<li>用于干细胞因子收集的幼仓鼠肾（BHK）细胞培养基的制备：
	<ol>
		<li>在细胞培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下，使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基在25 cm2培养瓶（表1）中培养BHK细胞。</li>
		<li>当细胞生长至80–90%融合度时，用10 ml PBS洗涤细胞一次。向单层细胞中加入5 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，室温（RT）孵育1–5分钟，直至细胞脱落。</li>
		<li>轻轻吹打溶液以分散细胞团块。向培养瓶中加入5 ml完全DMEM培养基以终止胰蛋白酶活性。在室温下以200 × g离心5分钟收集细胞。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml新鲜BHK细胞培养基中。</li>
		<li>从步骤1.1.4中取2 ml细胞悬液转移至新的75 cm2培养瓶中，并向瓶中加入48 ml新鲜BHK细胞培养基。</li>
		<li>继续培养BHK细胞两天后收集培养上清液。经0.45 μm滤膜过滤后，于-20 °C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EML细胞培养：
	<ol>
		<li>在细胞培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下，将EML细胞（悬浮生长）培养于含有BHK细胞培养基的EML基础培养基中（表1）。</li>
		<li>维持EML细胞在较低细胞密度（0.5–5 × 105 个细胞/ml），最高密度不超过6 × 105 个细胞/ml。每2–3天按1:5比例传代一次。传代操作应轻柔进行，且在传代至第10代后弃用细胞系。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除谱系阳性细胞：
	<ol>
		<li>以200 × g离心5分钟收集EML细胞，并用PBS洗涤一次。再次以200 × g离心5分钟收集细胞。</li>
		<li>用PBS重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。根据细胞数量确定后续细胞分离步骤中的抗体浓度（请参考细胞分离系统供应商提供的说明书）。</li>
		<li>使用谱系抗体混合物（包含生物素标记的单克隆抗体CD5、CD45R（B220）、CD11b、Anti-Gr-1（Ly-6G/C）、7-4和Ter-119）及磁性激活细胞分选系统，按照制造商说明分离谱系阴性（Lin-）细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离Lin-CD34+和Lin-CD34-细胞：
	<ol>
		<li>将来自步骤1.3.3的Lin-细胞以200 × g离心5分钟。用PBS重悬细胞沉淀，并使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
		<li>用FACS缓冲液洗涤细胞两次，每次以200 × g离心5分钟收集细胞。</li>
		<li>标记五个1.5 ml微量离心管，分别编号为1、2、3、4、5。每106个细胞用100 µl FACS缓冲液重悬（每管含106个细胞）。</li>
		<li>向第1管和第2管中各加入1 µg Anti-Mouse CD34 FITC抗体，并轻轻混匀。</li>
		<li>将所有管置于4 °C避光孵育1小时。</li>
		<li>向第1管中加入0.25 µg PE标记的Anti-Sca1抗体和20 µl APC标记的谱系抗体混合物，向第3管中加入0.25 µg PE标记的Anti-Sca1抗体，向第4管中加入20 µl APC标记的谱系抗体混合物。</li>
		<li>轻轻混匀所有管，继续在4 °C避光孵育30分钟。</li>
		<li>向各管中加入300 µl FACS缓冲液，以200 × g离心5分钟收集细胞。</li>
		<li>用500 µl FACS缓冲液洗涤细胞三次。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于500 µl FACS缓冲液中。</li>
		<li>使用第2、3、4和5管中的细胞设置补偿。利用FACS Aria仪器从第1管中分选Lin-SCA+CD34+和Lin-SCA-CD34-细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 高通量测序的RNA制备与文库构建
<ol>
	<li>RNA的提取、质量分析与定量：
	<ol>
		<li>分别使用TRIzol试剂，按照制造商提供的操作说明，从Lin-CD34+和Lin-CD34-细胞中提取总RNA。</li>
		<li>使用脱氧核糖核酸酶I（DNase I）去除污染的DNA，操作步骤遵循制造商说明书。可选：在此步骤将RNA于-80 °C保存，以备后续使用。</li>
		<li>根据供应商提供的操作指南，使用Bioanalyzer评估总RNA的质量。选择RNA完整性编号（RIN）大于9的RNA样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库构建与高通量测序： 
	注意：本实验方案描述的是基于Illumina平台的RNA测序。对于其他测序平台，需采用不同的文库制备方法。
	<ol>
		<li>每份样品使用0.1–4 µg高质量的总RNA进行文库制备。通常情况下，从105个EML细胞中可提取约2 µg总RNA。</li>
		<li>根据试剂供应商提供的详细标准操作流程，使用RNA测序文库制备系统进行RNA纯化与片段化、第一链和第二链cDNA合成、末端修复、3'端腺苷酸化、接头连接以及PCR扩增。
		<ol>
			<li>使用寡聚dT磁珠正向富集PolyA mRNA，并对mRNA进行片段化处理。</li>
			<li>使用随机引物进行逆转录反应获得cDNA，随后合成第二链cDNA，生成双链cDNA（dscDNA）。</li>
			<li>利用DNA聚合酶去除3'突出端并填补5'突出端；对3'端进行腺苷酸化修饰，防止cDNA片段相互连接。</li>
			<li>在双链cDNA两端连接多重索引接头，并通过PCR扩增富集DNA片段。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用分光光度计测定A260/A280比值，以获取文库浓度信息。</li>
		<li>使用Bioanalyzer评估文库质量，并测定DNA片段的大小分布范围。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据分析
有关本部分所用软件的参考信息，请参见（表2）。
<ol>
	<li>用于下游分析的数据文件处理：
	<ol>
		<li>使用 CASAVA 软件（Illumina，版本 1.8.2）将 .bcl（碱基识别文件）转换为 .fastq 文件。
		<ol>
			<li>在 Linux 系统中启动“终端”。进入包含 Illumina HiSeq2000 测序仪生成数据文件的文件夹。假设结果文件夹为“NASboy1/JiaqianLabData/HiSeq_RUN/2013_07_11/130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX/”，输入 图 S1A 中的命令，并进入该数据文件夹。</li>
			<li>在 Linux 系统中安装 CASAVA 1.8.2。假设输出文件夹为“Unaligned”，使用 图 S1B 中的命令准备用于转换的配置文件。使用选项 --fastq-cluster-count 0 以确保每个样本仅生成一个 .fastq 文件。生成的 .fastq 文件为 .gz 格式。解压该文件以用于下游分析（图 S1B）。</li>
			<li>在“Unaligned”文件夹生成后，进入该文件夹（图 S1C）。</li>
			<li>使用 图 S1D 中的命令开始转换过程。“-j”参数指定将使用的 CPU 数量。</li>
			<li>系统完成转换过程后，进入“Unaligned”文件夹下的结果文件夹（图 S1E）。</li>
			<li>使用 图 S1F 中的命令将每个样本文件夹下的 .fastq.gz 文件解压缩为 .fastq 文件。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Tuxedo Suite26 检测新转录本并评估表达水平：
	<ol>
		<li>使用 Tophat 软件（版本 1.3.3）27 将成对末端 RNA-Seq 读段比对至小鼠参考基因组（UCSC 版本 mm9，来自 <a href="http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html" target="_blank">http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html</a>），该软件使用 Bowtie 读段比对器（版本 0.12.7）28。Tophat 使用“-no-novel-juncs”选项以提高表达水平估计的准确性。
		<ol>
			<li>将 .fastq 文件放入将执行比对过程的文件夹中。假设一个成对末端测序样本包含 2 个 .fastq 文件（重命名为 Example1.read1 和 Example1.read2），使用 图 S2 中的命令进行比对（根据系统设置调整参数）。“-p”参数指定将使用的 CPU 数量。“–r”和“–mate-std-dev”参数可从文库质控数据中获得，或从部分比对读段中推断（图 S2）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 Cufflinks 软件（版本 1.3.0）29 将比对后的读段组装为 RNA 转录本。运行 Cufflinks 时使用已知基因的注释文件（与 Tophat 使用的相同 .gtf 文件）以及 Tophat 生成的 .bam 文件。
		<ol>
			<li>Tophat 运行完成后，在同一文件夹中使用 图 S3A 中的命令运行 cufflinks，以构建转录组并估计转录本表达水平。“GenomeSeqMM9”文件夹中的“mm9_repeatMasker.gtf”和基因组序列文件可从 UCSC 基因组浏览器获取。</li>
			<li>生成的 genes.expr 和 transcripts.expr 文件包含基因和转录本（异构体）的表达值。将文件内容复制并粘贴至 Excel 文件中，并使用电子表格应用程序进行处理（图 S3B）。</li>
			<li>使用 图 S3C 中的命令将生成的“transcripts.gtf”文件与参考“mm9_genes.gtf”文件进行比较，以识别新转录本。</li>
			<li>生成的 .tmap 文件包含比较结果。将文件内容复制并粘贴至 Excel 文件中，并使用电子表格应用程序进行处理。与提供的参考 .gtf 文件相比，类别代码为“u”的转录本可视为“新转录本”（图 S3D）。 
			注意：为方便下游分析，若 FPKM 值低于 0.1，则将其设为 0.1。 
			注意：步骤 3.2.3 - 3.2.6 对希望提高新转录本表达量估计准确性的用户为可选步骤。此过程耗时较长，因为比对和转录组构建需运行多次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用默认参数运行 Tophat，然后使用 图 S3E 中的命令运行 cufflinks 以生成 .gtf 文件。</li>
		<li>使用 图 S3F 中的命令将生成的 .gtf 文件与参考基因组 .gtf 文件进行比较。</li>
		<li>按照 步骤 3.2.2.4 所述解析生成的 .tmap 文件。将文件内容复制并粘贴至 Excel 文件中，并使用电子表格应用程序进行处理。与提供的参考 .gtf 文件相比，类别代码为“u”的转录本可视为“新转录本”。</li>
		<li>在完成 步骤 3.2.5 后，文件夹中将生成一个 .combined.gtf 文件，可用作参考 .gtf 文件。可按照 步骤 3.2.1 和 步骤 3.2.2 所述再次运行 Tophat 和 cufflinks，以获得更准确的新转录本 FPKM 估计值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 DESeq 软件包检测差异表达基因30。
	<ol>
		<li>DESeq 的输入为原始读段计数表。为获得该表，使用随 HTSeq Python 软件包分发的 htseq-count 脚本，该脚本可从 HTSeq 网站下载（<a href="http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html" target="_blank">http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html</a>）。
		<ol>
			<li>确保系统中已安装 samtools、python 和 htseq-count 程序。使用 图 S4A 中的命令从 tophat 输出中获取原始读段计数值。</li>
			<li>使用 Excel 准备“Raw_Count_Table.txt”和“ExperimentDesign.txt”文件。将内容复制并以 .txt 格式保存，供 DESeq R 软件包使用（图 S4B）。</li>
			<li>在系统中安装 R 程序。在终端中输入“R”并按回车键。屏幕将显示如 图 S4C 所示的消息。</li>
			<li>使用 图 S4D 中的命令将“Raw_Count_Table.txt”和“ExperimentDesign.txt”读入 R。</li>
			<li>使用 图 S4E 中的命令加载 DESeq 软件包。</li>
			<li>在 R 中对条件进行因子化处理（图 S4F）。</li>
			<li>使用 图 S4G 中的命令在标准化计数表上运行负二项检验。</li>
			<li>使用 图 S4H 中的命令将显著差异表达基因输出至 .csv 文件。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Excel 查找转录因子（TFs）在各样本中的 FPKM 值。对差异表达基因表和转录因子表进行交集分析，同时存在于两个表中的基因为差异表达的转录因子。
	<ol>
		<li>访问网站 <a href="http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php" target="_blank">http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php</a> 下载转录因子数据，然后在 Excel 中查找差异表达的转录因子（图 S5）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成用于 UCSC 基因组浏览器可视化的 .bigwig 文件。
	<ol>
		<li>从网站 <a href="https://github.com/arq5x/bedtools2" target="_blank">https://github.com/arq5x/bedtools2</a> 下载“bedtools”软件包并在系统中安装31。从网站 <a href="http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/" target="_blank">http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</a> 下载 UCSC 工具“bedGraphToBigWig”并在系统中安装。</li>
		<li>在包含 .bam 文件的文件夹中，使用 图 S6A 中的命令将 tophat 生成的 .bam 文件转换为 .bed 文件。</li>
		<li>.bed 文件生成后，使用 图 S6B 中的命令生成 .bigwig 文件。“ChromInfo.txt”文件可从以下网址获取：<a href="http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz" target="_blank">http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz</a>。</li>
		<li>在 UCSC 基因组浏览器中查看自定义轨道。有关如何使用 UCSC 基因组浏览器显示自定义轨道的信息，请参考网站 <a href="http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html</a>。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="DNA测序数据分析工作流程；生成fastq文件和HiSeq设置的命令行步骤。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure S1"> 
图S1：使用CASAVA软件将.bcl文件转换为.fastq文件。
<img alt="生物信息学实验中使用Tophat进行RNA-Seq数据比对的命令行界面。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure S2"> 
图S2：使用Tophat将测序读段比对到参考基因组。
<img alt="基因表达分析；Cufflinks、Cuffcompare 命令和 TopHat，电子表格结果。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure S3"> 
图 S3：新转录本的检测与表达水平估计。
<img alt="使用 R 和 DESeq 进行差异基因表达分析流程；命令行与表格设置。" fo:content-width="3.4in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 S4"> 
图 S4：使用 DESeq 软件包进行差异表达基因分析。
<img alt="动物转录因子数据库表格；基因符号、样本、倍数变化分析显示。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure S5"> 
图S5：差异表达转录因子的鉴定。
<img alt="BAM 转 BED 和 BED 转 BigWig 命令；数据转换流程图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure S6"> 
图 S6：将比对结果转换用于数据可视化。

<ol><li>Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+aging%3A+wrinkles+in+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential.</a> Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf7+is+an+important+regulator+of+the+switch+of+self-renewal+and+differentiation+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line.</a> PLoS genetics. 8, (2012).</li>
<li>Ye, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interactions+in+EML+cell+stimulation+by+stem+cell+factor+and+IL-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).</li>
<li>Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphohematopoietic+progenitors+immortalized+by+a+retroviral+vector+harboring+a+dominant-negative+retinoic+acid+receptor+can+recapitulate+lymphoid%2C+myeloid%2C+and+erythroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development.</a> Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).</li>
<li>Weiler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D3%3A+a+gene+induced+during+myeloid+cell+differentiation+of+Linlo+c-Kit%2B+Sca-1%28%2B%29+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells.</a> Blood. 93, 527-536 (1999).</li>
<li>Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+precursor+cells+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Chu, Y., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing%3A+platform+selection%2C+experimental+design%2C+and+data+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acid+therapeutics%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation.</a> Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).</li>
<li>Hornett, E. A., Wheat, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RNA-Seq+analysis+in+non-model+species%3A+assessing+transcriptome+assemblies+as+a+scaffold+and+the+utility+of+evolutionary+divergent+genomic+reference+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species.</a> BMC genomics. 13, 361(2012).</li>
<li>Eswaran, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+cancer+reveals+novel+splicing+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations.</a> Scientific reports. 3, 1689(2013).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptomes+during+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+revealed+by+short%2C+long%2C+and+paired-end+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).</li>
<li>Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+of+Arabidopsis+pollen+uncovers+novel+transcription+and+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing.</a> Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).</li>
<li>Edgren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fusion+genes+in+breast+cancer+by+paired-end+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing.</a> Genome biology. 12, 6(2011).</li>
<li>Ilott, N. E., Ponting, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+long+non-coding+RNAs+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing.</a> Methods. 63, 50-59 (2013).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+novel+long+non-coding+RNAs+based+on+RNA-Seq+data+of+mouse+Klf1+knockout+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study.</a> BMC bioinformatics. 13, 331(2012).</li>
<li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).</li>
<li>Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+sequencing+of+the+siRNAs+associated+with+peach+latent+mosaic+viroid+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection.</a> BMC molecular biology. 11, 16(2010).</li>
<li>Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+nucleotide+variations+in+expressed+exons+of+the+human+genome+using+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq.</a> Nucleic acids research. 37, 106(2009).</li>
<li>Djari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-based+single+nucleotide+polymorphism+discovery+in+bovine+muscle+using+next-generation+transcriptomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing.</a> BMC genomics. 14, 307(2013).</li>
<li>Murphy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+studies+using+microarrays%3A+principles%2C+problems%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+physiology+education%22%5BJournal%5D)">Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects.</a> Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+characterization+of+spinal+cord+injury+transcriptome+in+acute%2Fsubacute+phases%3A+a+resource+for+understanding+the+pathology+at+the+systems+level%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level.</a> PLoS one. 8, 72567(2013).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome research. 18, 1509-1517 (2008).</li>
<li>Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+analyze+gene+expression+using+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">How to analyze gene expression using RNA-sequencing data.</a> Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).</li>
<li>Glenn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+guide+to+next-generation+DNA+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Field guide to next-generation DNA sequencers.</a> Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nature protocols. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome biology. 10, 25(2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nature. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome biology. 11, 106(2010).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Cheranova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+transcriptomes+in+thrombin-treated+and+control+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnimalTFDB%3A+a+comprehensive+animal+transcription+factor+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database.</a> Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+transcribed+loci+in+ENCODE+regions+using+RACE+sequencing+reveals+extensive+transcription+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome.</a> Genome Biol. 9, 3(2008).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+RT-PCR+recovery+of+full-length+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones.</a> Biotechniques. 36, 690-696 (2004).</li>
<li>Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+rat+genes+by+TWINSCAN+gene+prediction%2C+RT-PCR%2C+and+direct+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing.</a> Genome Res. 14, 665-671 (2004).</li>
<li>Dewey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+novel+human+genes+through+simultaneous+gene+prediction+in+human%2C+mouse%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat.</a> Genome Res. 14, 661-664 (2004).</li>
<li>Wu, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+J+%22Characterize+Mammalian+Transcriptome+Complexity%22">Characterize Mammalian Transcriptome Complexity</a>. , LAP Lambert Academic Publishing. (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

哺乳动物转录组非常复杂34-38RNA-Seq 技术在转录组分析、新转录本检测和单核苷酸变异发现的研究中正发挥着日益重要的作用 等等。 与其他基因表达分析方法相比，它具有多种优势。如引言中所述，该方法克服了微阵列的杂交假象问题，并可用于鉴定新转录本 从头合成RNA测序的一个局限性在于其读长相对较短，与桑格测序相比尤其如此。然而，随着测序技术的快速进步，读长正在持续增加。本文提供了利用该技术鉴定小鼠EML细胞自我更新与分化过程中潜在关键调控因子的详细方法。
本方案的第一个关键步骤是 EML 细胞培养。尽管 EML 是一种造血前体细胞系，可在干细胞因子（SCF）存在下大量扩增，但其培养条件相比常规永生化细胞系需要更加细致的控制。细胞应定期换液并传代，操作需轻柔；否则细胞的自我更新与分化特性可能发生改变，并出现细胞死亡。在收集到足够数量的细胞后，我们首先利用磁性激活细胞分选系统分离出谱系阴性细胞，随后通过荧光激活细胞分选法将 CD34+ 与 CD34- 细胞分开。通常在用于 RNA 提取前，EML 细胞传代不应超过...

造血干细胞是一类稀有的血细胞，主要存在于成体骨髓微环境中，负责生成补充血液系统和免疫系统所需的各类细胞。1作为一类干细胞，HSCs 具备自我更新和分化的能力。阐明调控 HSCs 命运抉择（即自我更新或分化）的机制，将为 HSCs 在血液疾病研究和临床应用中的操控提供有价值的指导。2研究人员面临的一个问题是，造血干细胞（HSCs）可以在体外维持和扩增 体外 在极有限的程度上；其绝大多数子代在培养过程中仅部分分化2.
为了在全基因组范围内鉴定调控自我更新和分化过程的关键调节因子，我们采用小鼠原始造血祖细胞系 EML 作为模型系统。该细胞系来源于小鼠骨髓3,4。在不同生长因子的作用下，EML 细胞可在体外分化为红系、髓系和淋巴系细胞in vitro5。重要的是，该细胞系可在含有干细胞因子（SCF）的培养基中大量扩增，并仍保持其多向分化潜能。根据表面标志物 CD34 和 SCA 的表达，EML 细胞可分离为具有自我更新能力的 Lin-SCA+CD34+ 亚群和部分分化的 Lin-SCA-CD34- 亚群6。与短期造血干细胞类似，SCA+CD34+ 细胞具有自我更新能力。在 SCF 处理下，Lin-SCA+CD34+ 细胞可快速再生出混合的 Lin-SCA+CD34+ 和 Lin-SCA-CD34- 细胞群体，并持续增殖6。这两个细胞群体在形态上相似，且 c-kit mRNA 和蛋白水平相近6。Lin-SCA-CD34- 细胞则可在含有 IL-3 而非 SCF 的培养基中传代扩增3。揭示 EML 细胞命运决定过程中的关键调控因子，将有助于深入理解造血过程中早期发育转变的细胞与分子机制。
为了研究具有自我更新能力的 Lin-SCA+CD34+ 细胞与部分分化的 Lin-SCA-CD34- 细胞之间潜在的分子差异，我们采用 RNA-Seq 技术来鉴定差异表达基因。特别是我们关注转录因子，因为转录因子在决定细胞命运中起着关键作用。RNA-Seq 是一种近期发展起来的方法，利用下一代测序（NGS）技术的能力对基因组转录出的 RNA 进行定性和定量分析7,8。简而言之，首先将总 RNA 进行 poly-A 筛选并打断，作为初始模板。随后，利用逆转录酶将 RNA 模板转化为 cDNA。为了准确比对全长 RNA 转录本，构建 cDNA 文库时使用完整且未降解的 RNA 至关重要。为进行测序，需在 cDNA 的两端连接特定的接头序列。随后，在大多数情况下，通过 PCR 扩增 cDNA 分子，并以高通量方式测序。
测序完成后，可将获得的序列读段比对至参考基因组和转录组数据库。通过统计比对到参考基因的读段数量，可利用该信息估算基因表达水平。此外，这些读段还可进行拼接组装。 从头合成 在缺乏参考基因组的情况下，实现对非模式生物转录组的研究9RNA-seq 技术也已用于检测剪接异构体10-12，新转录本13 和基因融合14除了检测蛋白质编码基因外，RNA-Seq 还可用于检测新发现的非编码 RNA 并分析其转录水平，例如长链非编码 RNA15,16，microRNA17，siRNA 等等。18由于该方法的高准确性，已被用于单核苷酸变异的检测19,20.
在RNA-Seq技术出现之前，基因表达谱分析主要采用微阵列（microarray）方法。预先设计的探针被合成并固定在固相表面，制成微阵列芯片21。提取mRNA并将其反转录为cDNA。在反转录过程中，荧光标记的核苷酸被掺入cDNA，随后该cDNA可与微阵列芯片上的探针杂交。特定点位所采集信号的强度取决于结合到该点位特异性探针上的cDNA量21。与RNA-Seq技术相比，微阵列存在若干局限性。首先，微阵列依赖于已有的基因注释信息，而RNA-Seq技术能够检测新转录本，但其相对较高的背景水平限制了在低表达基因检测中的应用。此外，RNA-Seq技术的检测动态范围更大（可达8,000倍）7，而微阵列由于信号背景和饱和效应，对高表达和低表达基因的检测准确性均受限7,22。最后，微阵列探针的杂交效率各不相同，导致在同一份样本中比较不同转录本的相对表达水平时结果可靠性降低23。尽管RNA-Seq相比微阵列具有诸多优势，但其数据分析较为复杂，这也是目前仍有许多研究人员选择使用微阵列而非RNA-Seq的原因之一。RNA-Seq的数据处理与分析需要使用多种生物信息学工具24。
在多种下一代测序（NGS）平台中，454、Illumina、SOLID 和 Ion Torrent 是目前应用最广泛的平台。454 是首个商业化的 NGS 平台。与其他测序平台（如 Illumina 和 SOLID）相比，454 平台可产生更长的读长（平均读长为 700 个碱基）25。由于其更高的组装效率，较长的读长更适用于转录组的初步表征25。454 平台的主要缺点是每兆碱基序列的测序成本较高。Illumina 和 SOLID 平台则产生数量更多但长度较短的读段，每兆碱基序列的测序成本远低于 454 平台。由于 Illumina 和 SOLID 平台产生的短读段数量庞大，数据分析所需的计算资源显著增加。Ion Torrent 平台的测序仪器和试剂价格较低，测序时间也更短25。然而，其错误率和每兆碱基序列的测序成本相较于 Illumina 和 SOLID 平台更高。不同平台各有优缺点，且需要不同的数据分析方法。应根据测序目的和资金可用性选择合适的平台。
本文以Illumina RNA-Seq平台为例，采用EML细胞作为模型系统，研究EML细胞自我更新与分化过程中的关键调控因子，并提供了RNA-Seq文库构建及数据分析的详细方法，用于基因表达水平的计算和新转录本的检测。我们此前的研究已表明，在EML模型系统中结合功能验证实验（例如 shRNA敲低）进行RNA-seq研究2，是解析造血分化早期阶段分子机制的有力手段，也可作为细胞自我更新与分化研究的通用模型。

<table><tbody><tr><td>抗生素-抗真菌素</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>BHK 细胞培养</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD34 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0341-81</td><td>FACS 分选</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-81</td><td>FACS 分选</td></tr><tr><td>APC 小鼠谱系抗体混合物</td><td>BD Biosciences</td><td>558074</td><td>FACS 分选</td></tr><tr><td>BD FACSAria 细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td>Special offer sysmtem</td><td>FACS 分选</td></tr><tr><td>Corning&amp;trade; 细胞培养处理培养瓶 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Corning incorporated</td><td>430641</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Corning&amp;trade; 细胞培养处理培养瓶 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Corning incorporated</td><td>430639</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I，扩增级</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td>文库制备</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>BHK 细胞培养</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>16140071</td><td>BHK 细胞培养</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Invitrogen</td><td>16050-122</td><td>EML 细胞培养</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>HyClone</td><td>SH30228.02</td><td>EML 细胞培养</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>谱系细胞耗竭试剂盒，小鼠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>谱系阴性细胞的分离</td></tr><tr><td>NanoVue Plus 分光光度计</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9569-62</td><td>质量控制</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Napco&amp;trade; 8000 水套式 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-497-002</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>EML 细胞培养</td></tr><tr><td>TRIzol&amp;reg; 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>TruSeq&amp;trade; RNA 样本制备试剂盒 v2 - B 套装（48 次反应）</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2002</td><td>文库制备</td></tr><tr><td>2100 电泳生物分析仪</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td>质量控制</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td>细胞培养</td></tr></tbody></table>

通过rna测序分析鉴定调控eml造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

造血干细胞（HSCs）在临床上用于移植治疗，以重建白血病和淋巴瘤等多种疾病患者的造血系统。阐明调控HSC自我更新与分化的机制，对于HSC在科研和临床应用中的发展具有重要意义。然而，由于HSC无法大量增殖，难以获得足量的HSCs 体外为克服这一难题，本研究采用小鼠骨髓来源的 EML（红系、髓系和淋巴系）细胞系作为模型系统。
RNA测序（RNA-Seq）已越来越多地用于取代基因芯片进行基因表达研究。本文报道了一种利用RNA-Seq技术研究调控EML细胞自我更新与分化潜在关键因子的详细方法。本论文提供的实验方案分为三个部分。第一部分介绍如何培养EML细胞并分离Lin-CD34+和Lin-CD34-细胞。第二部分提供了总RNA提取及后续高通量测序文库构建的详细步骤。最后一部分描述了RNA-Seq数据分析方法，并解释如何利用这些数据鉴定Lin-CD34+与Lin-CD34-细胞之间差异表达的转录因子。其中显著差异表达的转录因子被鉴定为可能调控EML细胞自我更新与分化的关键调控因子。在本文的讨论部分，我们重点强调了实验成功实施的关键步骤。
综上所述，本文提供了一种利用RNA-Seq技术鉴定EML细胞自我更新与分化潜在调控因子的方法。所鉴定的关键因子将进行下游功能分析。 体外 和 体内.

为了分析 Lin-CD34+ 和 Lin-CD34- EML 细胞中差异表达的基因，我们采用了 RNA-Seq 技术。图 1 展示了实验流程。通过磁珠细胞分选法分离出谱系阴性细胞后，我们使用 FACS Aria 分选出 Lin-SCA+CD34+ 和 Lin-SCA-CD34- 细胞。谱系富集的 EML 细胞用抗 CD34、抗 Sca1 及谱系混合抗体进行染色。仅对 Lin- 细胞设门，以分析 Sca1 和 CD34 的表达。通过 FACS 分析可观察到两个细胞群（SCA+CD34+ 和 SCA-CD34- EML 细胞）（图 2）6。
细胞分离后，我们分别从CD34+和CD34-细胞中提取总RNA，并分析RNA的质量。RNA-Seq数据的准确性在很大程度上依赖于RNA-Seq文库的质量，而总RNA的质量对于构建高质量文库至关重要。高质量的RNA样品其OD 260/280值应在1.8至2.0之间。除了使用分光光度计外，还利用Bioanalyzer更精确地评估RNA质量。图3</...

采用RNA测序和生物信息学分析方法，鉴定小鼠EML细胞中Lin-CD34+和Lin-CD34-亚群内显著差异表达的转录因子。这些转录因子可能在调控自我更新的Lin-CD34+细胞与部分分化的Lin-CD34-细胞之间的转换过程中发挥重要作用。

通过RNA测序分析鉴定调控EML造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

造血干细胞（HSCs）在临床上用于移植治疗，以重建多种疾病患者的造血系统，例如……

本实验的总体目标是利用RNA测序技术鉴定小鼠EML细胞自我更新与分化过程中潜在的关键调控因子。首先，根据细胞表面标志物将谱系阴性CD34阳性与谱系阴性CD34阴性的EML细胞进行分离；第二步，提取mRNA，将mRNA逆转录为cDNA，并构建测序文库。接下来，对DNA文库进行高通量测序。最后一步是分析测序结果，寻找差异表达的转录因子。最终，利用RNA测序技术揭示谱系阴性CD34阳性与谱系阴性CD34阴性EML细胞中差异表达的转录因子。相较于微阵列等其他基因表达谱分析方法，RNA测序的主要优势在于其更高的灵敏度、准确性和更宽的动态范围，且不依赖于已有的基因注释信息。该方法有助于回答干细胞研究领域中的关键问题，例如哪些是调控细胞自我更新与分化的关键转录因子。该技术的应用意义延伸至血液系统疾病的治疗，因为更深入地理解调控造血前体细胞自我更新与分化的关键因子，将有助于开发有效的治疗策略。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为测序分析需要使用多种生物信息学工具。用于收集干细胞因子的幼仓鼠肾细胞（BHK细胞）在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养，培养容器为25平方厘米的细胞培养瓶，培养条件为37°C及5% CO₂。当细胞融合度达到80%至90%时，使用胰蛋白酶消化，并在室温下以200 ×g离心5分钟收集细胞，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10毫升新鲜的BHK细胞培养基中。将两毫升细胞悬液转移至一个新的75平方厘米的培养瓶中，并向培养瓶中加入48毫升新鲜的BHK细胞培养基。培养BHK细胞两天。两天后，收集培养基，并通过 0.45 微米滤器传代。将培养基在 -20 °C 下保存。本方案中使用的小鼠红系、髓系和淋巴细胞（EML 细胞）在含有 BHK 细胞培养基的 EML 基础培养基中悬浮培养，培养条件为 37 °C 和 5% CO2。将EML细胞维持在低密度培养，最高密度不超过每毫升600,000个细胞。每两到三天以1:5的传代比例进行细胞传代，轻柔操作，传代次数不超过10代，以耗尽谱系阳性细胞。通过在200 ×g下离心5分钟收集EML细胞。用 PBS 洗涤细胞一次，弃去上清液后再次离心。将细胞重悬于 PBS 中，使用血细胞计数板对细胞进行计数。此细胞数量将用于确定后续步骤中的抗体浓度。根据制造商说明书，使用谱系抗体混合物和磁性激活细胞分选系统分离谱系阴性或Lin阴性细胞。开始此操作时，将Lin阴性细胞在200 ×g下离心5分钟。用PBS重悬细胞沉淀，并用血细胞计数板计数细胞。用fax缓冲液洗涤细胞两次。第二次洗涤后，在200 G下离心5分钟以收集细胞沉淀。将五个1.5毫升微量离心管分别标记为1、2、3、4和5。用适量的染色缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度至每100微升含100万个细胞。随后将100微升细胞悬液分装至5个微量离心管中。向第1管和第2管中各加入1微克抗小鼠CD34 FE抗体。轻轻混匀各管，将所有试管置于4°C避光孵育一小时。随后，向二号管中加入0.25微克PE标记的抗CA1抗体和20微升PC标记的谱系抗体混合物；向三号管中加入0.25微克PE标记的抗CA1抗体和20微升PC标记的谱系抗体混合物。将混合抗体加入第四管。轻轻混匀各管，并在避光条件下于4°C孵育细胞额外30分钟。30分钟后，向所有管中加入300 µL固定缓冲液，于200 ×g离心5分钟以沉淀细胞。最后一次洗涤后，用 500 微升 fax 缓冲液将细胞洗涤三次。将每份细胞沉淀重悬于 500 微升 fax 缓冲液中，通过荧光激活细胞分选法分离 1 号管中的 lin 阴性 SCA 阳性 CD34 阳性细胞以及 lin 阴性 SCA 阴性 CD34 阴性细胞。使用 triol 从 lin 阴性 CD34 阳性细胞和 lin 阴性 CD34 阴性细胞中提取总 RNA，并用脱氧核糖核酸酶 1 去除污染的 DNA。根据制造商的说明书，使用生物分析仪评估总RNA的质量，仅使用RNA完整性数（RIN）大于9的RNA样品进行mRNA提取及后续文库构建。该图显示了一个高质量RNA样品的结果，其RIN值为9.4。此处使用的文库构建方案专用于Illumina RNA测序平台，并采用RNA样品制备试剂盒。请遵循制造商提供的说明，因为本视频仅展示部分步骤。首先，使用寡聚dT磁珠对多聚MNA进行阳性选择。接着，对多聚mRNA进行片段化，并使用随机引物进行逆转录，将mRNA转化为cDNA。随后，利用合成的第二链cDNA生成双链DNA。接下来，利用DNA聚合酶去除3'端突出，填补5'端突出。3'端使CD NA片段之间无法相互连接。在双链CD NA的两端添加多重测序索引接头。最后，进行PCR以富集CD NA片段，并使用分光光度计测定扩增后DNA的260 nm处吸光度与280 nm处吸光度的比值。为获得文库浓度信息，需评估文库质量，并利用生物分析仪测定DNA片段的大小范围。RNA测序数据的分析方法详见配套的协议文本，包括用于下游分析的数据文件处理、新转录本的检测、表达水平的评估、差异表达基因的检测以及差异表达转录因子的鉴定。Lin阴性EML细胞用抗CD34抗体和谱系混合抗体（lineage cocktail antibodies）进行染色，通过荧光激活细胞分选法分离出Lin阴性SCA-1阳性CD34阳性细胞以及Lin阴性SCA-1阴性CD34阴性细胞。分析SCA-1和CD34表达时，对Lin阴性细胞设门进行检测。文库构建完成后观察到两群EML细胞。使用生物分析仪检测文库中DNA片段的大小。此代表性数据显示文库质量良好，但片段大小峰值约为300个碱基对。采用 D-E-S-E-Q 算法进行差异表达分析，重点关注差异表达的转录因子，因为转录因子在硫酸盐测定中起关键作用。在 lin 阴性 CD34 阳性与 lin 阴性 CD34 阴性细胞之间，表达变化超过 1.5 倍的转录因子已被识别，并在此热图中展示。值得注意的是，TCF7 在 lin 阴性 CD34 阳性细胞中的相对表达水平比在 lin 阴性 CD34 阴性细胞中高出 100 倍以上。因此，选择TCF7进行进一步的染色质免疫沉淀测序分析和功能验证，以确认其在EML细胞自我更新和分化调控中的功能。一旦掌握该技术，RNA文库可在数天内完成，若操作得当，整个实验流程在建立后约一个月内即可完成。该技术为研究人员探索不同类型细胞和组织（如B细胞与恶性B细胞）间的差异基因表达奠定了基础。在进行该实验操作时，务必记住使用高浓度的CAR TRNA，因为它是整个RNA提取流程的基础。观看本视频后，您应能更好地理解如何鉴定调控EML细胞自我更新与分化的关键因子。

identification-key-factors-regulating-self-renewal-differentiation

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在EML造血前体细胞调节自我更新和分化的关键因素，通过RNA测序分析鉴定

本文描述了一种从造血干细胞/祖细胞体外生成成熟人红细胞的 ex vivo 实验方案。此外，我们还介绍了一种高效的慢病毒递送方法，用于在原代红系细胞中敲低转录因子 TAL1。通过表达 GFP...

慢病毒介导的基因敲低过程 离体 人类造血干细胞的红细胞生成

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

单细胞基因表达检测对于理解干细胞异质性至关重要。...

通过定量RT-PCR对单个人类胚胎干细胞进行基因表达谱分析

在分化中的胚胎干细胞（ESCs）中调控基因的时间特异性表达，可利用诱导型基因系统实现。然而，构建此类细胞系成本较高且耗时较长。本实验方案可实现外源基因在分化中的ES来源细胞中的快速表达，并进一步分析其下游的造血分化过程。...

逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体细胞以分析造血分化

本文所述方案详细介绍了通过过表达少量转录因子，在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导造血程序的方法。该技术可被拓展至人类体系，为未来研究造血过程、血液系统疾病以及造血干细胞移植提供平台。...

利用转录因子重编程小鼠胚胎成纤维细胞以诱导造血程序

本文介绍了人类多能干细胞（hPSC）的培养方案，用于将hPSC分化为CD34+造血祖细胞。该方法通过阶段特异性调控经典WNT信号通路，使细胞特异性地定向分化为确定型或原始型造血程序。...

从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

批量基因表达检测会掩盖异质性细胞群体中单个细胞的差异。本文介绍了一种将单细胞基因表达分析与基于荧光激活细胞分选（FACS）的索引分选相结合的实验方案，可用于解析细胞异质性，并在分子水平上对免疫表型不同的细胞亚群进行特征鉴定。...

一种用于表征人类干细胞与祖细胞群体分子及免疫表型异质性的组合式单细胞方法

本文介绍了一种对脐带血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞进行免疫表型鉴定以及细胞因子诱导其向四种髓系谱系分化的实验方案。该方案可用于研究髓系疾病相关突变或小分子化合物对CD34+细胞髓系分化的影响。...

人脐血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞的泛髓系分化

本文介绍了一种通过接触抑制实现人原代角质形成细胞体外分化的逐步实验流程，并通过RNA-seq分析在分子水平对其进行表征。...

通过RNA-Seq分析表征人原代角质形成细胞的体外分化

我们介绍了一种利用Hoxb5报告系统分离长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的逐步实验方案。...

长期与短期造血干细胞的分离方法

建立红细胞生成模型为理解该过程中各参与因子的生物学意义以及评估可能缓解分化缺陷的新型治疗策略提供了宝贵机会。本文介绍了一种简单且可靠的方法，可高效地将CD34+ 造血干细胞和祖细胞 离体.

体外与离体评估人类红细胞生成效率的综合性流程

了解如何使用RNA测序技术鉴定小鼠EML造血前体细胞自我更新和分化的关键转录因子。该方法通过分析Lin-CD34+和Lin-CD34-细胞亚群的差异表达基因，揭示调控干细胞命运的分子机制。

通过RNA测序分析鉴定调控EML造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

探索更多视频