在实验颈脊髓损伤协同使用神经前体细胞，并自组装肽的
February 23rd, 2015
用自组装肽 （SAP） 和神经前体细胞 （NPC） 以及生长因子治疗颈脊髓损伤是一种很有前途的促进再生和恢复的方法。建立了宫颈 SCI 挫伤/压迫性动脉瘤夹鼠模型，并建立了 SAP 注射和 NPC 移植联合治疗。
该程序的总体目标是在大鼠中引入颈部 SCI 的挫伤加压夹模型，以及涉及 SAP 注射和 NPC 移植的联合治疗方案。首先，将动脉瘤夹放在脊髓周围并保持一分钟。这会导致双侧挫伤加压损伤。
接下来，在受伤中心注射 SAP，在 SAP 注射后立即注射 NPC。插入带有硬膜下导管的渗透泵以持续输送生长因子。该程序导致将 NPC 输送到受伤的脊髓。
NPC 的存活和植入由 SAPs 和生长因子的组合治疗支持。这项技术的影响延伸到创伤性脊髓损伤的治疗，因为它提供了一个临床相关的模型，可用于研究促进脊髓再生的基于细胞的 COMBINATOR 疗法。以下实验方案已获得加拿大多伦多大学健康网络动物护理委员会的批准，并符合加拿大动物护理委员会制定的实验动物护理和使用指南中制定的政策。
所有外科手术都必须在无菌条件下使用无菌设备和溶液进行，并且根据机构和政府的指导方针，该程序在开始手术前使用重 250 至 270 克的大鼠。在手术当天为动物提供饮用水中的抗生素两天。将大鼠置于麻醉室中，用 5% ISO 氟在一比一氧气和一氧化二氮中诱导麻醉一分钟后，将 ISO 氟降至 1.8 至 2.2%将拉比克软膏涂抹在眼睛上，并通过捏爪子确认手术麻醉。
然后将大鼠放在加热的垫子上，并将头部固定在带有鼻锥的立体定位框架中。剃掉颈椎周围的皮毛后，用聚维酮碘擦拭皮肤消毒，然后从 C 两个颈椎区域到 T 两个胸椎体的突出突起做一个中线切口，然后用 70% 乙醇消毒。用手术剪刀在中线上沿颅骨方向直接切开椎肌的外层，用手术剪刀钝化解剖更深的肌肉层，直到到达突起、骨裂和层压板。
插入量角器并保持不动。打开肌肉层，然后定位 T 两椎体的突出突位置，并确定椎板切除术的目标水平。然后用 15 号手术刀切开韧带皮，以松弛椎板和正突。
接下来，使用骨剪切开脊髓外侧的椎板，并在不压迫脊髓的情况下轻轻去除椎板。现在花点时间识别新出现的神经根，以免它们被夹住。然后用钩子从椎体的背侧松开腹侧硬脑膜，并为夹子准备一条走廊。
确保将夹子的环形弹簧设置为提供所需的力。夹力决定了创伤和压缩的程度。将打开的夹子插入脊髓周围，让它卡上以引起挫伤。
通常使用 15 至 35 克的夹力，在进行脊髓损伤后，夹持持续时间为一分钟。取下夹子，将肌肉分成两层闭合，然后闭合皮肤。伤口正确闭合后，停止麻醉并在大鼠醒来时观察大鼠。
在动物恢复足够的胸骨意识后，将大鼠放在干净的笼子里。由于此类损伤的严重性，必须遵循以下术后治疗。首先，请务必根据症状服用丁丙诺啡和美洛昔康等止痛药 3 到 5 天。
还可以通过皮下注射防止脱水。每天两次注射 5 到 10 毫升生理盐水，持续 3 天，并继续在饮用水中提供抗生素，持续 5 天。术后。每天挤压膀胱 2 到 3 次，直到即使在动物似乎恢复后，膀胱功能也明显恢复。
请务必观察手术动物的神经功能缺损和生理状况。脊髓损伤后 14 天进行注射。在开始手术之前，在无菌水中制备浓度为每体积重量 1% 的 SAP，并填充连接到 Hamilton 注射器的 100 微米玻璃毛细管。
使用溶液，将 Hamilton 注射器连接到立体定位框架上。麻醉后，大鼠将头部固定在立体定位框架中，并用聚维酮碘和 70% 酒精对手术部位进行消毒。和以前一样，再次打开皮肤后，仔细解剖这对椎肌并插入牵开器。
使用 15 号手术刀去除硬脑膜上的疤痕组织并重新暴露病变部位。然后用锋利的针尖小心地打开硬脑膜。最后，立体定向地将玻璃毛细管插入创伤脊髓 2 毫米深处并注射 SAP。
注射 SAP 后，让毛细管在注射部位停留 1 分钟，然后再取出，以允许组织拉伸以容纳注射的溶液。然后在下一个部位重复注射。在这里，从成年 DS 红鼠的室旁区分离出 NPC，并根据先前发表的程序进行培养。
在微量注射之前，将生长培养基中的 NPC 稀释至每微升 10 倍至第三个活细胞的浓度，用于细胞移植，并加载到 Hamilton 注射器上的玻璃毛细管中。注射 SAP 后立即注射 NPC。为此，将 Hamilton 注射器的玻璃毛细管插入受伤部位的 0.2 毫米口部和脊髓背表面以下 1.5 毫米处。
以每分钟约 0.5 μL 的速率注入 2 μL 细胞悬液。第一次注射完成后，像以前一样让毛细血管在脊髓中停留一分钟，然后缩回毛细血管，将其移动到相邻部位并重复注射程序。等待一分钟后，像以前一样，缩回毛细血管并将其移动两毫米到受伤部位。
在此位置进行两次 2 μL 注射。这张图片显示了相对于脊髓损伤的所有注射部位。在 NPC 注射后立即植入硬膜下微型渗透泵以支持生长因子。
首先选择一个植入部位。首选部位是胸腹区域的外侧，以避免泵本身引起的不适。像以前一样对该区域进行消毒后，准备泵的皮下凹槽。
接下来，对脊髓损伤附近的上椎骨或下椎骨进行跳跃椎板切除术。在这里，脊髓损伤是在 C 7 T 1 进行的，因此椎板切除术是在 C 5 进行的。现在将泵放入皮下凹槽中，然后将导管剪成必要的长度，最后用 6.0 缝合线将其固定到一对椎肌上。
避免任何与运动相关的脱位。使用锋利的针尖打开椎板切除术下方的硬脑膜。然后将导管引入硬膜下腔，让它沿 coddle 方向滑动，没有阻力，也不会伤到脊髓。
现在，检查导管是否运行平稳，没有任何扭结或折叠，如图所示。然后使用缝合线或夹子逐层闭合肌肉，然后闭合皮肤。伤口正确闭合后，停止麻醉并在动物醒来时观察动物。
在动物恢复足够的意识以进行胸骨卧躺后，将大鼠放在干净的笼子里。请务必遵循所有术后处理程序，包括动物监测和术后镇痛。分别在 NPC 注射前 2 天和移植后 7 天以及直至处死前进行免疫抑制治疗。
该荧光显微镜图像显示了大鼠受创伤脊髓的纵切面。染色是用 QL six 标记的 DPI 荧光 SAP。Fite 呈绿色，并聚集在病变的震中。
注射的 DS 红色阳性 NPC 已在红色荧光指示的喙部和喙部方向扩散。比例尺表示 5 毫米。这里的扫描电子显微镜图像显示了组装的 SAP 的纳米纤维支架的形成。
比例尺表示 1 微米。看完这个视频，你应该对夹子压迫、SCI 所涉及的外科手术有很好的了解，以及如何在这个模型中研究 SAPs 和 NPCs 联合治疗的有前途的方法。
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概述
本研究介绍了一种使用自组装肽（SAP）和神经前体细胞（NPC）在大鼠模型中治疗颈部脊髓损伤（SCI）的方法。这种联合治疗旨在增强挫伤/压迫性损伤后的再生和恢复。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 再生医学
- 脊髓损伤
背景
- 颈部脊髓损伤可能导致严重的运动和感觉缺陷。
- 自组装肽在促进神经再生方面具有潜力。
- 神经前体细胞对修复受损的脊髓组织至关重要。
- 结合这些方法可能会增强恢复结果。
研究目的
- 建立使用挫伤/压迫法的颈部SCI大鼠模型。
- 评估SAP和NPC联合治疗的效果。
- 研究生长因子在脊髓恢复中的作用。
使用的方法
- 在脊髓周围放置动脉瘤夹以诱发损伤。
- 在损伤中心部位注射SAPs。
- 在注射SAPs后立即注射NPCs。
- 使用渗透泵持续递送生长因子。
主要结果
- 联合治疗有效地将NPCs输送到损伤部位。
- 观察到再生和功能恢复得到改善。
- 生长因子在增强治疗效果中发挥了重要作用。
- 该模型为SCI疗法的进一步研究提供了宝贵的平台。
结论
- 结合SAPs和NPCs显示出治疗颈部SCI的潜力。
- 这种方法可能会在临床环境中带来改进的恢复策略。
- 需要进一步的研究来优化治疗方案。
常见问题
Executive Industry Relevance
This cervical spinal cord injury model provides a clinically relevant platform for evaluating combinatorial regenerative therapies, addressing a critical gap in preclinical SCI research where complete transection models poorly reflect human pathology. By integrating self-assembling peptides for cavity bridging and neural precursor cell transplantation with sustained growth factor delivery, the approach supports mechanistic de-risking of cell-based combinatorial strategies. The model enables target validation and predictive confidence assessment for therapies aimed at tissue regeneration and functional recovery in cervical SCI.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding scaffold-mediated cell survival and integration in a clinically relevant injury context.
- Operational Value: Supports biological de-risking of neural precursor cell therapies by testing engraftment in an environment that mimics human cervical SCI secondary injury cascades.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantifiable lesion models suitable for assessing scaffold structural integrity and cell transplantation efficiency.
- Operational Value: Facilitates assay readiness for combinatorial therapies by defining precise injection protocols and growth factor delivery parameters.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical validation by modeling the subacute phase of injury where regenerative interventions are most applicable.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through measurable outcomes in tissue bridging, cell diffusion, and scaffold formation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing in early discovery, assay standardization in screening, and mechanistic de-risking in translational research before lead identification.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation by modeling secondary injury mechanisms and permissive environments for regeneration.
- Screening: Enables assay standardization through defined SAP and NPC injection coordinates, volumes, and timing relative to injury.
- Analytics: Provides quantitative readouts including scaffold nanofiber formation, cell diffusion patterns, and lesion cavity bridging for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling the therapeutic window for regenerative cell therapies post-acute injury.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple regenerative combinatorial therapies beyond SAP-NPC pairs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cell-scaffold interactions within injured spinal cord tissue.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through precise surgical, injection, and pump implantation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of biological feasibility and regenerative potential in a clinically aligned model.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of regenerative candidates by providing data on engraftment, scaffold integration, and growth factor dependency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent microsurgery, stereotaxic injection, and osmotic pump implantation.
- Dependent on specialized instrumentation including aneurysm clips with ring springs, Hamilton syringes, glass capillaries, and fluorescent/scanning electron microscopy for validation.
- Necessitates cross-team standardization between surgery, cell preparation, and peptide formulation teams to ensure protocol fidelity.
- Involves adaptation considerations when translating injection parameters across different rodent strains or injury severity models.
- Practical limitations include the technical complexity of dual-site injections and subdural catheter placement, which may affect throughput and inter-laboratory reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:20
Induction of Cervical Clip Contusion
5:36
Injection of Self-assembling Peptides (SAPs)
7:03
Injection of Neural Precursor Cells (NPCs)
8:34
Implantation of Subdural Pumps for Growth Factor Application
10:39
Results: Successful Delivery of SAPs and NPCs and Scaffold Formation
11:27
Conclusion
