神经前体细胞与自组装肽在实验性颈段脊髓损伤中的协同应用

本实验的总体目标是在大鼠中建立一种颈段脊髓损伤（SCI）的挫伤-压迫夹闭模型，并提供一种联合治疗方案，包括SAP注射与NPC移植。首先，将一个动脉瘤夹放置于脊髓周围，并保持一分钟，从而造成双侧挫伤性压迫损伤。

接下来，将SAPs注射至损伤中心，随后立即注射NPCs。插入带有硬膜下导管的渗透压泵，以持续递送生长因子。该操作可实现将NPCs递送至受损的脊髓组织。

联合使用SAPs和生长因子可支持NPCs的存活和植入。该技术的应用前景包括治疗创伤性脊髓损伤，因为它提供了一种具有临床相关性的模型，可用于研究促进脊髓再生的基于细胞的联合疗法。以下实验方案已获得加拿大安大略省多伦多市大学健康网络动物护理委员会的批准，并符合加拿大动物护理委员会制定的《实验动物护理与使用指南》中的政策规定。

所有手术操作必须在无菌条件下使用无菌器械和溶液进行，并遵循所在机构及政府的相关指南。本实验在开始前选用体重为 250 至 270 克的 Wistar 大鼠。在手术当天，通过饮用水给予动物抗生素，持续两天。将大鼠放入麻醉舱中，使用 5% 异氟烷（ISO fluorine）与一氧化二氮和氧气（1:1）混合气体诱导麻醉，持续 1 分钟，随后将异氟烷浓度降低至 1.8% 至 2.2%。涂抹眼用润滑软膏以保护眼睛，并通过足垫夹捏试验确认手术麻醉深度。

然后将大鼠置于加热垫上，并用鼻固定器将其头部固定于立体定位仪中。剪除颈椎周围毛发后，用聚维酮碘擦拭皮肤进行消毒，再使用70%乙醇擦拭。从第2颈椎（C2）区域至第2胸椎（T2）椎体的突起过程处做一正中切口。使用手术剪沿正中线方向头尾向剪开椎旁肌的表层，再用手术剪钝性分离深层肌肉组织，直至暴露突起、骨性结构及椎板。

插入量角器并固定。切开肌层，然后定位第二胸椎椎体的显著后突，确定椎板切除术的目标节段。随后使用15号手术刀切开韧带层，以松解椎板和后突。

接下来，使用骨剪剪断脊髓侧方的椎板，并在不压迫脊髓的前提下轻柔地移除椎板。此时稍停片刻，辨认出即将要保留的神经根，避免将其剪伤。然后使用钩子从椎体背侧松解腹侧硬脊膜，为后续使用剪刀开辟出操作通路。

确保夹子的环形弹簧设定为施加所需的力。夹子的夹持力决定了创伤和压迫的程度。将打开的夹子环绕脊髓后松开，使其迅速闭合，从而诱导挫伤损伤。

脊髓损伤完成后，通常使用15至35克的夹力，夹闭持续时间为1分钟。移除夹子后，分两层缝合肌肉，然后缝合皮肤。伤口妥善闭合后，停止麻醉，并观察大鼠苏醒过程。

在动物恢复足够的意识，能够以胸卧位侧卧后，将大鼠放入清洁的笼子中。由于此类损伤较为严重，必须遵循以下术后处理措施。首先，应根据症状给予镇痛药物，如布托啡诺（buprenorphine）和美洛昔康（meloxicam），持续三至五天。

同时通过皮下注射防止脱水。每天两次，每次注射5至10毫升生理盐水，持续三天；术后继续在饮水中提供抗生素，为期五天。每天挤压膀胱两到三次，直至膀胱功能稳定恢复，即使动物外表已恢复，也应持续进行。

务必观察手术动物的神经功能缺损及生理状况。在脊髓损伤后14天进行注射。手术开始前，将SAPs用无菌水配制成1%（重量/体积）浓度，并装入连接至汉密尔顿注射器的100微米玻璃毛细管中。

使用该溶液，将Hamilton注射器连接至立体定位仪。麻醉大鼠后，将其头部固定在立体定位仪上，并用聚维酮碘和70%酒精对手术区域进行消毒。同前，再次切开皮肤后，仔细分离一对椎旁肌，并插入牵开器。

使用15号手术刀去除硬脊膜上的瘢痕组织，重新暴露病变部位。然后用锐利针尖小心切开硬脊膜。最后，通过立体定位将玻璃毛细管插入损伤的脊髓深处2毫米处，并注入SAPs。

注射SAPs后，将毛细管保留在注射部位一分钟，再行移除，以使组织伸展并适应注入的溶液。随后在下一个位点重复注射。此处，NPCs从成年DS红色小鼠的室管膜下区分离，并根据先前发表的方法进行培养。

显微注射前，将NPCs用生长培养基稀释至浓度为每微升50 × 10³个活细胞，用于细胞移植，并装载至Hamilton注射器的玻璃毛细管中。在注射SAPs后立即注射NPCs。操作时，将Hamilton注射器的玻璃毛细管插入损伤部位前方0.2毫米、脊髓背侧表面下方1.5毫米处。

以每分钟约0.5微升的速度注入2微升细胞悬液。第一次注射完成后，使毛细管在脊髓中停留1分钟，然后回撤毛细管，将其移至相邻部位并重复注射操作。同前，等待1分钟后，回撤毛细管并将其向头侧移动2毫米至损伤部位。

在此位置进行两次，每次注射两微升。此图像显示了所有注射位点相对于脊髓损伤的位置。在神经前体细胞注射后，立即植入硬膜下微型渗透泵以提供生长因子支持。

首先选择一个植入部位。首选部位为胸腹部区域的侧 flank 部位，以避免泵体本身引起的不适。消毒该区域后，按皮下植入常规方法制备泵的植入腔隙。

接下来，对脊髓损伤相邻的上位或下位椎体进行跳跃式椎板切除术。此处脊髓损伤位于C7-T1节段，因此椎板切除术在C5节段进行。现在将泵置入皮下凹陷处，然后将导管剪至所需长度，最后使用6.0缝线将其固定于一对椎旁肌上。

避免任何可能导致移位的活动。使用锐利针尖在椎板切除部位下方切开硬脊膜。随后将导管插入硬膜下腔，并使其在无阻力且不损伤脊髓的情况下沿柔缓方向滑入。

现在，检查导管是否通畅，确保其无任何扭曲或折叠，如图所示。然后使用缝线或夹子逐层闭合肌肉，再闭合皮肤。伤口妥善关闭后，停止麻醉，并在动物苏醒过程中进行观察。

当动物恢复足够的意识并能够保持胸卧位时，将大鼠放入清洁的笼子中。务必遵循所有术后处理程序，包括对动物的监测以及术后镇痛。在神经前体细胞注射前两天开始给予免疫抑制治疗，并持续至移植后七天，直至动物被处死为止。

这幅荧光显微镜图像显示了大鼠受损脊髓的纵向切面。染色为用 QL6 标记的 DPI 荧光 SAPs。Fite 呈绿色，并在损伤中心区域聚集。

注射的DS红阳性NPCs已沿着头部和尾部方向扩散，表现为红色荧光。比例尺代表5毫米。此处扫描电子显微镜图像显示了自组装SAPs形成的纳米纤维支架结构。

比例尺代表一微米。观看本视频后，您应能充分理解夹闭压缩、脊髓损伤（SCI）相关的手术操作，以及如何在该模型中研究SAPs与NPCs联合治疗这一颇具前景的方法。