Name: 先天免疫和癌前细胞间的相互作用使用可诱导的Gal4 / UAS表达系统在斑马鱼幼体皮肤实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 了解使用可诱导KalTA4-ERT2/UAS系统在斑马鱼幼体皮肤中条件性诱导HRASG12V表达的方法，实现先天免疫细胞与癌前细胞相互作用的实时成像，为研究早期肿瘤发生和宿主免疫反应提供精确时空控制平台。

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本工作由惠康信托基金会授予 Y. F. 的亨利·戴尔爵士研究员项目资助，项目编号 100104/Z/12/Z。
我们感谢爱丁堡大学女王医学研究所鱼类设施的 Carl Tucker 博士及其团队。我们感谢爱丁堡大学 MRC 生殖医学中心免疫组织化学与影像设施的 Michael Millar 提供的支持。
我们感谢科隆大学生殖生物学研究所的Matthias Hammerschmidt教授和Heiko Loehr博士提供p5E-krt4入门载体。同时，我们还要感谢爱丁堡大学生殖再生研究中心的Dirk Sieger博士提供pDestTol2CG目的载体。

以下实验程序均严格遵循1986年《动物（科学程序）法案》进行。
1. 显微注射用质粒DNA的制备
<ol>
	<li>纯化质粒 pTol2-krt4:KalTA4-ERT2使用商用质粒DNA纯化试剂盒按照制造商说明书纯化cmlc2:eGFP质粒DNA，并将质粒DNA稀释至终浓度为100 ng/μl的储存液。</li>
	<li>线性化含有转座酶的质粒 pT3TS/Tol214 通过BamHI限制性酶切消化，按照制造商方案进行。此步骤可延长至过夜。采用酚/氯仿抽提法沉淀线性化DNA，遵循标准方案。</li>
	<li>体外 使用商品化转录试剂盒，按照生产商说明书从线性化质粒中转录转座酶mRNA，以获得大量带帽的RNA；用无核酸酶水稀释并分装，制备终浓度为100 ng/μl的贮存液。采用天然1–2% TAE（40 mM Tris，20 mM 乙酸，1 mM EDTA）琼脂糖凝胶电泳（80–120 V）检测纯化后RNA的质量。将RNA于-80 °C保存。</li>
</ol>
2. 质粒DNA显微注射以实现瞬时基因表达
<ol>
	<li>制备用于在显微注射过程中固定受精卵的琼脂糖注射板。将液态的3%琼脂糖倒入90 mm的培养皿中。待琼脂糖冷却至40–50 °C时，将楔形微注射模具TU-1放置在液态琼脂糖表面。在室温下凝固后，于4 °C静置30分钟，再取出模具。将微注射模具储存于4 °C环境中，可重复使用。</li>
	<li>准备一份注射溶液。以下操作均在冰上进行。在无核酸酶的水中，加入1 μl质粒DNA（终浓度为10 ng/μl）、2 μl转座酶mRNA（终浓度为20 ng/μl）、2 μl 10 mg/μl罗丹明B异硫氰酸酯-葡聚糖、2 μl 5× Danieau溶液（290 mM NaCl、3.5 mM KCl、2 mM MgSO4、3 mM Ca(NO3)2、25 mM HEPES，pH 7.6），定容至10 μl。</li>
	<li>使用直径为1 mm、内含细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管，通过微电极拉制仪将毛细管向相反方向拉制，制备显微注射针。使用以下程序参数：加热温度530，拉力200，速度80，时间150。</li>
	<li>用2 μl注射溶液（保持在冰上）填充一根注射针。将微量加样器吸头缓慢退出时轻轻释放溶液进入毛细管，以避免产生气泡。用镊子小心折断针尖。</li>
	<li>使用气动皮升注射泵调节液滴大小。在二甲基聚硅氧烷中，通过体视显微镜结合目镜测微尺测量液滴直径/体积（V = 4/3πr3），并调整液滴大小。推荐液滴直径为100 μm，对应体积为0.5 nl。这可确保每个注射胚胎获得均匀且可重复的注射浓度。应根据每种构建体和质粒制备情况，进行注射浓度的滴定和优化。</li>
	<li>用3 ml移液管将来自Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io00615与Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg16杂交获得的合子（图1A）转移至注射板的模具中。同时，将预先准备好的注射针针尖置于二甲基聚硅氧烷中，防止溶液干燥和凝结。</li>
	<li>在体视显微镜下，将已预设体积的液滴（100 μm，对应0.5 nl）穿过卵膜注射至囊胚盘17中，且应在第一次卵裂之前完成（图1A）。在单细胞期进行注射，有助于质粒DNA和RNA在发育中的细胞团中均匀分布，并提高生殖系传递的可能性。需注意的是，外源构建体的表达往往更倾向于呈嵌合分布。</li>
</ol>
3. 通过4-羟基他莫昔芬（4-OHT）实现皮肤细胞的条件性转化
<ol>
	<li>将已注射的胚胎转移至0.3x Danieau溶液中，并置于28.5 °C的培养箱中培养。在胚层期（sphere stage）17从培养皿中移除未受精的卵。共注射的罗丹明B异硫氰酸酯-葡聚糖（Rhodamine B isothiocyanate-Dextran）可在荧光体视显微镜下用作注射对照。</li>
	<li>在受精后24小时（24 hpf）筛选eGFP心脏表达的胚胎。继续培养cmlc:eGFP阳性斑马鱼胚胎至72 hpf。密切监测水质（0.3x Danieau）。</li>
	<li>在72 hpf时用镊子去除尚未孵化胚胎的卵膜。用一把镊子小心刺破卵膜，再用另一把镊子将其撕开。使用荧光体视显微镜筛选表达lysC:dsRed2的胚胎。</li>
	<li>将10 μl 10 mM的(Z)-4-羟基他莫昔芬（(Z)-4-Hydroxytamoxifen）原液加入20 ml 0.3x Danieau溶液中（终浓度为5 μM）。每批40–60个胚胎使用该4-OHT诱导溶液20 ml，适用于一个标准培养皿（90 mm）。</li>
	<li>将胚胎转移至含有20 ml新鲜配制诱导溶液的新培养皿中。4-OHT需避光保存和操作。诱导开始后约2小时可观察到初步表达信号。诱导步骤可延长至过夜，需注意初始宿主细胞与前肿瘤细胞的相互作用可能在处理后数小时内即已发生。</li>
</ol>
4. 斑马鱼幼鱼的固定与活体成像
<ol>
	<li>准备一个60 mm的培养皿，在其中打一个直径为18–20 mm的孔。使用高真空硅脂将25 mm的盖玻片覆盖并密封在培养皿外底部的孔上（图1B）。</li>
	<li>配制1%低熔点（LMP）琼脂糖。将一管1.5 ml的LMP琼脂糖置于加热块中，保持在37 °C。</li>
	<li>在荧光体视显微镜下，根据绿色荧光皮肤细胞和dsRed2阳性先天免疫细胞的表达，预先筛选Tg(krt4:KalTA4-ERT2;UAS:eGFP-HRASG12V;lysC:dsRed2)&#160;幼鱼。通过向20 ml诱导溶液中加入1 ml 0.4%三卡因18来麻醉幼鱼。</li>
	<li>用移液吸头将预选的幼鱼转移至液态LMP琼脂糖中。让幼鱼沉入LMP琼脂糖，并将其转移至盖玻片上（图1B）。在体视显微镜下调整胚胎的方向。幼鱼必须直接放置在玻片上，以减少工作距离（最多可放置6条幼鱼）。</li>
	<li>LMP琼脂糖凝固后，用含有三卡因的诱导溶液覆盖其表面（图1B箭头所示）。</li>
	<li>使用倒置荧光激光扫描共聚焦显微镜或转盘共聚焦显微镜对包埋的幼鱼进行成像。选用40X或63X物镜，因其具有较长的工作距离，可实现对整个幼鱼的聚焦成像。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

在胚胎发生和幼体发育过程中，斑马鱼胚胎的皮肤由两层上皮组织构成：表层称为外胚层，以及附着于下方基底膜的基底角质形成细胞层19（图1C，a）。本文所介绍的方案描述了一种简单的方法，可条件性地诱导斑马鱼幼体表层皮肤细胞发生癌前病变转化，并可通过活体成像技术进一步分析其与先天免疫细胞之间的相互作用。本方案的基本方法基于已建立完善的斑马鱼实验技术9–13，且易于被适应和修改。
这 krt4 启动子5 此处使用的驱动 KalTA4-ERT2 特异性表达于最外层皮肤（图1C， b）。然而，用于生成 krt4:KalTA4-ER 的模块化 MultiSite Gateway 克隆策略T2构建 (图1D， a)，使得将任意感兴趣的启动子克隆至KalTA4-ER上游成为可能T2 通过单个克隆步骤即可完成。因此，本文所述方法可适用于胚胎发育和幼虫阶段的大多数组织。其中，启动子序列的可获得性是主要限制因素。此外，通过使用具有空间和时间控制特性的KalTA4-ER系统，几乎任何克隆在UAS启动子下游的目的基因均可在不同发育阶段实现条件性过表达。T2 表达。因此，我们的方案可被调整用于在斑马鱼幼鱼的任何目标组织中以嵌合方式实现条件性基因表达。此外，还可以优化显微镜设置，以便对肝脏或胰腺等较深组织进行活体成像。
我们在此介绍了一种使用该方案的应用实例。类似地，研究人员也可利用此方案过表达其他炎症调节因子，以研究炎症反应的调控机制，因为该系统可方便地对中性粒细胞和巨噬细胞在诱导或抑制候选炎症调节因子表达后的行为变化进行活体成像。此外，该优化后的方案还可用于追踪细胞在组织形态发生和器官形成不同阶段的运动及行为变化。最后，还可通过活体成像技术观察天然免疫细胞与其他特定细胞谱系之间的相互作用，这些细胞谱系可被可诱导的KalTA4-ERT2/UAS表达系统靶向标记。
我们使用了斑马鱼 Tol2kit20–23 中的 pDestTol2CG 载体，该载体包含一个 cmlc2:eGFP-pA 盒（图 1D，a），可通过绿色荧光蛋白阳性心脏对胚胎进行后续筛选，作为筛选标记20，从而简化 F0 代的筛选过程。通过将质粒 DNA 与转座酶 mRNA 共注射，可实现目的基因两侧由转座子序列包围的稳定基因组整合。用于显微注射的质粒 DNA 和转座酶 mRNA 的制备遵循标准操作流程。然而，构建体在基因组中的成功整合依赖于基于 Tol2 的转座机制14。因此，必须特别注意在冰上无菌操作，以避免 RNase 和 DNase 造成的污染与降解。对单细胞期胚胎进行显微注射是一种在斑马鱼中开展功能获得与功能缺失研究的可靠且成熟的技术9,10。尽管经过良好训练的操作者可在 1 小时内轻松向 1,000 多个胚胎的卵黄中完成注射，但对胚盘（图 1A，星号）的注射则需要更多的经验与训练。该操作过程中的关键环节是注射针的操控。注射针必须非常细，以便在不损伤细胞的情况下穿入细胞，因此仅需在其最尖端处轻微折断。在注射过程中定期检查并测量液滴大小至关重要，以确保对每个胚胎实现均一的注射量。若操作得当，注射针还可用于旋转胚胎，这在寻找胚盘位置及最佳穿刺角度时常有必要。
用于显微注射的DNA和转座酶mRNA浓度几乎肯定会影响表达效率。较高剂量可能导致表达外源基因的细胞比例增加，但当DNA浓度（&#62;50 ng/μl）和转座酶mRNA浓度（&#62;100 ng/μl）过高时，注射胚胎中也可能出现毒性效应。我们倾向于使用10 ng/μl DNA和20 ng/μl转座酶mRNA进行注射，相当于每个注射胚胎接受50 pg质粒DNA和100 pg RNA。使用该浓度注射的胚胎100%能够正常发育，在4-OHT诱导后，根据单细胞注射效率的不同，有40–70%的胚胎表现出eGFP-HRASG12V表达。在阳性胚胎中，通常约30%具有1–10个克隆，40%具有10–50个克隆，30%具有超过50个克隆。由于我们的研究目的，我们更倾向于使用表达eGFP-HRASG12V克隆数较少的胚胎。在瞬时实验中，我们选择具有10–50个克隆的胚胎。对于转基因 founder 鱼的建立，我们建议仅选择那些既具有eGFP阳性心脏标记、又在表皮中含有大量eGFP-HRASG12V阳性克隆的胚胎。
（Z）-4-羟基他莫昔芬在光照下会发生顺式-反式（E-Z）异构化24。研究发现，其顺式异构体（E）的抗雌激素活性比反式异构体低100倍25,26。因此必须避免光照。溶于乙醇的4-OHT储备液可在-20 °C避光条件下长期保存。我们建议在诱导目标基因表达期间，使用盒子将培养皿在孵育器内及运输过程中遮光保护。尽管成像区域很小，且4-OHT暴露于紫外光的时间已降至最低，但在长时间成像过程中，仍建议每2小时更换一次诱导溶液，以维持最大表达水平。在斑马鱼胚胎发育过程中，4-OHT能够有效穿透卵膜及最外层皮肤组织，因此可快速诱导基因表达。我们在诱导2小时后即可观察到eGFP荧光信号，已有文献报道在处理1小时后即可观察到目标基因表达的初步迹象，并在3小时后达到平台期8。这些差异可能源于本研究中使用的不同启动子。由于已有研究报道4-OHT处理具有剂量依赖性8,27，我们选择使用已报道的最高浓度5 μM，以在本研究的瞬时表达体系中实现强健且可重复的表达水平。这可确保所有携带转基因的细胞均能诱导目标基因表达。
必须考虑到，此处介绍的瞬时方法可能由于多拷贝和随机的基因组插入事件而导致表达水平的差异。此外，在 Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 的 Tol2 转基因背景下使用转座酶 mRNA，可能导致 UAS 转基因发生潜在的转座事件，从而引起基因沉默或功能破坏。然而，由于本方法属于瞬时表达策略，注射后对胚胎进行预先筛选是必要的。许多实验室发现，UAS 序列在转基因子代中容易发生沉默，因此将 pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP 载体注射到 Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 胚胎中的效率可能不如将其注射到 Tg(krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:GFP)&#160;胚胎中。通过将稳定的转基因品系 Tg(krt4:KalTA4-ERT2) 与 Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 进行杂交，可实现对时间-剂量依赖性 4-OHT 基因激活的开/关动力学进行精确监测。
在幼鱼固定过程中，一个关键步骤是将其转移至LMP琼脂糖并放置到盖玻片上（图1B）。液态LMP琼脂糖的适宜温度窗口较短，必须在此期间完成预选幼鱼的安全转移和定位，以避免因热休克或凝胶过快凝固而对鱼类造成伤害。应直接将幼鱼定位在盖玻片上，以缩短后续显微观察的工作距离。由于这可能成为显微成像中的限制因素，因此必须选择合适的物镜。固定完成后，幼鱼可维持数小时至数天。
本实验系统具有条件性，可通过4-OHT激活转基因实现重复转化。该表达系统依赖于4-OHT的存在，因此由KalTA4调控的目的基因表达具有可逆性。图1D， b）。与Cre-ER相比T2/Lox系统，可介导不可逆的基因组重组事件28, KalTA4-ERT2/UAS 可通过添加或去除 4-OHT 实现激活和失活，这种可重复诱导的特性使该技术相较于 Cre-ER 具有优势T2/Lox 系统。然而，若实验需从数天延长至数周，则需要持续维持 4-OHT 水平，这构成了一项限制。

在 otherwise 正常的上皮细胞层中，癌前细胞后代的过度生长在很大程度上依赖于其与微环境的相互作用。这种与宿主组织的相互作用很可能是决定癌前细胞能否建立克隆微环境并进一步发展为完全恶性肿瘤的主要因素。尽管这一过程在肿瘤发生中具有重要意义，但在大多数常用的 in vivo 模型系统中，癌症进展的这一初始阶段却难以被观察和研究。
斑马鱼（Danio rerio）因其在发育过程中具有通体透明、易于进行遗传操作以及可接受水溶性药物处理等优势，已成为活体成像研究中广泛使用的模式生物。近期研究利用过表达人类癌基因 HRASG12V 以转化上皮细胞的斑马鱼幼体模型发现，宿主细胞产生的信号分子——特别是 H2O2——可诱导先天免疫细胞的募集。有趣的是，被募集的免疫细胞（中性粒细胞和巨噬细胞）被证实对癌前细胞的增殖具有营养支持作用2,3。
为了理解肿瘤起始与进展的早期事件以及炎症反应的贡献，需要能够从最早的时间点开始对这些事件进行成像观察。因此，必须在时间和组织特异性的条件下对细胞转化进行调控。我们采用已在果蝇中成功建立并改造的Gal4/UAS系统，该系统 果蝇4 条件性表达人类癌基因HRASG12V 在皮肤特异性启动子的调控下 角蛋白4 (krt4)5转录激活因子Gal4的改良版本，即KalTA46，可实现HRAS的表达G12V 在上游激活序列（UAS）的控制下。为了条件性诱导转录激活因子的表达，KalTA4 已与人雌激素受体 α（ER）的突变配体结合域融合T2)7 特异性结合4-羟基他莫昔芬（4-OHT）1. 在缺乏4-OHT的情况下，ERT2 在细胞质中，KalTA4-ER 与热休克蛋白结合。当 4-OHT 结合后，热休克蛋白解离，从而允许 KalTA4-ER 转位至细胞核T2 以及随后激活由UAS控制的目的基因8 (图1C， b）。由于该表达系统依赖于4-OHT的存在，因此由KalTA4控制的目的基因表达是可逆的。与Cre-ER系统不同T2/Lox 系统导致不可逆的重组事件，而 KalTA4-ER 的诱导可启动转录激活T2 通过添加或去除4-OHT可逆。
以下方案允许对斑马鱼幼鱼的皮肤细胞进行条件性转化，并通过荧光蛋白表达来后续监测其与先天免疫细胞的相互作用。本方案中采用的基本方法与斑马鱼研究领域内一些常用技术相似9–13。
通过转基因品系的构建及联合使用，以及转基因载体的显微注射，可实现仅以嵌合方式瞬时转化单个细胞。斑马鱼胚胎和幼鱼皮肤具有氧气通透性，使得利用高分辨率显微镜进行数小时至数天的活体延时成像研究成为可能。此外，其对水溶性药物的可及性将有助于未来的机制性研究以及细胞生物学事件的监测。 体内 这有助于更好地理解癌症发展的最初阶段。
该方案可适用于在斑马鱼幼鱼的任何目标组织中以嵌合方式实现条件性基因表达。此外，还可以优化显微镜设置，以便对皮肤以外的深层组织进行活体成像。

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-羟基他莫昔芬</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>H7904</td><td>用乙醇稀释后避光保存于 -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>20倍物镜</td><td>蔡司</td><td></td><td>20X/0.5 Ph2 &amp;infin;/0.17</td></tr><tr><td>40倍物镜</td><td>蔡司</td><td></td><td>40X/1.2W Korr &amp;infin;/0.14-0.18</td></tr><tr><td>63倍物镜</td><td>蔡司</td><td></td><td>63X/1.4 Oil Ph3 &amp;infin;/0.17</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>蔡司</td><td></td><td>LSM 510 META</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0171</td><td>直径 25 mm</td></tr><tr><td>二甲基聚硅氧烷</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>DMPSV</td><td></td></tr><tr><td>道康宁高真空硅脂&amp;nbsp;</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>MKBL4135V</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown P-97 微量移液器拉制仪</td><td>萨特仪器公司</td><td>P-97</td><td>程序设置：加热 530，拉力 200，速度 80，时间 150</td></tr><tr><td>荧光体视显微镜&amp;nbsp;</td><td>徕卡</td><td></td><td>M205 FA</td></tr><tr><td>Kwik-Fill 钼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>世界精密仪器公司</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>微量注射模具 TU-1</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>微量加样器吸头</td><td>艾本德</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>蔡司</td><td></td><td>Axiovert 200</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE 试剂盒</td><td>安比昂</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>英杰</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>气动皮升泵</td><td>世界精密仪器公司&amp;nbsp;</td><td>PV820&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>气动皮升泵</td><td>华纳仪器公司</td><td>PLI-90A</td><td></td></tr><tr><td>pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP</td><td></td><td></td><td>托马斯·拉梅扎尼博士/冯怡实验室/爱丁堡大学</td></tr><tr><td>QIAprep 旋转微型纯化试剂盒</td><td>凯杰</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明B异硫氰酸酯-葡聚糖</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>R8881</td><td>10 mg/&amp;mu;l 水溶液</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>徕卡</td><td></td><td>M80</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;BMC 发育生物学&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;7&lt;/strong&gt;, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;PloS 一&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;5&lt;/strong&gt; (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)</td></tr><tr><td>三卡因/MS-222</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>英杰</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 低熔点琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>英杰</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 苯酚 : 氯仿 : 异戊醇</td><td>英杰</td><td>15593-031</td><td>25:24:1, v/v</td></tr></tbody></table>

利用可诱导的gal4/uas表达系统对幼年斑马鱼皮肤中先天免疫细胞与癌前细胞相互作用进行活体成像

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

在此，我们描述了一种利用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）可诱导的KalTA4-ER系统条件性诱导上皮细胞转化的方法。T2/UAS 表达系统1 在斑马鱼幼鱼中，以及随后对先天免疫细胞与HRAS相互作用的活体成像G12V 表达皮肤细胞。KalTA4-ERT2/UAS 系统具有可诱导性和可逆性，使我们能够以精确的时间和空间分辨率诱导细胞转化 体内这使我们能够首次对单个癌前细胞在出现后如何与宿主组织相互作用进行活体成像，并追踪其后续的进展与消退过程。近期在斑马鱼幼体中的研究显示，先天免疫在肿瘤发生的最早阶段具有营养支持功能。2,3我们的诱导系统可实现对细胞转化起始及其后续宿主反应的活体成像，这可能为调控肿瘤发生性营养性炎症反应的潜在机制提供重要见解。我们还讨论了如何调整本方案，以实现对任意目标组织中异位基因表达的时间和空间控制。

收集 Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 与 Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg 杂交产生的受精卵，在受精后 10–15 分钟（图 1A）以获得单细胞期胚胎。注射后，将胚胎培养至 3 天龄（dpf），再用 4-OHT 诱导并制备活体成像样本（图 1B）。诱导后 2–6 小时，将制备好的胚胎置于倒置荧光显微镜（图 2A）或倒置共聚焦显微镜（图 2B–C）下，以 1.5 分钟为间隔进行 2–3 小时的成像。癌前表皮细胞可通过其相较于正常角质细胞更圆的形态，以及细胞膜定位的 eGFP-HRASG12V 所发出的绿色荧光信号进行识别。成像区域的选择基于癌前皮肤细胞与先天免疫细胞的共定位（图 2A 箭头所示）。由于中性粒细胞迁移速度较快，时间序列成像的时间间隔设定为 1–1.5 分钟，Z 轴步进尺寸为 0.7–1.7 μm，以获得最大强度投影图像（图 2，视频 1）。在活体成像过程中可观察到多种行为：中性粒细胞在癌前细胞旁或下方迁移（图 2C，视频 1），与细胞形成直接接触（图 2B 和 图 2C），清除发生凋亡的癌前细胞残余物（视频 1），或主动吞噬癌前细胞的部分结构（未展示）。为全面捕捉这些相互作用，建议通过延时活体成像持续追踪其行为动态。
<img alt="细胞结构与转基因表达示意图；包括培养皿装置及 eGFP-HRAS 基因融合。" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" width="700px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：斑马鱼幼体皮肤细胞条件性转化的示意图。（A） Tg(UAS:eGFP-HRASG12V;lysC:dsRed2) 斑马鱼受精后10分钟（mpf）的合子图像。受精卵由绒毛膜（箭头）包围。注射位点为胚盘（星号），由卵黄（箭头）的胞质流形成，并定义胚胎的动物极。（B） 斑马鱼幼体的固定。60 mm 培养皿中央有一个18–20 mm 的孔（箭头），由一块25 mm 的盖玻片密封。斑马鱼幼体通过1% LMP 琼脂糖固定在盖玻片上。覆盖 LMP 琼脂糖的是含5 μM 4-OHT 的0.3× Danieau 溶液（箭头）。（C） 4-OHT 诱导的表层皮肤细胞转化。（a） 幼体皮肤的示意图横截面。胚胎和幼体皮肤由两层上皮细胞组成：表层细胞层和基底层角质形成细胞，后者连接于下方的基底膜（BM）。（b） 在表层皮肤细胞中诱导前肿瘤性细胞克隆的瞬时表达系统。由krt4 启动子驱动（黄色）的 KalTA4-ERT2 特异性表达于最外层皮肤层。KalTA4-ERT2 的嵌合表达激活 UAS 控制（蓝色）的 eGFP-HRASG12V 表达，从而形成前肿瘤性细胞克隆（绿色）。（D） 瞬时表达系统的示意图。（a） 瞬时使用的 pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP 表达载体的 Tol2 载体。（b） 转录激活因子表达的条件性诱导。KalTA4 与人雌激素受体α的突变配体结合域（ERT2）融合，该结构域特异性结合4-羟基他莫昔芬（4-OHT）。在无4-OHT 时，ERT2 与热休克蛋白（Hsp90）结合并滞留在胞质中。当4-OHT 结合后，Hsp90 解离，使 KalTA4-ERT2 转位至细胞核，进而激活 UAS 控制的eGFP-HRASG12V 表达。标尺 A = 500 μm。<a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="果蝇胚胎的荧光显微镜图像。eGFP-HRas 显示为绿色，lysC:dsRed 显示为红色，示意图。" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" width="700px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：癌前细胞与先天免疫细胞相互作用的活体成像。（A-C） 一例4天龄的 Tg(UAS:eGFP-HRASG12V;lysC:dsRed2) 胚胎图像，该胚胎在单细胞期被注射了 pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP 和转座酶 mRNA。图像拍摄于4-OHT诱导6小时后。（A） 处理后6小时尾鳍区域的侧视图，显示表达 eGFP-HRASG12V 的皮肤细胞簇（箭头）以及 lysC:dsRed2+ 中性粒细胞（箭头指示处）。（B-C） 从共聚焦延时录像中选取的代表性图像，显示中性粒细胞（红色）与表达 eGFP-HRASG12V 的皮肤细胞（绿色）之间的相互作用。（B） 一个癌前细胞与接触的中性粒细胞形成短暂的丝状伪足延伸（箭头指示处）。（C） 中性粒细胞（红色）与一群癌前皮肤细胞（绿色）紧密接触。A图中的比例尺 = 100 μm；B/C图中的比例尺 = 50 μm。 <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52107/Video_1.mov" target="_blank">视频 1</a>：癌前细胞与先天免疫细胞相互作用的延时活体成像。对在单细胞期注射了 pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP 和转座酶 mRNA 的 4 dpf Tg(UAS:eGFP-HRASG12V;lysC:dsRed2) 胚胎进行延时成像，时间范围为 4-OHT 诱导后 6–9 小时，显示表达 lysC:dsRed2+ 的中性粒细胞（红色）与表达 eGFP-HRASG12V 的皮肤细胞（绿色）之间的相互作用。中性粒细胞迁移至癌前细胞附近或下方，并清除发生凋亡的癌前细胞残留物。时间间隔为每 1.5 分钟，持续 3 小时，Z 轴步长为 1.3 μm。

研究癌前细胞进展的早期事件及其与先天免疫细胞的相互作用，对于理解与治疗癌症至关重要。本文描述了一种条件性诱导上皮细胞转化的方法，并对表达HRASG12V的斑马鱼幼鱼皮肤细胞与先天免疫细胞之间的相互作用进行后续活体成像。

利用可诱导的Gal4/UAS表达系统对幼年斑马鱼皮肤中先天免疫细胞与癌前细胞相互作用进行活体成像

在此，我们描述了一种利用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）可诱导的KalTA4-ERT2/UAS系统条件性诱导上皮细胞转化的方法。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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