小龙虾腹足系统：神经索解剖与运动模式细胞外记录的实用指南

本实验的总体目标是解剖小龙虾的腹神经索，以便将其用于电生理学研究。首先，对小龙虾进行麻醉，然后进行粗略解剖以分离其腹板。

然后进行精细解剖，将中枢神经系统从脑神经节完全分离至腹部神经节。最后，去除所有神经节的神经节鞘，以利于进行电生理实验。

最终，腹部神经节链可用于细胞外或细胞内记录，以研究中枢模式发生器的协调机制，或分析已鉴定神经元的形态及其突触环境。该方法有助于回答神经科学领域的关键问题，例如通过在离体神经系统中记录 fictive FLA 活动，为神经网络功能提供实践性认识，或用于表征腹部神经节以及特定神经元的形态学特征。

尽管该方法可为研究小龙虾的游泳速率系统提供见解，但它也可应用于其他系统，例如驱动小龙虾尾部翻转行为的神经网络。以太平洋斯泰西娅线虫小龙虾（Pacific Stacia Linea Guus）为实验对象。根据文本方案将动物麻醉后，将其腹面朝上固定，用锋利的剪刀在靠近胸节处剪除双侧螯足基部。

然后移除左右两侧的螯足。将动物腹面朝上放置在铺有黑色蜡纸的解剖皿中，通过螯足开口用冷生理盐水进行灌注。接着，使用锋利的剪刀在螯虾眼睛后方做一个横向切口，以完成去头操作。

然后移除靠近基部关节的所有步足，以将腹部连同最后一段胸节从其余胸节部分分离。将剪刀尖插入第二对步足的开口处，剪至对侧。按照文本方案所述，将切口向两侧延伸穿过胸部并暴露部分内部器官后，移除胸部的前部结构。

现在去除内脏，并用冷生理盐水冲洗动物。继续解剖，在胸骨板全长范围内，于肋骨与游泳鼠之间最外侧位置做切口。在另一侧做同样的切口。

将螯虾的腹部朝上放置在解剖皿中。使用昆虫针在尾节后端和头胸甲残余部分前端固定标本。向解剖皿中加入螯虾生理盐水，直至完全浸没标本。

用左手持粗镊子，从步足的开口处插入并撑开标本。辨认出两条较大的背侧屈肌肌束，将其固定，并切断其腹侧基部以及胸动脉。

暴露第一腹神经节A一及其相关神经N一、N二。现在移至第二腹节段，去除靠近腹侧基部的肌束基部。

腹部神经节A2现已可见，其相关联的神经为N1、N2和N3。在距离神经索最远的位置横切N3神经。对接下来的三个腹节段及其腹部神经节重复上述步骤。

三到五。到达腹神经节时，为六。在六的神经后方切断胸板。

保留腹侧部分并用针固定，将背侧朝上置于显微镜下盛有生理盐水的培养皿中。使用镊子去除头胸部腹面最前端的部分。

然后剪断剩余外骨骼结构之间的肌肉。小心抬起腹神经索的前端后，从侧方剪断胸部神经。选定一个体节，将其第一神经（N1）和第二神经（N2）剪下，长度最多保留一厘米，以便将其展开固定。

接下来，移至第2腹节，并识别该节段的N1、N2和N3神经。腹部神经节A2至A5的N1神经位于每个节段的两片胸节腹侧表皮褶之间，并被肌肉组织覆盖。

然后从腹部外侧边缘开始，沿胸骨后侧角质层向内折叠处做一切口，向中线方向进行，按照文本方案暴露神经 N one。如有必要，尽可能远地切断该神经。继续至对侧，从中线附近神经节处开始，沿胸骨后侧角质层向内折叠处向侧缘方向解剖，分离神经 N one。

现在将该神经节的神经 N2 剪至适合固定长度。然后重复对腹部神经节 A2 至 A3 到 A5 所示的操作步骤，尽可能向远端进行。

切断第六神经节的神经。用镊子夹住第六神经节的多条神经，以抬起神经节并开始将神经节链从胸板上分离。完全分离神经索后，使用不锈钢丝制成的小型图钉，将神经节链转移至铺有透明硅胶垫且盛有生理盐水的培养皿中，同时施加轻柔的牵拉。

将神经节链以背侧朝上的方式沿直线固定，神经索朝上排列。仅保留最后两个胸神经节，并将胸神经向两侧固定。将其中一个神经以与神经索成90度角的方向展开并固定。

然后继续处理第二对神经（N2），将其以相对于神经索35至45度的角度固定。一旦第一对神经（N1）按照文本方案分离并固定，即将N1的前支以与神经索成90度角的位置固定。随后，将N1的后支固定在N1前支与N2神经之间。

由于所有腹神经节均需去除鞘膜，使用精细的弹簧剪在神经节后方、神经N2与N3之间的侧面位置，于神经节鞘上做一小的侧向切口。然后在连合上方横向剪开鞘膜，再沿神经节的侧缘继续剪开，最后去除鞘膜。

如有必要，使用精细镊子抬起鞘膜以进行细胞外记录。按照文本方案中列出的工具和试剂准备完毕后，将神经节链置于显微镜载物台上，并从下方照明。将记录电极插入目标神经附近的舌鞘保护结构内，参考电极则插入靠近但位于神经节侧方的位置。

然后将目标神经弯曲环绕至记录电极处。在拉伸并固定神经后，使用装有石蜡油且带有圆头的20号针头注射器，将目标神经与浴液隔离。对所有需要记录其电活动的神经重复此操作。

最后，如图所示开始记录，同侧PS2至PS5运动神经元的细胞外PS活动从PS5的节律性爆发开始，兴奋波向前方传播。此外，每个节段中从一次爆发起始到下一次爆发起始的时间间隔保持恒定，定义为节律周期。爆发持续时间在不同制备样本间可能有所变化，但各节段之间的相位滞后始终保持恒定，约为周期的四分之一，与节律频率无关。

这些协调模式在下图所示的相位直方图中最为清晰。此处使用尖锐的微电极，从 Ps.运动神经元树突进行细胞内记录，显示出单个神经元与同一半节腹神经节中所有PS运动神经元的细胞外记录活动之间的同相振荡。为了鉴定细胞内记录的神经元，可通过尖锐微电极和离子电泳法对细胞进行DiI染色填充。

在此图中，两个双填充的PS运动神经元的腹侧胞体位于神经一基部的后方。初级神经突向前延伸，并在侧神经节内分支。轴突经由神经一的后支投射至肌肉组织。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在45分钟至1小时内完成。在实施该步骤时，需注意定期更换生理盐水，以保持神经组织的健康状态。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如运动神经元或中间神经元的细胞内记录，以回答更多科学问题，例如分析协调行为的细胞机制、测量离子电流，或研究神经调质对特定细胞节律性活动的影响。