Name: 一种新型在体外模型研究人类全血细胞间的相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 了解血液内皮细胞相互作用的新型体外模型，利用血液内皮腔室实验评估凝血因子与白细胞募集。该技术为血管疾病和免疫学研究提供人类特异性研究平台。

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本研究由瑞典研究理事会（90293501、A0290401、A0290402）、欧盟第七框架计划（资助协议编号 n°602699，DIREKT）、诺和诺德基金会、Gurli 和 Edward Brunnberg 基金会、Stem Therapy、Vleugel 基金会以及 Åke Wiberg 基金会的资助支持。

注意：血液通过开放式静脉穿刺法从健康个体采集，该操作已获得乌普萨拉伦理审查委员会的批准（许可号：2008/264）。
1. 接种细胞
<ol>
	<li>在 PBS（pH 7.4）中含 1% 明胶包被的 T75 培养瓶中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。</li>
	<li>从含有 HUVEC（或其他类型的原代人内皮细胞）的 T75 培养瓶中移除培养基，用 PBS（pH 7.4）中含 2.1 mM EDTA 的溶液洗涤细胞。加入 1 ml 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育 2–3 分钟，使细胞脱离。</li>
	<li>用 9 ml 含 10% 胎牛血清（FBS）的 PBS（pH 7.4）冲洗培养瓶以收集细胞，并将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中。在 735 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，小心地将细胞沉淀重悬于微血管内皮细胞生长培养基（EC GMMV）中，使用 Bürker 计数板进行细胞计数。以 21,000 个细胞/cm2 的密度接种于 1 孔细胞爬片中，并在 37 °C 培养。HUVEC 在培养 1–2 天后将达到融合状态。每日在光学显微镜下观察细胞形态和融合度。</li>
</ol>
2. 全血的制备
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用双层固定化肝素（CHS）处理所有将与血液接触的人工表面。CHS涂层材料若防尘保存，可在室温下储存长达6个月而不影响功能。</li>
	<li>在开始血液内皮腔实验前短时间内（&#60;30分钟），采用开放式静脉穿刺法从健康供体采集血液。在采集血液前，将皮下注射针头（18 G × 50 mm）连接至CHS涂层硅胶管（内径：2 mm），然后小心地将血液收集到CHS涂层的50 ml离心管中。向血液中添加未分级肝素，使其终浓度达到0.75 IU/ml。通过轻轻倒置离心管2–3次，使血液均匀混合。</li>
</ol>
3. 血管内皮细胞腔室模型
<ol>
	<li>在丙烯酸聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材料中制作血液腔室（图1A；俯视图），该腔室由两个圆柱体（高8 mm，半径9 mm）组成，将其粘接到一块PMMA载片（25 × 75 mm）上。将圆柱体朝上的边缘装配橡胶O型圈，以便将血液腔室与培养有内皮细胞的玻璃载片密封（图1B）。随后将连接了内皮细胞培养载片的血液腔室垂直旋转放置（图1C）。</li>
	<li>使用经CHS包被的移液枪头，小心地将1.5 ml血液转移至每个经CHS包被的腔室中，注意避免激活血液。</li>
	<li>将1 ml血液转移至含有30 μl 0.34 M K3EDTA的微量离心管中，使K3EDTA终浓度达到10 mM，用于通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测初始血浆蛋白浓度。轻轻混匀血液，并将离心管置于冰上保存。</li>
	<li>根据制造商说明，移除细胞培养玻璃载片的塑料壁，并用pH 7.4的PBS小心清洗细胞。确保随后尽可能去除载片上的液体，但切勿使细胞干燥。</li>
	<li>将载片放置在血液腔室上方，使细胞面朝向血液。使用夹具固定载片与血液-内皮细胞腔室的组合体。在夹紧时，使用塑料载片提供额外支撑，以防止细胞培养玻璃载片破裂。</li>
	<li>将血液-内皮细胞腔室固定于直径为40 cm的旋转轮上，并置于37 °C水浴中。以0.5 × g的转速在旋转轮上转动每个腔室，持续30分钟。</li>
	<li>孵育结束后，拆卸血液-内皮细胞腔室。用pH 7.4的PBS清洗细胞培养载片，并用预冷的1%多聚甲醛（PFA）在冰上固定细胞10分钟。从每个腔室中取出1 ml血液，转移至含有30 μl 0.34 M K3EDTA的微量离心管中，使K3EDTA终浓度达到10 mM，轻轻混匀后置于冰上保存。</li>
	<li>在4 °C条件下，以4,560 × g离心10分钟。将血浆转移至新的微量离心管中，并储存在-70 °C，待后续分析。</li>
</ol>
4. 血管内皮相互作用的分析
<ol>
	<li>使用小鼠抗人CD16抗体进行免疫荧光染色，随后加入二抗山羊抗小鼠Alexa 488及鬼笔环肽-TexasRed。每步染色均在室温下进行1小时，并在每步之间用pH 7.4的PBS洗涤载玻片。用DAPI在室温下对细胞核复染10分钟。通过荧光显微镜结合图像分析软件（如CellProfiler）对结合于内皮细胞的血液成分进行荧光显微分析。</li>
	<li>按照试剂盒说明书，使用凝血酶-抗凝血酶（TAT）ELISA 对血浆样本的血液隔室反应进行定量。</li>
	<li>使用适当的统计工具， 例如采用非配对 t 检验分析数据。</li>
</ol>

<ol><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+Mice+and+Not+Men%3A+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li>
<li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li>
<li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo.+Semin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li>
<li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li>
<li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials%2C+cells%2C+and+tissues%3A+basic+concepts%2C+test+models%2C+and+practical+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li>
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<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li>
<li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li>
<li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li>
<li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-Bed%E2%80%93Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

血液与血管壁之间的多种相互作用通常因内皮细胞的非黏附性和抗血栓特性而维持在静息状态。7 在涉及炎症的病理状态下，内皮细胞被激活，导致黏附受体表达增加8 抑制止血的能力下降。9 血液中级联系统的激活反过来会增强内皮细胞的血栓形成倾向，导致进一步的血栓形成以及白细胞募集。10 为了更深入地理解内皮细胞与全血之间这种精细的相互作用，我们开发了一种新的方法 体外 一种将培养的内皮细胞与全血接触的方法。据我们所知，我们的实验装置是首个实现内皮细胞与人全血在无抗凝剂或极少量抗凝剂条件下长时间共孵育的系统。
该系统的灵敏度得益于开放式静脉穿刺系统，结合在所有接触血液的表面固定化肝素的保护层。在采血过程中使用开放式系统可减少静脉穿刺期间级联系统的激活，同时允许自行确定抗凝剂的使用量。然而，根据研究预期的终点指标，也可使用 commercially available evacuated blood tubes（市售真空采血管）。大多数市售封闭系统采血管中添加的抗凝剂终浓度可能会抑制在实验体系中原本敏感且难以研究的相互作用6。固定化肝素表面（CHS）进一步消除了除内皮细胞以外的任何表面与血液接触所引起的血液激活5。事实上，在未使用CHS保护的腔室中，向全血中添加少量未分级肝素后孵育，会导致凝块形成。
腔室内的气泡可在血液与内皮细胞共孵育过程中促进混匀。为评估气泡大小的影响，我们采用了两种不同的血液体积。在该模型中，无论气泡大小如何，与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共孵育的腔室内TAT水平相似。然而，在完全CHS处理的腔室中，较小的气泡尺寸导致TAT水平升高。这一结果与先前报道的内皮细胞特性一致11，表明内皮细胞增强了凝血激活的调节作用，而惰性CHS腔室缺乏这种调节效应。系统中的气泡在腔室旋转时产生流动，气泡的大小会影响该旋转系统内的作用力。我们的结果已对此进行了展示 图 2D 较小的气泡会产生更高的TAT值，代表对血液的作用力降低 即, 腔室内血液流动速度较低，从而导致级联系统的激活程度更高。需要指出的是，在该系统中我们产生的是旋转流动，其在腔室内的流速分布不均，腔壁处流速最高，中心区域最低。显然，这种流动和剪切应力条件对内皮细胞而言并非理想环境，但我们仍拥有一个能够产生稳定且可重复结果的系统。更理想的条件应包括无湍流的循环层流。然而，在本研究展示的模型中无法实现这一点，据我们所知，目前尚无此类系统可用。尽管市面上已有多种微流控系统，但这些系统无法与未添加或仅添加极低浓度抗凝剂的全血联合使用，因而无法实现对血液中所有组分与内皮细胞之间相互作用的充分且敏感的评估。
此外，在肿瘤坏死因子α（TNFα）激活的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中，无论血量如何，白细胞向内皮细胞的募集增加了2倍，同时凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）的形成也增加了一倍。这验证了该模型系统的稳定性，并表明可将活化的内皮细胞与全血联合使用。未来，该血液-内皮细胞共培养装置可用于研究在不同条件和激活阶段下，多种细胞表面标志物介导的血细胞向活化内皮细胞的募集过程。此外，该模型还可与药理学试剂联合使用，以评估其对炎症状态的影响。
总之，我们展示了将腔室模型与人源血液和血管细胞相结合以构建完整的人体模型的巨大优势 体外 用于开展血管疾病相关研究的系统。

分析心血管疾病中血液-血管相互作用的方法通常涉及动物实验研究。然而，在实验动物模型中获得的结果可能对人类疾病几乎没有或完全没有参考意义。1,2 因此，有必要提供良好且可靠的 体外 用于在类人系统中研究血液组分与血管内皮细胞之间细胞相互作用的模型。因此，我们建立了一种血液-内皮细胞共培养模型。该模型基于先前描述的一种用于研究生物材料与人全血相互作用的模型。.3 与其他情况相反 体外 通常仅包含少量纯化组分的实验体系， 即， 血小板、白细胞或内皮细胞均可获得时，本模型包含了血管中存在的所有组分。
血液内皮细胞室模型的建立旨在能够使用新鲜抽取的人类血液，且几乎无需添加抗凝剂。长时间储存的血液会产生所谓的储存性损伤，其中红细胞的破坏可能会干扰血液与内皮细胞之间精细的相互作用。4
为避免在全血处理过程中形成凝块 离体 需要使用高剂量抗凝剂，或者所有与血液接触的材料都必须为非激活性。由于实验室环境中非激活性表面较为罕见，因此可选择为材料加装固定化肝素保护层。一种可固定于大多数材料表面的固定化肝素保护层（下文简称Corline肝素表面（CHS）），能够在血液接触时避免凝血级联反应的激活。5 因此，通过向腔室中提供CHS，血液内皮细胞腔室模型能够在血液中使用极低浓度的抗凝剂。在血液内皮腔室模型中避免添加高浓度抗凝剂，使得研究血管内可能被掩盖的敏感相互作用成为可能。6
血液内皮细胞腔室模型由两个腔室组成，腔室通过将塑料圆柱体（高度：8 mm；半径：9 mm）固定在塑料显微镜载玻片上形成。圆柱体朝上的边缘设有凹槽，凹槽中安装有橡胶O形圈，用于将腔室密封在细胞培养载玻片上。腔室仅部分填充血液，当腔室随后被旋转至垂直位置时，腔室内残留的空气可使血液保持流动状态（图1）。
为了评估该模型的功能性，我们分别在完全涂覆CHS的腔室或人脐静脉内皮细胞（HUVEC）条件下进行实验。对两个独立的血液体积进行检测，并通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）测量凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物（凝血的间接标志物）的形成。随后，我们通过图像分析评估了血液体积以及肿瘤坏死因子（TNFα）刺激的内皮细胞对白细胞募集的影响。
<img alt="血涂片制备步骤示意图；包括载玻片设置、样本涂布和旋转细节。" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 血液-内皮细胞共培养腔室模型的设置。（A） 由PMMA材料制成的血液腔室的俯视示意图。（B） 在单孔腔室载玻片上培养原代人内皮细胞。将新鲜人全血加入显微镜载玻片上的两个腔室中。所有腔室及接触血液的材料均经保护性HS涂层处理。移除细胞培养载玻片的隔墙后，将细胞面朝向血液，然后用夹具封闭系统。（C） 随后，将血液-内皮细胞共培养腔室在37 °C下旋转孵育。孵育结束后，可通过ELISA分析血液区室中的反应，通过显微镜分析内皮细胞。

<table><tbody><tr><td>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>可使用其他类型的原代人内皮细胞。</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基 MV（ECGM MV）</td><td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>用 PBS 配制 1% 明胶溶液，在 T75 培养瓶中加入 5 ml 孵育 15 分钟，接种细胞前去除。</td></tr><tr><td>TAT ELISA</td><td>Enzyme Research Lab.</td><td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD16 抗体</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>稀释比例 1:100</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 Alexa 488 抗体</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>Phalloidin-Texas Red</td><td>Molecular Probes</td><td>A22287</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>稀释至 10 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>单孔细胞培养载玻片</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>血流腔室</td><td>NA</td><td>NA</td><td>血流腔室可由 PMMA 或其他能够结合 CHS 的塑料材料制成</td></tr><tr><td>夹具</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline 肝素表面（CHS）</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>皮下注射针头</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>规格：18 G × 5 mm</td></tr><tr><td>未分级肝素（UFH）</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>用 milliQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 配制 0.34 M 储存液</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>可免费下载，网址为 www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

一种新型方法 体外 研究人全血与内皮相互作用的模型

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

目前已知的大多数疾病均伴随心血管系统的功能紊乱。然而，由于缺乏可靠且具有生理相关性的方法，对心血管病理过程中相互作用通路复杂性的研究受到限制。为了模拟病理性的血管事件，我们已开发出一种 体外 用于研究内皮细胞与全血相互作用的检测方法。该检测采用原代人内皮细胞，使其与人全血直接接触。该方法使用天然血液，抗凝剂用量极少或不使用抗凝剂，从而能够研究存在于血管中的分子与细胞组分之间的精细相互作用。
我们通过比较不同血量在有或无人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）孵育条件下对凝血激活的影响，来验证该检测方法的功能性。较大的血量会促进凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物的形成增加，而 HUVEC 的存在则导致凝血激活减弱。此外，我们采用图像分析方法检测了在肿瘤坏死因子（TNFα）刺激后白细胞与 HUVEC 的黏附情况，发现与未刺激细胞相比，血液接触后 TNFα 刺激的细胞表面 CD16+ 细胞数量显著升高。综上所述，该检测方法可用于研究内皮层与血液组分之间相互作用发生紊乱的血管病理过程。

CHS 涂层的必要性
为了测量全血中特异性由内皮细胞引发的反应，所有用于血液-内皮细胞共培养腔室的材料在使用前必须经过CHS涂层处理。图2A（左）显示了未涂层腔室在与血液接触30分钟后出现明显可见血凝块的情况。而对腔室进行CHS处理后（图2A，右），可防止血液发生非特异性激活，确保实验结果仅反映内皮细胞与血液之间的相互作用。
腔室内血容量的影响
血液淤滞时，凝血因子被激活后相互作用的概率增加，因此更易发生凝血激活。在血液-内皮细胞腔室模型中，由于腔室内气泡的循环运动，血液保持流动状态。为了确定血量变化（从而也影响气泡大小）的影响，将一个经 CHS 涂层处理的腔室连接至同样经 CHS 涂层处理的玻片，并分别使用 1.5 ml 或 1.75 ml 全血进行 30 分钟的测试。当加入 1.75 ml 血液时，气泡无法推动的静止血量比使用 1.5 ml 血液时大 2.5 倍（图 2B）。测得的 TAT 值表明，随着血量增加，TAT 的生成增多（图 2D）。当人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（图 2C）分别与 1.5 ml 或 1.75 ml 全血共孵育时，两组之间未观察到差异，提示内皮细胞可能对凝血激活具有调节作用（图 2D）。
TNFα 对血细胞募集和凝血激活的影响
为了研究 TNFα 对白细胞募集的影响，HUVEC 在与血液接触前 4 小时用 20 ng/ml TNFα 处理。血液接触（分别使用 1.5 ml 或 1.75 ml 血液）持续 30 分钟，随后对培养载玻片进行 CD16 染色（图 2F），成像并定量 CD16+ 细胞数量。经 TNFα 处理后，CD16+ 细胞的募集显著增加（图 2E）：使用 1.5 ml 血液时，从 100 增加至 256 个 CD16+ 细胞/mm2（p &lt; 0.0001）；使用 1.75 ml 血液时，从 172 增加至 378（P &lt; 0.0001）。在与经 TNFα 处理或未处理细胞共同孵育的血液对应的血浆样本中，检测 TAT 复合物的形成（图 2G）。与未处理细胞相比，TNFα 刺激的细胞诱导 TAT 复合物水平约增加一倍。
<img alt="CHS 和 TNFα 作用下 HUVEC 的反应；示意图、显微镜图像、TAT 和 CD16 水平分析。" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：血液内皮细胞腔室模型的功能性。（A） 含或不含 CHS 的腔室与全血共同孵育。在无 CHS 的情况下，30 分钟后形成血凝块。对未添加 CHS 的血液中凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物（凝血的间接标志物）的检测结果显示其浓度 > 6,000 μg/ml。（B） 由旋转气泡未能持续搅动的血液体积会随不同血量而变化。当加入 1.5 ml 血液时，该体积为 0.3 ml；而加入 1.75 ml 血液时，该体积增加至 0.74 ml。（C） 通过相差显微镜观察 HUVEC，显示在接触血液前具有典型内皮细胞形态的融合单层。（D） 完全涂覆 CHS 的腔室在加入不同体积血液时 TAT 值略有差异：加入 1.5 ml 血液时 TAT 为 35 ± 11 μg/ml（n = 7），而加入 1.75 ml 时为 85 ± 70 μg/ml（n = 8）。当 HUVEC 与相同体积的血液共同孵育时，这种差异不再存在：1.5 ml 组为 66 ± 55 μg/ml（n = 5），1.75 ml 组为 66 ± 29 μg/ml（n = 7）。（E） 对血液接触后未刺激或经 TNFα 刺激的 HUVEC 上 CD16+ 细胞数量的定量分析。与未刺激细胞相比，经 TNFα 刺激的细胞在与 1.5 ml（基础值：100 ± 40 个细胞/mm；TNFα：256 ± 121 个细胞/mm）或 1.75 ml（基础值：172 ± 67 个细胞/mm；TNFα：378 ± 185 个细胞/mm）全血孵育后，CD16+ 细胞数量显著增加。（F） 未刺激和 TNFα 刺激的 HUVEC 的代表性图像，分别用鬼笔环肽（红色）、CD16（绿色）和 DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 250 μm。（G） 与未经处理的细胞相比，经 TNFα 刺激的细胞与血液孵育后 TAT 复合物的生成量大约增加一倍（1.5 ml：TAT 增加 2.1 ± 0.1 倍，n = 3；1.75 ml：TAT 增加 1.7 ± 1.0 倍，n = 4）。所有数据均表示为均值 ± 标准差；p 值通过非配对 t 检验计算得出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

可靠的人类血管血液相互作用研究模型尚且缺乏。我们提出一种 体外 结合人全血与培养的原代人内皮细胞模型，用于研究血液中（ELISA）和血管腔室（显微镜）的细胞相互作用。

目前已知的大多数疾病均伴随心血管系统的功能紊乱。对相互作用通路复杂性的研究……

本实验的总体目标是利用一种新型的血液-内皮细胞共培养装置，研究血液与内皮细胞之间的相互作用。首先通过开放式静脉穿刺法采集健康志愿者的血液；随后，在第二步中将血液小心地分层加入已包被肝素的血液室中，该血液室与培养有内皮细胞的载玻片相连。接下来，轻轻旋转这些血液内皮细胞培养室，以促进血液与内皮细胞之间的相互作用。最终，可通过免疫荧光显微镜和 ELISA 分别评估血液与内皮细胞之间的细胞间相互作用以及由此产生的凝血酶-抗凝血酶复合物的生成。与使用动物模型等现有方法相比，该技术的主要优势在于可在实验开始前利用人类模型系统来研究血管疾病。将一根18号规格的皮下注射针连接到一段内径为2毫米的肝素表面包被硅胶管上。塑料表面包被肝素以防止非特异性激活凝血过程。例如，在此图像中，未包被的腔室内可明显观察到血凝块。血液接触30分钟后，用肝素表面处理腔室可防止血液发生不受控的激活，从而确保实验结果仅反映内皮细胞与血液之间的相互作用。连接管路后，通过开放式静脉穿刺法，小心地从健康供体采集血样至50毫升肝素表面涂层试管中。采集的血液补充未分级肝素，使其终浓度达到0.75 IU/mL，并将试管轻柔颠倒混匀2至3次。为分析初始血液蛋白浓度，将每管一毫升血液与含30微升10毫摩尔K₃EDTA的微量离心管小心混匀，并将管子置于冰上。然后使用肝素表面包被的移液枪头，将1.5毫升血液转移至每个肝素表面包被的血液内皮细胞腔室中，注意使血液缓慢流动且不产生气泡，以避免激活。接着，根据制造商说明书从内皮细胞培养载玻片上移除塑料壁，并轻轻洗涤内皮细胞。用 PBS 尽可能移除细胞上的洗涤液，但不要让培养物变干，然后将载玻片置于血腔上方，使细胞面向血液。可使用塑料载玻片提供额外支撑。为避免细胞培养载玻片破裂，应在每个血液内皮细胞腔周围放置夹子以固定载玻片。现在，将小室置于37摄氏度水浴中，在旋转轮上以0.5 G的离心力旋转30分钟。旋转结束后，拆卸血管内皮细胞小室，用PBS洗涤细胞培养载玻片，并将细胞在冰上预冷的1%戊二醛中固定10分钟。最后，为检测活化血液蛋白浓度，取每个小室中的1毫升血液，与含有30微升0.34摩尔K₃EDTA的微量离心管混合，将离心管置于冰上，最多保存一小时。然后离心沉淀细胞后，将血浆分装至新的微量离心管中，在负70摄氏度下保存，直至进一步分析。凝血因子的激活更可能发生在静止的血液中，因为激活因子之间相互作用的概率增加。事实上，由气泡导致无流动的血液体积是原来的2.5倍。当加入腔室的血量为1.75毫升时，与使用1.5毫升血量相比，测得的凝血酶-抗凝血酶复合物值表明，随着血量增加，凝血酶-抗凝血酶复合物的形成也相应增加。有趣的是，当将静脉内皮细胞与任一血量的全血孵育时，两组之间未观察到差异，这提示内皮细胞可能调节凝血系统的活化，以研究TNFα对白细胞募集的影响。在本实验中，静脉内皮细胞在接触血液前4小时用20纳克/毫升的TNFα处理，随后定量分析CD16阳性细胞的数量。经TNF alpha处理后，CD16阳性细胞的募集显著增加，从每平方毫米100个和1.5升血液中172个，分别增至256个和1.75毫升血液中378个。随后，在与TNF alpha处理或未处理细胞共同孵育的血液所获得的相应血浆样本中，检测凝血酶-抗凝血酶复合物的形成。正如预期，与未处理的对照组相比，TNF alpha刺激的细胞诱导产生的凝血酶-抗凝血酶复合物大约增加了一倍。该技术将为免疫学领域的研究人员提供一种利用人原代细胞和人全血在体外模型中探索补体系统与凝血系统相互作用的方法。

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