一种新型方法 体外 研究人全血与内皮相互作用的模型

本实验的总体目标是利用一种新型的血液-内皮细胞共培养装置，研究血液与内皮细胞之间的相互作用。首先通过开放式静脉穿刺法采集健康志愿者的血液；随后，在第二步中将血液小心地分层加入已包被肝素的血液室中，该血液室与培养有内皮细胞的载玻片相连。

接下来，轻轻旋转这些血液内皮细胞培养室，以促进血液与内皮细胞之间的相互作用。最终，可通过免疫荧光显微镜和 ELISA 分别评估血液与内皮细胞之间的细胞间相互作用以及由此产生的凝血酶-抗凝血酶复合物的生成。与使用动物模型等现有方法相比，该技术的主要优势在于可在实验开始前利用人类模型系统来研究血管疾病。

将一根18号规格的皮下注射针连接到一段内径为2毫米的肝素表面包被硅胶管上。塑料表面包被肝素以防止非特异性激活凝血过程。例如，在此图像中，未包被的腔室内可明显观察到血凝块。

血液接触30分钟后，用肝素表面处理腔室可防止血液发生不受控的激活，从而确保实验结果仅反映内皮细胞与血液之间的相互作用。连接管路后，通过开放式静脉穿刺法，小心地从健康供体采集血样至50毫升肝素表面涂层试管中。采集的血液补充未分级肝素，使其终浓度达到0.75 IU/mL，并将试管轻柔颠倒混匀2至3次。

为分析初始血液蛋白浓度，将每管一毫升血液与含30微升10毫摩尔K₃EDTA的微量离心管小心混匀，并将管子置于冰上。然后使用肝素表面包被的移液枪头，将1.5毫升血液转移至每个肝素表面包被的血液内皮细胞腔室中，注意使血液缓慢流动且不产生气泡，以避免激活。接着，根据制造商说明书从内皮细胞培养载玻片上移除塑料壁，并轻轻洗涤内皮细胞。

用 PBS 尽可能移除细胞上的洗涤液，但不要让培养物变干，然后将载玻片置于血腔上方，使细胞面向血液。可使用塑料载玻片提供额外支撑。为避免细胞培养载玻片破裂，应在每个血液内皮细胞腔周围放置夹子以固定载玻片。

现在，将小室置于37摄氏度水浴中，在旋转轮上以0.5 G的离心力旋转30分钟。旋转结束后，拆卸血管内皮细胞小室，用PBS洗涤细胞培养载玻片，并将细胞在冰上预冷的1%戊二醛中固定10分钟。最后，为检测活化血液蛋白浓度，取每个小室中的1毫升血液，与含有30微升0.34摩尔K₃EDTA的微量离心管混合，将离心管置于冰上，最多保存一小时。

然后离心沉淀细胞后，将血浆分装至新的微量离心管中，在负70摄氏度下保存，直至进一步分析。凝血因子的激活更可能发生在静止的血液中，因为激活因子之间相互作用的概率增加。事实上，由气泡导致无流动的血液体积是原来的2.5倍。

当加入腔室的血量为1.75毫升时，与使用1.5毫升血量相比，测得的凝血酶-抗凝血酶复合物值表明，随着血量增加，凝血酶-抗凝血酶复合物的形成也相应增加。有趣的是，当将静脉内皮细胞与任一血量的全血孵育时，两组之间未观察到差异，这提示内皮细胞可能调节凝血系统的活化，以研究TNFα对白细胞募集的影响。在本实验中，静脉内皮细胞在接触血液前4小时用20纳克/毫升的TNFα处理，随后定量分析CD16阳性细胞的数量。

经TNF alpha处理后，CD16阳性细胞的募集显著增加，从每平方毫米100个和1.5升血液中172个，分别增至256个和1.75毫升血液中378个。随后，在与TNF alpha处理或未处理细胞共同孵育的血液所获得的相应血浆样本中，检测凝血酶-抗凝血酶复合物的形成。正如预期，与未处理的对照组相比，TNF alpha刺激的细胞诱导产生的凝血酶-抗凝血酶复合物大约增加了一倍。

该技术将为免疫学领域的研究人员提供一种利用人原代细胞和人全血在体外模型中探索补体系统与凝血系统相互作用的方法。