Name: 在共同的文化整合模式中GABA能神经元的刺和HEK293细胞抑制性突触形成稳定表达GABA一个受体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 了解利用共培养模型研究GABA能抑制性突触形成的分子机制。该方法结合胚胎中等多棘神经元与稳定表达GABA_A受体的HEK293细胞，通过免疫荧光和共聚焦显微镜可视化突触接触，为神经环路功能障碍相关疾病的治疗研究提供重要模型。

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我们感谢英国医学研究理事会（MRC UK，项目编号G0800498）提供的经费支持。我们还要感谢苏黎世大学的J-M Fritschy教授提供针对GABAA受体亚基的γ2特异性抗体，以及伦敦大学学院药学院的R. Harvey教授提供含有抗生素抗性基因的pcDNA&#160;3.1(+) 表达载体，用于构建稳定转染的HEK293细胞系。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

尽管本实验方案在技术上并不难操作，但必须遵循若干关键步骤，才能获得最准确且可重复的共培养实验结果。首先，培养的中型多棘神经元必须以最佳密度接种。若接种过稀，神经元生长会显著减慢，存活率也会大幅降低；反之，若接种过密，神经元容易发生聚集，从而影响与HEK293细胞接触的分析。其次，建议在将稳定表达GABAA受体的HEK293细胞接种至共培养体系前， transiently 转染表达一种荧光报告蛋白（如GFP或mCherry）。这有助于可靠识别HEK293细胞，避免因其形态和大小与神经元培养中偶见的存活胶质细胞相似而造成误判。为实现GFP或mCherry cDNA的高效转染，HEK293细胞系必须处于对数生长期，并以适当密度接种于6孔板中。接种过稀再进行转染会导致细胞生长不良，而接种过密则会影响细胞对cDNA的摄取。理想情况下，细胞应在转染当天达到70%至90%的融合度。第三，必须针对所使用的每种细胞系优化转染条件，因为不同细胞系的敏感性存在差异。这是由于GABAA受体在HEK293细胞中的组成型表达会降低细胞存活率，并削弱其在转染后的恢复能力。此外，细胞存活情况还取决于HEK293细胞中表达的GABAA受体亚型类型，某些细胞系明显比其他细胞系更敏感。使用脂质体试剂转染是快速增殖细胞系中表达外源蛋白的优选方法，因其可同时实现较高的转染效率和表达水平。然而，该试剂对生长缓慢的细胞系损伤过大，因此我们通常对这类细胞使用非脂质体转染试剂。该试剂的作用机制与脂质体试剂类似，但实现高效转染所需的DNA用量显著减少，从而提高了细胞存活率（约80%至90%，而使用脂质体试剂时约为60%），但转染效率较低（约60%）。最后，添加至神经元培养物中的对照HEK293细胞或表达α1/β2/γ2的HEK293细胞数量也需优化。加入细胞过少会导致HEK293细胞与神经元之间的接触难以有效分析，因为此类事件极为罕见；相反，加入过多HEK293细胞则会在数小时内引发神经元死亡。
胚胎中型多棘神经元培养物的理想制备应使用胚胎期15至17天（E15–E17）的纹状体组织。然而，实际操作中胚胎的发育年龄常略早于或晚于最佳时期。在此情况下，需要调整接种至培养体系中的神经元数量。对于早于E15的组织，接种密度应略低；而对于晚于E17的组织，则可能需要提高接种密度，以保证细胞的最佳存活率。此外，对于年龄较大的组织培养物，可能需要添加阿糖胞苷（Ara-C），以抑制胶质细胞的过度生长，因为较年长的组织中胶质细胞更为丰富。
在制备共培养体系时，应接种经优化数量的转染HEK293细胞或表达α1/β2/γ2的HEK293细胞，具体数量如上所述。然而，由于不同细胞系在存活率方面存在差异，可能需要针对每种细胞系单独确定最佳接种数量。通常情况下，每个24孔板的孔中已含有500 μl神经元培养基，此时应加入最多50 μl体积、约30,000个细胞，以确保神经元条件培养基不会过度稀释，并保持各孔内培养条件相对恒定。 例如 生长因子的浓度。向每个孔中加入超过50 μl的体积通常会导致神经元死亡。
共培养技术的一个主要缺点是，神经元培养物是由解离的细胞以单层形式生长而成的，这意味着神经元已被从其正常的微环境中移除，无法建立正常的解剖学结构。因此，这些神经元缺乏其他细胞所提供的适当连接、输入以及分泌分子，而这些因素可能影响突触发育的初始阶段。例如，在体条件下，中等棘状神经元受到来自皮层、丘脑及其他脑区的谷氨酸能输入的密集支配34，然而，在我们的神经元培养体系中，由于在纹状体组织解剖过程中这些输入纤维受到损伤，谷氨酸能突触无法形成。培养的中等棘状神经元缺乏功能性谷氨酸能突触，这如何影响它们彼此之间以及与表达GABAA受体的HEK293细胞之间形成GABA能突触的能力，目前仍是一个未解的问题。通过将中等棘状神经元与皮层谷氨酸能神经元共同培养，使其在添加HEK293细胞之前即可形成功能性突触35，这一问题便可轻易得到解决。另一种替代方法是设计基于脑片组织培养的共培养模型系统，该系统可保留部分细胞结构，而这些结构可能对神经元成熟和突触形成具有重要意义。然而，脑片组织培养具有致密且异质性的神经纤维网，可能会影响本研究中所进行的分析。使用共培养检测方法的另一个重要缺点是，HEK293细胞表面表达的GABAA受体并未像神经元中的那样形成簇状聚集，尽管已有研究表明，只要表面表达水平足够高，这种聚集似乎并非突触形成所必需30。例如，在啮齿类动物脑组织及海马培养物中，α1 GABAA受体亚基存在于所有锥体细胞各突触后区域的大多数GABA能突触中；而α2亚基则特异性地分布于部分位于胞体和树突上的突触，并在轴突起始段高度富集，这一点已通过免疫荧光和电子显微镜技术得到证实36。鉴于共培养体系中的突触形成仍可被可靠地检测和分析30，这表明HEK293细胞表面GABAA受体的密度可能与神经元突触簇内这些受体的密度相当，甚至更高。这至少部分解释了为何在共培养体系中，只要存在足够密度的正确组装的GABAA受体，突触黏附蛋白（如neuroligin）和突触后密度蛋白（如gephyrin）对于突触形成就并非必需。
已有充分文献记载，GABAA受体在结构和功能上具有异质性，其受体亚基组成决定了它们的亚细胞定位和药理学特性。例如，已知α2亚基的整合是GABA受体定位于突触部位的前提条件。ARs，而该亚基几乎仅存在于突触外GABAARs。仅包含αβ组合的受体也被认为主要定位于突触外区域12-14这种特异性在我们的共培养体系中是否得以维持，可通过将2或亚基cDNA瞬时转染至稳定表达α和β亚基的HEK293细胞系中，再将其加入神经元培养物之前进行检测。我们采用该方法的初步实验结果表明，仅在存在2亚基的情况下才能 readily 形成突触接触，提示所观察到的特异性 体内 很可能被保留 体外 （数据未显示）。
此外，GABAA含有不同α亚基的受体选择性地定位于与特定类型突触前神经元形成的突触接触处。例如，在苍白球中，α1-GABAARs 通常位于纹状体-苍白球（str-GP）和苍白球-苍白球（GP-GP）突触上，分别分布于中等棘状神经元的树突和胞体区域。α3-GABAARs 位于中等棘状神经元的近胞体区域，并接受局部 GP 轴突侧支的接触，而 α2-GABAARs 位于这些神经元的远端树突上，主要接受来自纹状体的输入32在其他脑区（如海马）的不同类型突触及神经元不同区室中，也已证实存在特定α亚基的表达。21 和新皮层18,20这些发现引发了一个问题：大脑中特异性抑制性突触是如何形成的？某种特定类型的突触前终末的黏附是否能够诱导特异性GABA受体的插入A受体亚型是否会根据其亚基组成被运输到特定的亚细胞位置，且其在质膜上的插入是否是特定来源轴突末梢黏附的前提条件？迄今为止，这些问题仍未得到解答。利用简化模型系统（如共培养模型系统）使我们能够开始回答这些复杂问题，因为该系统易于转染DNA构建体和施加试剂，并且重要的是，适用于活细胞成像分析。30因此，利用该模型系统，我们可以开始检测包括不同类型的GABA在内的单个分子的作用ARs，已知存在于突触接触部位。另一个优点是，该模型系统中的突触可在数分钟至数小时内快速形成，从而缩短实验周期。. 类似的共培养模型系统在过去已被成功用于筛选新型突触生成分子27,37,38.
了解中枢神经系统如何发育、成熟，并在神经元之间形成如此精细的连接以控制行为或认知等过程，具有根本性的重要意义。实现这一长远目标，必须阐明发育过程中调控细胞识别及细胞间通讯各个步骤的分子机制。由于系统本身的极端复杂性，目前只能在简化体系中精确研究这些多细胞相互作用的分子细节。然而，通过表达多种蛋白质组合并研究其相互作用，从而逐步增加体系复杂性的方法，相较于基因敲除等手段具有某些优势。这是因为单个基因敲除效应的准确解读，常受到补偿机制所引发的继发性改变干扰，尤其在发育中的大脑中，这些补偿机制可能掩盖原始损伤的真实效应。本文所述的简单而富有信息量的共培养技术，已助力发现了GABA在结构层面的重要作用ARs在突触形成中的作用，并为进一步研究GABAARs 及其他细胞黏附分子和/或突触基质蛋白在突触形成过程中相互作用。突触基质蛋白尤其受到关注，因为最近的研究已证明其在谷氨酸能突触形成中发挥关键作用39共培养模型的进一步发展至关重要，因为它们有望增进我们对指导“正常”大脑发育的分子机制的认识，从而加深我们对癫痫、精神分裂症、自闭症谱系障碍等多种神经发育疾病中这些机制如何发生改变的理解。

GABA 是胚胎大脑中最早发现的神经递质之一，早于最丰富的兴奋性神经递质谷氨酸1。在发育过程中，GABA 使未成熟神经元去极化并产生兴奋，从而在调节细胞增殖、迁移以及神经网络形成中发挥关键作用，且不会引发兴奋性毒性。在成年大脑中，由于细胞内氯离子浓度降低，GABAA 受体通道的反转电位向更负的方向移动。这种变化是由于钾-氯共转运体（KCC2）上调，将氯离子转运出细胞，同时钠-钾-氯转运体（NKCC1）下调，后者具有相反作用所致2。
在大脑中，GABA 主要与 GABAA 或 GABAB 受体结合，分别介导快速或慢速的突触抑制。GABAARs 是一类受体，也被称为异源五聚体离子型或配体门控 Cys-环离子通道。受体激活需要两个 GABA 分子，该受体对氯离子具有通透性，对碳酸氢根离子的通透性较弱。氯离子电导的增加降低了去极化兴奋性事件激活突触后神经元的效果3。
GABAA受体结构多样性长期以来被认为是决定其广泛功能和药理学特性的重要因素。天然GABAA受体是由多种亚基异构体组成的异源五聚体，这些亚基分为：α(1-6)、β(1-3)、γ(1-3)、δ、ε、π和θ3，具有共同的跨膜拓扑结构，包括一个大的N端胞外结构域、四个跨膜结构域（TMs）以及位于第3和第4个跨膜结构域之间的主要胞内结构域4。β3和γ2亚基对突触抑制和生物体存活至关重要，因为缺失这些亚基基因的小鼠在出生后即死亡5,6。相比之下，α亚基的各个异构体对于大脑中与焦虑、镇静、觉醒等不同行为相关的特定突触连接功能具有重要作用，但单独来看并非生命所必需7-9。GABAA受体是多种具有强效镇静、催眠、抗焦虑和抗惊厥作用药物的主要作用靶点，这些药物包括苯二氮䓬类、巴比妥类、神经类固醇和麻醉剂7,10,11。
突触部位的 GABAA 受体通常包含一个 γ2 亚基、两个 β 亚基（最常见为 β2 或 β3）以及两个 α 亚基（α1、α2、α3 或 α5）12,13。主要的突触外受体类型则由 δ 亚基与两个 α 亚基（α4 或 α6）及两个 β 亚基（β2 或 β3）组合而成14。GABAA 受体在轴突、树突或胞体中的亚细胞定位及其插入细胞膜的过程依赖于 β 亚基的存在15,16。然而，不同 GABAA 受体亚型被选择性地整合到特定类型的突触中，与特定 α 亚基（α1、α2、α3 或 α5）的存在密切相关7,17,18。重要的是，在小鼠中敲除 α1 或 α2 亚基会导致抑制性突触发生超微结构改变19。这表明 GABAA 受体本身可能在调控突触形成过程中发挥直接作用。
研究表明，GABA能突触的发育是一系列精确协调的事件，其中不同类型的抑制性轴突所接触的神经元靶点，以及在每类抑制性突触处聚集的受体均具有选择性，并在功能上相互匹配17,20-22。GABA能突触这种特异性的基本原理引发了一个问题：在突触连接形成初期，突触前与突触后组分如何相互识别？
体外共培养实验已成功用于研究突触形成的一些机制，并检验单个跨越突触间隙蛋白在此过程中的作用。其中一对常见的、可双向发挥作用以介导突触形成与成熟的跨突触相互作用蛋白组合是神经连接蛋白（Neurexins, Nrxns）和神经配体蛋白（Neuroligins, NLs）。Nrxns 是突触前蛋白，其在层粘连蛋白-神经连接蛋白-性激素结合蛋白结构域内存在可变剪接，从而产生多种不同的亚型23。尽管 Nrxns 还可与其他蛋白相互作用，但 NLs 被认为是其普遍存在的突触后配体24。这些蛋白共同作用，使突触前膜与突触后膜紧密且稳定地贴合在一起25。其中最丰富的两种亚型为 NL-1 和 NL-2，分别存在于兴奋性突触和抑制性突触中26。最早用于研究跨突触蛋白相互作用的共培养模型系统之一，采用不同类型的非神经元细胞（最常见的是永生化细胞系，如人胚胎肾 HEK 293 细胞）过表达 NL-2。当这些细胞与脑桥神经元共培养时，可在 HEK 细胞表面附近观察到突触前蛋白的聚集，表明形成了类似突触的连接结构。在该共培养体系中加入可溶性 β-神经连接蛋白后，此类连接结构的形成受到抑制，提示 Nrxns 与 NLs 之间的跨突触相互作用对于突触连接的形成是必需的27。此外，在与解离的海马谷氨酸能和 GABA 能神经元共培养时，于 COS（CV-1（灵长类来源）Origin，并携带SV40 遗传物质）细胞中瞬时表达 β-神经连接蛋白，可诱导在两类细胞接触部位出现突触后蛋白 gephyrin 以及 GABAAR 亚基 γ2 和 α2 的表达28。另一个用于研究突触形成的共培养模型实例，是将瞬时转染了 GABAAR 亚基 α2/β3/γ2 和 NL-2 的 HEK293 细胞，与一群混合的下丘脑神经元共培养29。该研究得出结论：NL-2 的表达是抑制性突触形成的绝对必要条件。
然而，在最近的一项共培养研究中，稳定转染的α1/β2/γ2 GABAA在与GABA能中等棘状神经元共培养时，HEK293细胞中的Rs足以诱导功能性突触的形成，无需额外的跨突触或突触后黏附蛋白。然而，当NL-2与GABA共同表达时，突触的形成数量和强度均显著增强。ARs30。这表明该共培养模型系统相较于先前报道的模型系统具有优势，最显著的是突触接触检测的灵敏度和可靠性提高。促进突触接触检测整体改进的两个重要因素是：i）使用稳定转染的HEK293细胞系，其对GABA受体亚基具有高表达水平且表达稳定；ii）采用高分辨率成像与自动化图像分析相结合的方法，以更精确地识别突触标记物的共定位。AR亚基在单个细胞表面的表达。这种一致性有助于在不同共培养条件下进行定量比较。ii) 采用从胚胎纹状体培养得到的纯GABA能中等棘状神经元群体31 消除了使用混合神经元群体所带来的复杂性和模糊性，从而能够例如选择最合适的突触后 GABAA可用于突触形成过程中相互比较的R型。
人们认为，突触的形成涉及突触前和突触后细胞黏附复合体内的多种跨突触信号。由于突触信号具有双向性，且细胞黏附分子种类繁多，因此很难确定参与突触形成的關鍵组分。因此，将单一细胞黏附蛋白转染至非神经元细胞中（在本例中，为GABA能中等棘状神经元最常见的两种突触后靶细胞） 体内α1/β2/γ2 或 α1/β3/γ2 GABAARs32极大地降低了突触后表面可获取的跨突触信号的复杂性，从而能够对该蛋白在促进突触形成中的功效进行精确的定量分析。

<table><tbody><tr><td>DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>使用前于37 &amp;deg;C水浴中预热</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td>危险：刺激性</td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Life Technologies</td><td>10106-169</td><td></td></tr><tr><td>Neuralbasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>使用前于37 &amp;deg;C水浴中预热</td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（10倍浓缩液）</td><td>Life Technologies</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>PBS（1倍工作液）</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1&lt;sup&gt;(+)&lt;/sup&gt; 哺乳动物表达载体（遗传霉素筛选）</td><td>Life Technologies</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1&lt;sup&gt;(+)&lt;/sup&gt; 哺乳动物表达载体（Zeocin筛选）</td><td>Life Technologies</td><td>V860-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1&lt;sup&gt;(+)&lt;/sup&gt; 哺乳动物表达载体（潮霉素筛选）</td><td>Life Technologies</td><td>V870-20</td><td></td></tr><tr><td>稳定表达HEK&amp;alpha;1&amp;beta;2&amp;gamma;2细胞系</td><td>Sanofi-Synthelabo, Paris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>G418硫酸盐（遗传霉素）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5013</td><td>危险：刺激性</td></tr><tr><td>博来霉素D1（Zeocin）</td><td>Life Technologies</td><td>R25001</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素B</td><td>Life Technologies</td><td>10687-010</td><td>危险：有毒、刺激性及腐蚀性</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>使用前于37 &amp;deg;C水浴中预热。危险：刺激性。</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 尼龙细胞筛</td><td>VWR</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>阿糖胞苷（Cytosine &amp;beta;-D-阿拉伯呋喃糖苷，Ara-C）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>危险：刺激性</td></tr><tr><td>螯合剂（Versene）</td><td>Life Technologies</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>脂质体转染试剂（Lipofectamine LTX）及脂质体转染缓冲试剂（PLUS试剂）</td><td>Life Technologies</td><td>15338-100</td><td>替代转染方法：Effectene试剂</td></tr><tr><td>非脂质体转染试剂（Effectene试剂）</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>低血清培养基（Opti-MEM）</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>偶联Cy5的鼠抗突触素结合蛋白抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>105311C5</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1726</td><td></td></tr><tr><td>BSA（牛血清白蛋白）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>豚鼠抗-&amp;gamma;2 GABA&lt;sub&gt;A&lt;/sub&gt;受体抗体</td><td>Prof. Jean Marc Fritschy</td><td>N/A</td><td>（瑞士苏黎世研究所）Fritschy, JM 和 Mohler, H. &lt;em&gt;J. Comp. Neurol.&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;359&lt;/strong&gt; (1), 154-194 (1995)。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>鼠抗谷氨酸脱羧酶（GAD）65抗体</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB351</td><td></td></tr><tr><td>鼠抗突触素抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>106-011</td><td></td></tr><tr><td>鼠抗-&amp;beta;2/3抗体（BD17）</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB341</td><td></td></tr><tr><td>兔抗-&amp;alpha;1 GABA&lt;sub&gt;A&lt;/sub&gt;受体抗体</td><td>Professor Anne Stephenson</td><td>N/A</td><td>（伦敦大学学院药学院）FA Stephenson &lt;em&gt;et al. J. Comp. Neurol.&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;416&lt;/strong&gt; (2), 158-172</td></tr><tr><td>偶联Cy5的山羊抗豚鼠抗体</td><td>Merck Millipore</td><td>AP1085</td><td></td></tr><tr><td>偶联Alexa Fluor 488的山羊抗鼠抗体</td><td>Merck Millipore</td><td>AP124S</td><td></td></tr><tr><td>偶联Alexa Fluor 405的山羊抗鼠抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A31553</td><td></td></tr><tr><td>偶联Alexa Fluor 555的山羊抗鼠抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>偶联Alexa Fluor 488的山羊抗兔抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>封片剂（Prolong Gold）</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>室温使用</td></tr></tbody></table>

在包含表达 gabaa 受体的 hek293 细胞与 gaba 能中型棘神经元共培养模型中的抑制性突触形成

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

抑制性神经元在中枢神经系统中发挥调节神经元网络动态性及时空协调的作用。γ-氨基丁酸（GABA）是大脑中主要的抑制性神经递质。它由抑制性神经元的突触前末梢释放，进入一种高度特化的细胞间连接结构——突触，在突触中与位于突触后神经元细胞膜上的GABAA受体（GABAARs）结合。这些GABA门控离子通道的激活会引起氯离子内流，导致突触后电位发生变化，从而降低这些神经元产生动作电位的可能性。
在发育过程中，具有不同形态学、电生理学和神经化学特性的多种抑制性神经元能够识别其靶神经元，并形成包含特定GABAA受体亚型的突触。这种对靶神经元的选择性支配原则引发了一个问题：合适的突触伙伴是如何相互识别的？
为了阐明潜在的分子机制，一种新型 体外 共培养模型系统建立完成，其中中等棘状GABA能神经元（源自胚胎纹状体的高度均一神经元群体）与稳定转染的表达不同GABA受体的HEK293细胞系共同培养AR亚型。该系统中突触可快速、高效且选择性地形成，并易于进行定量分析。我们的结果表明，多种GABAAR亚型在促进突触形成的能力上存在差异，表明这种降低的 体外 模型系统至少可以在部分程度上重现 体内 识别适当突触伙伴及形成特异性突触所需的条件。本文介绍了培养中等棘状神经元以及构建表达GABA的HEK293细胞系的实验方案。A首先描述Rs，然后详细介绍如何将这两种细胞类型进行共培养，并分析突触连接的形成。

该神经元-HEK293细胞共培养模型系统的实验方案已经过精细优化，以确保细胞的最佳存活。在此系统中，突触样结构的形成及其分析依赖于所有三种GABAAR亚基稳定且一致地表达，并组装成功能性受体。因此，在将HEK293细胞加入神经元培养物之前，必须通过免疫细胞化学分析检测HEK293细胞表面三种亚基的表达情况。在本实验中，使用特异性识别这些亚基胞外表位的亚基特异性抗体，检测到α1、β2和γ2亚基（图1A）或α1、β3和γ2亚基（图1B）在细胞表面的表达。结果表明，这些亚基在HEK293细胞表面具有高度的共定位。
在确认GABAAR亚基在HEK293细胞表面的表达及其共定位后，将表达α1/β2/γ2 GABAAR亚基的HEK293细胞与培养14天（体外培养14天，DIV）的中型棘状神经元共培养。共培养细胞孵育24小时后，经固定并利用免疫细胞化学和共聚焦显微镜进行分析。接触点分析显示，GAD65阳性的GABA能轴突末梢仅与对照组HEK293细胞形成零星接触（图2A，2B）。在加入HEK293细胞后4小时，每个HEK293细胞上的接触点数量为7.3 ± 0.9，24小时后减少至每个HEK293细胞5.5 ± 0.5个连接（均值±标准误）。相比之下，GAD65阳性的GABA能轴突末梢与表达GABAAR的HEK293细胞形成了大量类似突触的接触。在加入HEK293细胞后4小时，每个HEK293细胞的接触点数量为28.3 ± 4.7，共培养24小时后进一步增加至每个HEK293细胞52.1 ± 6.3个（均值±标准误）（图2A，2B）。
为了确定这些类似突触的接触是否具有“活性”， 即 为支持囊泡递质释放，在孵育23小时后，向共培养体系中加入一种针对突触囊蛋白（synaptotagmin）囊腔结构域的Cy5标记抗体。该抗体仅在神经递质释放过程中，当突触囊泡腔与突触间隙的细胞外液之间形成孔道时，才能进入突触前神经末梢。递质释放后，该孔道关闭，使与突触囊蛋白结合的Cy5荧光抗体保留在囊泡内部。因此，只有实际参与神经递质释放的囊泡才会被该抗体标记。在这些实验中，对照组HEK293细胞与中等棘状神经元末梢之间的接触几乎没有任何“活性”，表现为突触前标记物GAD65/突触囊蛋白荧光与HEK293细胞中的mCherry荧光缺乏共定位图3A）。相比之下，中等棘状神经元末端与表达α1/β2/γ2的HEK293细胞之间形成了许多“活性”接触，这通过GAD65/synaptotagmin与特异性在HEK293细胞中表达的mCherry之间高度共定位得以证实（图 3B).
为了检测不同亚型的GABAAR 还可促进类似突触的形成 体外我们共培养了表达α1/β3/γ2的HEK293细胞与中等棘状神经元。同样，在共培养24小时后，对照组HEK293细胞极少接收到突触素阳性突触前终末的接触，平均每HEK293细胞仅形成10.8 ± 0.48（均值 ± 标准误）个接触图 4A 左侧，4B）。然而，表达α1/β3/γ2 GABA的HEK293细胞ARs 与中等棘状神经元突触素阳性突触前终末形成的类似突触的接触显著增多，在共培养 24 小时后，每 HEK293 细胞达到 25.3 ± 0.27（均值 ± 标准误）个接触图 4A 右侧，4B）。这表明 α1/β3/γ2 GABAA在HEK293细胞中表达的Rs也能够促进突触接触的形成，尽管其效力低于含有α1/β2/γ2的GABA受体A卢比
这些实验表明，我们实验室建立的共培养模型系统能够实现对突触接触形成的定量分析 体外 以及对不同亚型GABA受体功效的评估A此过程中的 Rs。这些实验进一步证明了 GABAARs 除了作为 GABA 能突触的关键功能组分外，还可能在抑制性神经元与适当神经元靶细胞之间突触接触的识别与形成过程中发挥关键作用，且该作用独立于其他突触黏附蛋白。
<img alt="GABA受体亚基的免疫荧光显微镜图像，显示蛋白质定位的复合图像。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="图1"> 
图1. 稳定表达GABAAR α1/β2/γ2 或 α1/β3/γ2 的HEK293细胞系中亚基表达的免疫细胞化学分析。 使用识别GABAAR亚基胞外结构域的抗体标记细胞表面表达的受体。(A) 高水平表达α1（Alexa Fluor 488）、β2（Alexa Fluor 555）和γ2（Cy5）亚基的HEK293细胞系。(B) 高水平表达α1（Alexa Fluor 488）、β2（Alexa Fluor 555）和γ2（Cy5）亚基的HEK293细胞系。比例尺：10 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HEK293细胞培养荧光检测，pCherry，GAD65标记；接触分析柱状图。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="图2"> 
图2. GABA能中型棘神经元在共培养条件下与表达α1/β2/γ2的HEK293细胞形成类似突触的接触。(A) 使用抗GAD65抗体对突触前终末进行荧光标记（绿色），HEK293细胞则通过mCherry（红色，左图）或GABAAR γ2亚基（蓝色，右图）进行标记，结果显示这些标记物之间存在共定位点，表明在共培养4小时或24小时后形成了类似突触的接触结构。比例尺：10 μm。(B) 类似突触接触的定量分析。根据微分干涉差（DIC）成像所显示的细胞形态和/或mCherry表达来识别HEK293细胞，并利用成像软件在每个细胞的Z轴层扫图像系列（每细胞8–10层）中人工计数GAD-65阳性斑点（绿色）与HEK293细胞表面之间的接触数量，结果以每个细胞的接触数表示。柱状图显示了中型棘神经元与对照组HEK293细胞（浅灰色）或α1/β2/γ2-HEK293细胞（黑色）在共培养4小时和24小时后的接触数量（均值±标准误，n = 8，来自两次独立实验）。本图经Fuchs et al. (2013)30 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HEK293-pCherry 与 HEKα1/β2/γ2-pCherry 的荧光显微镜图像；GAD65/突触素分析。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="图 3"> 
图 3. GABAA受体促进活性突触连接的形成。 在中型棘状神经元末梢（GAD65阳性，Alexa Fluor 405 青色）与 (A) 对照组 HEK293 细胞或 (B) HEK293-α1/β2/γ2 细胞共培养24小时后形成的类突触接触的免疫标记图像，两种HEK293细胞均瞬时转染了mCherry质粒（红色）。活性突触连接通过突触小泡腔域特异性抗突触素抗体（Cy5）与GAD65特异性抗体在突触前末梢的共定位，以及mCherry在HEK293细胞中的表达来识别。比例尺：10 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示突触素、γ2 相互作用的 HEK293-mCherry 细胞显微图像；接触数图分析。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="Figure 4"> 
图 4. GABA 能中等棘状神经元在共培养条件下与表达 α1/β3/γ2 亚基的 HEK293 细胞形成类似突触的接触。(A) 使用抗突触素 I 抗体（绿色）对突触前末梢进行荧光标记，并对对照组 HEK293 细胞（左）或表达 α1/β3/γ2 的 HEK293 细胞（均瞬时转染 mCherry，红色）进行染色，结果显示在共培养 24 小时后，这些标记物之间存在共定位点，表明形成了类似突触的接触结构。比例尺：10 μm。(B) 类似突触接触的定量分析。通过 mCherry 表达鉴定 HEK293 细胞，并利用成像软件在每个细胞的 Z 轴层扫图像系列（每细胞 8–10 层）中人工计数突触素 I 阳性斑点（绿色）与 HEK293 细胞表面之间的接触数量，结果以每个细胞的接触数表示。该图显示了中等棘状神经元与对照组 HEK293 细胞（浅灰色）或 α1/β3/γ2-HEK293 细胞（黑色）在共培养 24 小时后的接触数量（均值 ± 标准误，n = 每组 8–12 个细胞，来自两次独立实验）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

在个体发育过程中协调抑制性GABA能突触形成的分子机制在很大程度上尚不清楚。为了研究这些过程，我们建立了一种共培养模型系统，该系统包含胚胎期中等棘状GABA能神经元与稳定转染表达功能性GABAA受体的人胚胎肾293（HEK293）细胞共同培养。

在包含表达 GABAA 受体的 HEK293 细胞与 GABA 能中型棘神经元共培养模型中的抑制性突触形成

抑制性神经元在中枢神经系统中发挥作用，以调节神经元网络的动态特性及时空协调性。GABA...

本实验旨在建立胚胎中棘神经元与稳定表达 GABA A 受体的 HEC 2 9 3 细胞之间的共培养体系，以研究体外 GABA 能突触形成的分子机制。首先，从 E 16 至 17 天的大鼠或小鼠胚胎中解剖纹状体。第二步，将纹状体细胞铺在盖玻片上。在24孔板中，稳定表达GABA A受体的HEK 293细胞随后被转染Mcherry荧光指示剂。最后一步，将转染后的细胞与体外培养14天的中型多棘神经元共培养24小时，然后进行固定。最终，可通过免疫荧光和共聚焦显微镜观察两个细胞亚群之间突触的形成。该技术的应用前景延伸至多种神经系统疾病的治疗，因为 GABA 能突触协调神经元细胞的活动，并负责中枢神经系统神经回路中许多基本的结构与功能元件。实验开始前，将 13 毫米多聚赖氨酸包被盖玻片孵育过夜。次日，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳及湿度的 24 孔板中，吸弃多余的多聚赖氨酸，并用无菌水清洗盖玻片，具体为两次十秒和两次五分钟的清洗。随后，在实验当天，将盖玻片置于层粘连蛋白中，在相同条件下孵育过夜。首先将一只孕鼠以仰卧位放置于经乙醇消毒的解剖垫上。然后用镊子夹起皮肤，环绕腹部切开皮肤、肌肉及腹膜，以暴露内部器官和子宫。接下来，从子宫中取出胚胎第16至17天的胚胎，并将其置于含有预冷PBS的培养皿中。将胚胎转移至层流罩内，将头部切下放入装有预冷HBSS的新培养皿中，然后使用弯头和直头镊子解剖出每个大脑。将大脑收集到装有预冷HBSS的新培养皿中。随后，对每个大脑，分离两侧大脑半球并小心移除脑膜。接着，沿海马体走行线切开，向后剥离皮层以暴露纹状体。半球前部可见一饱满的白色结构，需极其小心地解剖出纹状体，避免混入周围皮质组织，并将其置于新的培养皿中。在含有预冷 HBSS 的容器中，使用弯头镊将主动脉剪切成非常小的 1 至 2 毫米组织块。随后，使用火焰抛光的巴斯德吸管将组织转移至一个无菌的 15 毫升离心管中。将组织悬液体积浓缩至总计 1 毫升，并用吸管将溶液进一步吹吸 4 至 6 次。将吸管尖端火焰抛光至其原始直径的约 30%，以对溶液进行进一步 4 次吹打。当溶液呈现均质状态时，将细胞悬液通过 100 微米尼龙滤网过滤至一个无菌的 50 毫升离心管中。随后，将计数板计数为 7 × 10⁴ 的细胞加入 500 µL 神经元培养基中，接种至 24 孔组织培养板的一个孔内。左右晃动孔板，然后按照随附的文本方案所述，将细胞孵育 14 天。吸弃细胞培养基，用 PBS 短暂洗涤每个孔两次，以便将细胞从六孔板中解离下来。向每孔加入胰蛋白酶-EDTA溶液，于37摄氏度、5%二氧化碳加湿条件下孵育五分钟，以终止反应并淬灭。随后，向每孔加入一毫升细胞培养基，将内容物转移至15毫升离心管中，在室温下以440×g离心细胞五分钟。弃去上清液，用500微升神经元培养基充分重悬细胞沉淀，轻柔地吹打混匀。计数后，在已铺有神经元的24孔组织培养板中，每孔接种3×10⁴个细胞，轻轻晃动培养板使细胞分散。将共培养体系置于37摄氏度、加湿的5%二氧化碳环境中孵育24小时。在这些图像中，观察到α1、β2和γ2 GABA_AR亚基或α1、β3和γ2 GABA_AR亚基在HC293细胞表面高度共定位。此处，对体外培养14天时HC293细胞与神经元细胞间细胞接触的分析表明，与表达α1、β2、γ2 GABA_A受体的HEC293细胞形成的众多类突触接触相比，GAD65阳性的GABA能轴突末梢仅与对照HEC293细胞形成零星接触。在这些实验中，只有活跃参与神经递质释放的囊泡被抗synaptotagmin抗体标记。若对照 HEC 293 细胞与中棘神经元末梢之间存在任何接触，这些接触均非功能性接触。这可通过突触前 GAD65 突触蛋白荧光与 HEC 293 细胞内 mCherry 荧光之间缺乏共定位来证明。相比之下，中棘神经元末梢与表达 α1β2γ2 GABAA 受体的 HEC 293 细胞之间形成了许多功能性接触，这由 GAD65 突触蛋白荧光与特异性表达于 HEC 293 细胞内的 mCherry 荧光之间的高度共定位所揭示。在这些最终图像中，稳定表达不同亚型 GABA A 受体的 HEC 293 细胞与中等多棘神经元进行了共培养。分析表明，在共培养 24 小时后，突触阳性 GABA 能轴突末梢与表达 α1β2γ2 的 HEC 293 细胞之间形成了大量类突触接触。该技术有望为分子神经科学领域的研究人员探索参与 GABA 能突触形成的各种突触黏附分子的作用铺平道路。

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科研

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Neuroscience

神经科学

在共同的文化整合模式中GABA能神经元的刺和HEK293细胞抑制性突触形成稳定表达GABA一个受体

我们开发了一种新型的多区室神经元共培养微系统平台，用于体外研究中枢神经系统中轴突与胶质细胞的相互作用。该平台能够并行开展多达六项独立实验，并采用新开发的宏/微混合制造方法加工而成。...

一种多区室中枢神经系统神经元-胶质细胞共培养微流控平台

本文展示了使用荧光Alexa染料标记的α-银环蛇毒素来检测海马神经元中GABA...

使用α-银环蛇毒素结合位点标签研究GABA A受体的膜定位与转运

本方案描述了用于区室化分析神经元-胶质细胞相互作用的间接神经元-星形胶质细胞共培养方法。...

间接神经元-星形胶质细胞共培养实验：一种 体外 神经元-胶质细胞相互作用精细研究的实验装置

本文介绍了从结合到生理学和药理学层面发现作用于GABAA受体的活性化合物的实验方案。...

调控γ-氨基丁酸A型受体神经传递的新型化合物发现方法

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。...

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

本方案描述了一种基于细胞分选的方法，用于从出生后小鼠或大鼠的新皮层和海马中分离并培养荧光标记的GABA能或谷氨酸能神经元。...

通过荧光激活细胞分选建立的纯化GABA能或谷氨酸能神经元的原代细胞培养

本文介绍一种利用特定培养基的简单方法，可从胚胎皮层高效且可重复地建立富含神经元和星形胶质细胞的培养物，或神经元-胶质细胞共培养物。...

一种用于研究缺血过程中神经元-胶质细胞相互作用的细胞培养模型

本文描述了一种定量研究海马神经元轴突起始段（AIS）组装与结构的实验方案，这些神经元由于缺乏巨型锚蛋白-G而不存在预先组装的AIS。...

利用原代培养的海马神经元研究轴突起始段的组装

我们描述了一种用于诱导人源多能干细胞分化为脊髓星形胶质细胞和神经元，并将其共培养以进行电生理记录的方法。...

建立用于模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台：采用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元

即用型冷冻神经元储备是评估突触功能的有力工具。本文介绍一种利用96孔板，从冷冻储备中建立简易低密度原代培养的方法。...

利用冻存胚胎海马神经元进行简便且可重复的低密度原代培养

本研究介绍了一个从DNA到蛋白质功能及神经行为的多尺度研究框架。该研究提出了一种新方法，用于探究GABAA受体亚基中预测为致病性的突变，假设致癫痫突变以及被预测为致病性的邻近突变可能在CA1锥体神经元模型上产生相似的影响。...

GABAA受体亚基错义变异在海马锥体神经元中作用的位点特异性鉴定与分类

了解利用共培养模型研究GABA能抑制性突触形成的分子机制。该方法结合胚胎中等多棘神经元与稳定表达GABA_A受体的HEK293细胞，通过免疫荧光和共聚焦显微镜可视化突触接触，为神经环路功能障碍相关疾病的治疗研究提供重要模型。

在包含表达 GABA_A 受体的 HEK293 细胞与 GABA 能中型棘神经元共培养模型中的抑制性突触形成

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