Name: 对T细胞推导在体外从小鼠胚胎干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 了解使用OP9-DL1共培养系统从小鼠胚胎干细胞体外分化T细胞的方法。该技术为研究造血和T淋巴细胞发育的分子与细胞事件提供了可靠的体外模型。

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感谢Joon Kim在流式细胞术方面的专业协助。作者实验室的研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）SCORE项目（资助号SC1-GM095402，授予B.D.O）和加拿大卫生研究院（授予J.C.Z.P.）的支持。J.C.Z.P.还获得了加拿大发育免疫学研究主席职位的支持。亨特学院的生物医学研究基础设施部分由NIH少数族裔机构研究中心（RCMI）项目通过资助号MD007599提供支持。我们还感谢纽约州干细胞科学计划（NYSTEM）通过资助号C023048对亨特学院启动干细胞研究工作所提供的支持。

1. 培养基、细胞因子和明胶包被培养板的制备
<ol>
	<li>使用高糖和丙酮酸钠的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）配制ES细胞培养基。添加20%经胚胎干细胞验证的胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺、1% HEPES缓冲液、1%非必需氨基酸、0.1%庆大霉素（50 mg/ml）和0.1%（55 μM）β-巯基乙醇。通过过滤除菌法对ES细胞培养基进行灭菌。</li>
	<li>按照制造商说明，将粉末配制成1 L的α-最小必需培养基（α-MEM），制备OP9培养基。加入20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素，颠倒混匀。经滤器除菌，分装为两份500 ml等份。 
	注意：建议使用粉末配制的培养基，这可能有助于改善OP9细胞的维持培养。 体外 分化结果。该方法已成为我们的标准操作流程。然而，我们也注意到，有时使用预配制的液体α-MEM也能获得满意的效果。</li>
	<li>通过将10%二甲基亚砜（DMSO）加入90%胎牛血清（FBS）中配制冻存液。轻轻混匀，过滤除菌，4 °C保存。</li>
	<li>通过将人重组 Flt-3 配体（Flt-3L）溶解于完全 OP9 培养基中至终浓度 10 μg/ml，配制 2,000 倍浓缩的 Flt-3 配体（10 μg/ml）。分装至 1.5 ml 微量离心管中，于 -80 °C 保存。有关稳定性与储存条件，请遵循供应商提供的说明。 
	注意：Flt-3L 的稳定性较短（在 4 °C 下为 1 个月，或在 -80 °C 下为 3 个月）。</li>
	<li>使用完全OP9培养基配制1,000倍浓缩的IL-7（1 μg/ml）。分装至1.5 ml微量离心管中，于-80 °C保存。请遵循供应商关于稳定性和储存条件的建议（IL-7在-80 °C下可稳定保存长达12个月）。</li>
	<li>通过将10 μg/ml的白血病抑制因子（LIF）按1:10稀释，制备1,000倍浓缩液（10 μg/ml）7 ES细胞培养基中LIF的单位。将分装样品储存于4 °C。务必在分装管上注明生产商提供的有效期。 
	注意：本产品在浓缩或稀释状态下，自生产之日起至少可稳定保存18个月。</li>
	<li>用移液器向6孔板的每个孔中加入1.5 ml的0.1%明胶溶液，以制备明胶包被的6孔板。将培养板盖上盖子，置于室温下的无菌操作台中，静置至少30分钟以完成包被；也可将培养板置于湿润培养箱中过夜包被。在接种细胞前，需移除孔中残留的明胶溶液，但切勿使孔内的明胶溶液完全干燥。</li>
</ol>
2. 饲养层细胞与小鼠胚胎干细胞（mESC）的制备与培养
注意：所有细胞均须在含 5% CO2 的湿润化 37 °C 培养箱中孵育。
<ol>
	<li>解冻小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）
	<ol>
		<li>快速解冻一支冷冻的细胞冻存管（约 5 × 106 个细胞/管），该冻存管中含有经丝裂霉素 C 处理（或以其他方式实现有丝分裂阻滞）的 MEF，并将其转移至一个 15 ml 离心管中。</li>
		<li>以逐滴方式向解冻后的细胞中加入 8 ml ES 细胞培养基，逐步稀释冻存液中的 DMSO。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 3 ml ES 细胞培养基中。</li>
		<li>在 50 ml 离心管中加入 33 ml 预热的 ES 细胞培养基，再加入上述 3 ml 重悬的 MEF，使最终体积达到 36 ml。</li>
		<li>将重悬的 MEF 每 3 ml 分装至两个经明胶包被的 6 孔板的各孔中。将培养板放入培养箱中至少孵育 6 小时，以使细胞充分贴壁并铺展，之后再接种 mESC。若每 2–3 天更换一次培养基，这些有丝分裂阻滞的饲养层可在初次接种后数天内继续使用。 
		注意：也可使用新鲜制备的有丝分裂阻滞 MEF。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种 mESC
	<ol>
		<li>将一支冻存有 mESC 克隆的冻存管在 37 °C 水浴中快速解冻，并按照步骤 2.1.1–2.1.3 所述方法处理细胞。 
		注意：我们通常从一个 6 孔板中长满的单孔内冻存 2 支 mESC 冻存管。</li>
		<li>移除已制备好阻滞 MEF 单层的 6 孔板中每孔（每个 mESC 克隆对应一孔）的培养基，将 3 ml mESC 接种于 MEF 单层之上。加入 3 µl 1,000 倍浓缩的 LIF（终浓度 10 ng/ml）。将培养皿放回培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ES 细胞的维持与胰蛋白酶介导的传代 
	注意：每日更换培养基，或根据 mESC 的汇合度决定是否传代。最佳操作为每隔一天收获并传代/重铺细胞一次。
	<ol>
		<li>移除 ES 细胞培养基，用 2 ml PBS 洗涤 mESC，随后吸除 PBS。加入 1 ml 0.25% 胰蛋白酶，在 37 °C 孵育 3–5 分钟。</li>
		<li>收集经胰蛋白酶处理的细胞并转移至 15 ml 离心管中。用力吹打细胞悬液以打散 mESC 团块。向细胞悬液中加入 2 ml 完全 ES 细胞培养基以中和胰蛋白酶活性。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 3 ml ES 细胞培养基中。</li>
		<li>移除含有已制备阻滞 MEF 单层的 6 孔板中的培养基。根据所需的传代比例，将适量细胞悬液加入 3 ml ES 细胞培养基中，分装至各待接种孔中。每孔加入 3 μl 1,000 倍浓缩的 LIF。以 1:6 比例传代的汇合 mESC 培养孔将在 2 天后达到可再次传代的状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>OP9/OP9-DL1 细胞的维持
	<ol>
		<li>解冻一支 OP9 细胞冻存管（参照步骤 2.1.1–2.1.3，使用 OP9 培养基）</li>
		<li>向一个 10 cm 组织培养皿中加入 7 ml OP9 培养基。将 3 ml 重悬的细胞以逐滴方式加入，使细胞均匀分布于培养皿中。将细胞置于培养箱中过夜培养。</li>
		<li>次日检查 OP9 细胞的汇合度。若培养皿中存在大量死亡的悬浮细胞，则移除培养基并加入 10 ml 新鲜 OP9 培养基。若未观察到接近完全汇合，则将培养皿放回培养箱继续培养。对接近汇合的 OP9 单层细胞以 1:4 比例进行胰蛋白酶消化传代。 
		注意：培养板通常约在 2 天后再次达到相同汇合水平。注意避免 OP9 细胞过度汇合。</li>
		<li>将早期传代的 OP9 细胞冻存作为扩增储备。 
		注意：我们从一个接近汇合的 10 cm 培养皿中冻存 2 支 OP9 细胞。每支扩增储备冻存管可进一步扩增以制备工作储备，用于后续的 mESC 共培养实验。所有 OP9 储备细胞应保存于液氮中，而非 -80 °C 冰箱，因为温度波动可能对冻存质量产生不利影响。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. OP9-DL1 共培养步骤
<ol>
	<li>共培养制备
	<ol>
		<li>大约在共培养开始前一周，解冻MEFs、mESCs和OP9细胞的工作储备。由于OP9-DL1细胞在共培养第8天才需要使用，因此可在共培养开始后的前3天内解冻OP9-DL1细胞。根据需要维持或冻存所有细胞。</li>
		<li>根据实验规模，确定在共培养第0天达到80%汇合度所需的已铺有OP9细胞单层的10 cm培养皿的初始数量（例如，拟分化的mESC克隆数量以及需分析的共培养时间点数量）。为准备共培养实验，应在需要单层细胞前两天，将接近汇合的OP9细胞培养皿以1:4至1:6的比例进行传代。 
		注意：每个ESC克隆至少需要一块培养板。通常情况下，在第0天将一个ESC克隆接种于一块培养板（如以下所述），至第5天传代时应可获得足够细胞，用于接种六块培养板。每块第5天的培养板可用于一个后续分析时间点。</li>
		<li>由于OP9单层细胞在共培养传代过程中将持续需要，请务必在进行共培养的同时平行维持足够数量的额外OP9培养板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第0天：共培养的启动
	<ol>
		<li>按照 2.3.1–2.3.4 步骤收集 mESC。计数细胞。</li>
		<li>为每个mESC克隆准备5 × 104 每孔10毫升OP9培养基中的mESC 
		注意：尽管我们未使用该培养基，但我们注意到另一种替代培养基，其成分为α-MEM、10% FBS和5 × 10-5 有文献报道，β-巯基乙醇也可用于分化共培养。10</li>
		<li>从OP9培养皿中移除旧的培养基，加入10 ml mESC悬液，注意将细胞均匀分布于整个培养皿中。将培养皿置于37 °C培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：更换培养基
	<ol>
		<li>从培养箱中取出培养皿，在显微镜下观察。菌落应开始失去光泽，呈现扁平状。</li>
		<li>从培养皿中移除培养基，轻柔加入 10 ml 新鲜 OP9 培养基。</li>
		<li>将共培养皿放回培养箱。每天观察中胚层样集落的形成情况，以确定下一步（第5天）OP9饲养层单层细胞制备的时机；只有当约80–90%的集落呈现出中胚层样形态时，方可进行传代操作。第5天的细胞转移步骤最多可推迟2天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第5天：通过预铺板进行胰蛋白酶介导的传代。 
	注意：提前准备足量的含有最佳汇合度OP9细胞的10 cm培养皿。只有当共培养物在形态学上呈现出步骤3.3.3中所述特征时（另见代表性结果），方可进行后续操作。
	<ol>
		<li>移除共培养皿中的培养基，加入 4 ml PBS 洗涤，轻轻晃动后弃去 PBS。加入 4 ml 0.25% 胰蛋白酶，将培养皿置于培养箱中孵育约 5 分钟。</li>
		<li>通过剧烈吹打使胰蛋白酶消化后的细胞层分散，注意避免产生过多气泡，直至形成均一的、以单细胞为主的悬液。</li>
		<li>加入4 ml完全OP9培养基，用移液器轻轻吹打混匀。将细胞转移至新的空10 cm培养皿中，放入培养箱孵育30分钟，使OP9细胞贴壁。此“预铺板”步骤可减少转移至后续共培养步骤中的OP9细胞数量。</li>
		<li>在50 ml离心管中预先装入40 μm细胞滤网。</li>
		<li>从预铺板中收集非贴壁细胞，经细胞滤器转移至离心管中。用6 ml PBS轻柔洗涤培养皿，并将洗液通过同一滤器过滤，保留贴壁的OP9细胞。</li>
		<li>以 400 x 离心细胞 g 4 °C 下离心 5 分钟。弃上清液，将沉淀细胞重悬于 3 ml 完全 OP9 培养基中。计数细胞。</li>
		<li>从长满OP9细胞的10 cm培养皿中移除培养基。</li>
		<li>每个分析时间点接种 5 x 105 OP9单层细胞上，终体积为10 ml。</li>
		<li>加入5 ng/ml人重组Flt-3L，将培养皿放入培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第8天：造血祖细胞（HPC）采集 
	注意：提前准备足量的6孔板，每孔接种OP9或OP9-DL1细胞单层，确保在进行此步骤时细胞汇合度约为80%。
	<ol>
		<li>在50 ml离心管中装入40 μm滤网。</li>
		<li>从培养箱中取出培养皿，在显微镜下观察。造血前体细胞（HPCs）应以闪亮的细胞簇形式松散地附着在OP9单层细胞上。使用移液管和培养皿中现有的培养基轻轻冲洗OP9单层细胞（避免过度扰动），尽可能收集这些细胞。在收集和洗涤HPCs的过程中，为防止产生气泡，移液管尖端应始终保留至少1 ml的培养基。</li>
		<li>将细胞通过40 μm细胞筛滤入离心管中。向同一培养板中加入8 ml PBS，显微镜下检查是否已收集全部造血祖细胞（HPCs）。用PBS重复洗涤/收集步骤，必要时可加强洗涤力度。将细胞滤入已含有同板细胞的离心管中。</li>
		<li>以 400 x 离心细胞 g 4 °C下离心5分钟。</li>
		<li>配制主混合液，每块第5天接种的培养板加入3 ml OP9培养基，其中含5 ng/ml Flt-3L和1 ng/ml IL-7。</li>
		<li>移去上清液，将沉淀用含Flt-3L和IL-7预混液的OP9培养基重悬（每处理一个10 cm培养皿使用3 ml）。将每块培养板收集的细胞转移至含OP9细胞的6孔板中的一个孔内。
		<ol>
			<li>为诱导细胞向单核细胞、B细胞或红系分化，将收集的细胞接种至OP9细胞上。为诱导T细胞分化，将细胞接种至OP9-DL1细胞单层上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将6孔板放入培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第10天：更换培养基
	<ol>
		<li>为共培养中的每种不同的mESC克隆-饲养细胞类型组合准备一个15 ml离心管。</li>
		<li>将OP9培养基与5 ng/ml Flt-3L和1 ng/ml IL-7混合，配制总体积为每孔3 ml的混合培养基。</li>
		<li>轻柔地从6孔板的每个孔中收集培养基，将含有相同ESC克隆-饲养细胞类型组合的多个孔的培养基合并。</li>
		<li>向每个孔中加入 2 ml OP9 培养基主混合液（见 3.6.2）。</li>
		<li>将收集的培养基在400 x g 4 °C下离心5分钟。弃上清液，将每孔的沉淀物（若可见则非常小）用1 ml OP9培养基主混合液（见3.6.2）重悬，该体积对应于步骤3.6.3中最初收集的每孔样品。</li>
		<li>将原收集培养基的每孔细胞重新加入1 ml，使每孔体积恢复至3 ml。将培养皿放回培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第12天：不进行胰蛋白酶传代 
	注意：提前准备足量的含 OP9 或 OP9-DL1 细胞的 6 孔板，以确保在此步骤时细胞达到最佳汇合度。第 12 天适用于对发育中的红系、单核系及早期 T 细胞进行流式细胞术分析。
	<ol>
		<li>配制主混合液（每孔继续共培养需3 ml），将OP9培养基与5 ng/ml Flt-3L和1 ng/ml IL-7混合。</li>
		<li>为每种ESC克隆-饲养细胞类型的共培养组合，分别准备含40 μm滤网的50 ml离心管。</li>
		<li>用力吹打每个孔中的现有培养基，以分散孔内所有细胞（包括单层贴壁细胞）。持续用力吹打，直至形成类似单细胞悬液的状态。</li>
		<li>将收集的细胞通过滤网过滤至离心管中。向每个孔中加入3 ml PBS，以洗涤并收集所有残留的细胞。再次将细胞通过同一滤网过滤。合并含有相同ESC克隆-饲养细胞类型组合的多个孔中的细胞。</li>
		<li>弃去使用过的细胞滤网，取出相当于一个孔体积（约6 ml）的等分试样，用于当天所需的流式细胞术（或其他）分析。将这些等分试样在使用前置于冰上保存。</li>
		<li>以 400 x g 离心细胞 g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液。将50 ml离心管中的沉淀重悬于每孔3 ml主混合液中，用于重新接种。将每种细胞悬液各3 ml加入对应类型的饲养细胞孔中，并将培养皿放入培养箱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第14天：更换培养基
	<ol>
		<li>按照第 3.6 节中所述的步骤进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第16天：不进行胰蛋白酶传代 
	注意：提前准备好已生长至最佳汇合度的6孔板OP9或OP9-DL1细胞，用于此步骤。 
	注意：第16天是进行B淋巴细胞和中期T细胞流式细胞术分析的理想时间。
	<ol>
		<li>按照第3.7节中所述的步骤进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第18天：更换培养基
	<ol>
		<li>按照第 3.6 节中所述的步骤进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第20天：无需胰酶传代 
	注意：第20天是进行中期至晚期发育T细胞流式细胞术分析的理想时间。
	<ol>
		<li>按照第3.7节所述步骤操作。如有需要，可将正在分化的细胞继续培养至第20天以后，每两天交替进行培养基更换且不使用胰酶传代，并每日监测淋巴细胞扩增速率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

OP9-DL1 共培养系统已被用于研究各种基因产物在干细胞发育为血细胞类型过程中的作用。8,12,13 它也被证明是研究基因调控DNA在细胞分化过程中功能的有效模型。9,14 采用这种方法替代全鼠模型，可在回答造血过程中诸多基础科学问题的实验中显著节省时间和成本。然而，将本方案用于这些目的时，需充分认识到所用小鼠胚胎干细胞（mESC）克隆之间可能存在的变异性。已发表方案中的时间线适用于平均状态良好、常规维持且未经遗传操作的小鼠胚胎干细胞系。7 此外，用于制备嵌合小鼠的mESC克隆通常质量较高，在OP9共培养体系中表现出较强的分化能力。相反，直接来源于稳定转染并外源整合转基因的mESC克隆，其初始造血分化效率则存在差异，表现从平均水平到低于平均水平不等。本方案通过策略性地将第5天的传代步骤延迟1至2天，以在诱导造血分化之前均衡这些潜在差异。 体外
第8天的传代是本实验方案最容易出错的步骤。耐心、练习和仔细观察有助于掌握优化造血前体细胞收获并尽量减少OP9单层细胞破坏的技术。除了关键的第5天和第8天步骤...

已建立一种细胞培养系统，用于将小鼠胚胎干细胞（mESC）分化为T细胞 体外1 该系统利用Notch信号通路驱动T细胞分化的特性。2 OP9-DL1 细胞系是通过转导骨髓来源的 OP9 细胞而建立的3 与Notch配体Delta样1（DL1）共同作用。4 Notch信号通路的激活 体外 促进T细胞发育，同时抑制其他细胞谱系的分化。通过添加适当的细胞因子，该系统可提供一种细胞培养“微环境”，支持小鼠胚胎干细胞（mESC）依次向造血谱系及最终向T细胞谱系发育。该系统支持通过流式细胞术鉴定在胸腺中正常T细胞发育过程中各阶段所见的T细胞。针对特定T细胞发育相关问题的研究，该方法已成为一种颇具吸引力的替代方案 体内 整体小鼠模型5 和 体外 从小鼠胚胎干细胞衍生的造血前体细胞诱导T细胞发育的胎胸腺器官培养方法6 OP9共培养系统的主要优势在于其采用标准且简单的细胞培养技术，且无需持续使用实验动物。 
我们在实验中采用了一种详细且先前已发表的方案。7 我们已利用该技术检测未经修饰的小鼠胚胎干细胞（mESC）克隆、用于制备嵌合胚胎的高质量手工挑选mESC克隆8，以及直接从药物筛选中获得的稳定转染ESC克隆的造血分化产物。9 我们注意到，在该模型中，不同克隆从mESC向类似中胚层集落进行初始体外分化的时序动力学可能存在差异。可通过肉眼观察mESC-OP9共培养体系是否进展至中胚层阶段。虽然这一过程通常在共培养的第五天完成，但在个别克隆中可能延迟一到两天。为获得最佳的造血祖细胞（HPC）生成和强健的淋巴细胞生成，必须在转移前实现定量水平（约80–90%）的中胚层形成。因此，在同时操作多个mESC克隆时，最好将这一“第5天”的传代操作推迟至所有克隆均完成向中胚层样集落的转变。这可确保各克隆在转入造血分化条件后后续发育的同步性。在80–90%中胚层结构传代后的第三天，从小鼠OP9单层细胞中收集HPC。HPC可接种于新的OP9细胞上，以促进单核系、红系和B细胞谱系的分化；或者，HPC也可接种于OP9-DL1细胞上，诱导其向T细胞发育方向分化。所有体外分化培养自第5天起提供Flt-3L，并自第8天起进一步添加IL-7。在实验过程中不同时间点进行的流式细胞术分析可用于监测造血分化及T细胞发育各阶段和谱系的进展情况。共培养第16天开始出现CD4/CD8双阳性（DP）T细胞，至第20天时DP细胞和CD8单阳性（SP）细胞均大量存在。共培养体系的整体结果和稳健性在很大程度上依赖于能否通过肉眼准确判断关键发育转折点的完成情况。本方案旨在指导识别这些里程碑事件以及其他对成功分化至关重要的关键参数。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>干细胞鉴定级 FBS</td><td>Gemini</td><td>100-125</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-丙氨酰-L-谷氨酰胺</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>TMS-003-C</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素试剂溶液 (50 mg/ml)</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 中的&amp;beta;-巯基乙醇 (55 mM)</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>滤器单元</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &amp;mu;m PES 膜</td></tr><tr><td>细胞培养级水</td><td>Corning</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>12000-022</td><td>粉末，按制造商推荐方法重悬</td></tr><tr><td>碳酸氢钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoScientific</td><td>SH 30396.03</td><td>需对单一批次进行测试&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>重组人 Flt-3 配体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>308-FK</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-7</td><td>PeproTech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>LIF&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>含 0.1% 明胶的超纯水</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>经丝裂霉素 C 处理的 MEFs</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CF</td><td>任何有丝分裂阻滞的 MEFs 均可使用</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛（40 &amp;mu;m）</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿 100 × 20 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>多孔板 6 孔</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>带细胞筛帽的 5 ml 聚苯乙烯圆底管</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td>FACS&amp;nbsp;用管</td></tr><tr><td>ES R1 细胞</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1011</td><td></td></tr><tr><td>OP9 细胞</td><td></td><td></td><td>细胞可从日本理化学研究所细胞库获取。</td></tr><tr><td>OP9-DL1 细胞</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td>可向 Z&amp;uacute;&amp;ntilde;iga-Pfl&amp;uuml;cker 实验室申请获取细胞。</td></tr><tr><td>FlowJo 软件&amp;nbsp;</td><td>Tree Star</td><td></td><td>FACS 数据分析</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD</td><td></td><td>本实验室曾使用 FACScan、FACSCalibur 和 FACSVantage</td></tr></tbody></table>

t细胞的制备 体外 从小鼠胚胎干细胞

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

OP9/OP9-DL1 共培养系统已成为从小鼠和人类胚胎及造血前体细胞中诱导分化血细胞类型的成熟方法。目前该系统被广泛用于研究与造血相关的日益复杂的遗传学、细胞学和分子学问题，并处于将这些基础研究成果转化为治疗应用的前沿。该方法操作简便，常规操作即可获得稳定可靠的结果。然而，实现成功的造血分化 体外 需要特别注意试剂和细胞培养维护的细节。此外，该实验方案包含一些对技术较为敏感的步骤，这些步骤虽然并不复杂，但需要细心操作并经过练习才能熟练掌握。本文重点介绍从小鼠胚胎干细胞（mESC）分化诱导T淋巴细胞的实验流程。我们提供了一个详细的实验方案，并对关键步骤和参数进行讨论，以确保细胞分化结果具有良好的可重复性和稳健性 体外该技术的广泛应用有望减少动物实验的使用，降低基础与转化研究的成本并缩短研究周期，因此推动该技术的普及符合领域发展的利益。

在含有LIF的MEFs上培养时，小鼠胚胎干细胞（mESCs）可维持在未分化状态。在理想条件下，它们在相差显微镜下呈现为由明亮晕圈包围的致密细胞集落。图1）。这些培养物必须每天监测。根据细胞的融合度，可更换培养基或对细胞进行传代。邻近的小鼠胚胎干细胞（mESC）克隆不应相互接触。正常且健康的未分化mESC培养物是实验的必要起始条件 体外 T细胞分化。开始共培养时，建议细胞达到完全汇合但不过于密集。这样可确保收获并接种到OP9单层细胞上的细胞绝大多数为小鼠胚胎干细胞（mESC，而非饲养层细胞）。如果在第0天观察到拟分化的不同mESC克隆之间汇合度存在显著差异，则建议在计数mESC用于共培养接种前，通过预先贴壁法（使用完全ES细胞培养基，参照步骤3.4.3–3.4.6）去除小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。
在启动共培养之前，必须对OP9细胞进行良好维护（如第2.4节所述）。此外，据认为OP9细胞在长期培养或增殖速率显著增加的情况下会丧失部分特性7。在OP9细胞的维护过程中，避免传代比例超过1:5，并在连续培养六周后弃...

小鼠胚胎干细胞可通过 OP9-DL1 共培养系统在体外分化为 T 细胞。in vitro 操作的成功需要严格注意试剂和细胞的维持，以及若干对技术敏感的关键步骤。本文将讨论这些关键参数，并提供详细的实验方案，以促进该技术的广泛应用。

T细胞的制备 体外 从小鼠胚胎干细胞

OP9/OP9-DL1 共培养系统已成为从胚胎干细胞和造血干细胞分化获得各类血细胞的成熟方法……

本实验的总体目标是在体外诱导小鼠胚胎干细胞（ESCs）或胚胎干细胞（e ESCs）定量分化为T细胞。首先将ESCs接种于OP9基质细胞单层上，培养5至7天后，收集类似中胚层的细胞集落，并将其重新接种至新鲜的OP9细胞单层上。三天后，收集微小的圆形造血祖细胞（HPCs），并将其转移至新鲜的OP9单层培养体系，以生成红细胞、单核细胞和B细胞；或转移至新鲜的OP9-DL1单层培养体系以生成T细胞。最终，该方法可作为体外模型，用于研究调控造血作用及T淋巴细胞发育的分子、遗传和细胞事件。该实验方案由多伦多大学Juan Carlos Sunga Fluker博士实验室开发。我们从他的研究团队学习了该技术，以便将其应用于我们在亨特学院开展的T细胞发育过程中基因调控的研究。该技术相较于现有方法的主要优势在于，它能够利用细胞系对T细胞的发育进行实验操作和观察，而无需使用动物。首先，将50,000个鼠胚胎干细胞（ESC）溶于每孔10毫升的OP9培养基中。然后，从 OP9 培养板中吸除旧的培养基后，加入 ESC 悬浮液，注意将细胞均匀分布，并于第 5 天在 37 摄氏度下培养。当 80% 至 90% 的细胞集落呈现出可见的类似中胚层的形态时，吸除共培养皿中的培养基，并用 4 毫升 PBS 轻轻旋转洗涤细胞。接着，在 37 摄氏度下使用 4 毫升 0.25% 胰蛋白酶消化约 5 分钟后，通过剧烈吹打使细胞单层解离，注意避免引入过多气泡，直至获得均一的、以单细胞为主的悬浮液。然后将细胞与4 mL完全OP9培养基混合，接种至一个新的10 cm空培养皿中。30分钟后，通过40 µm细胞筛将未贴壁的非OP9细胞滤入50 mL锥形管中。随后用6 mL PBS轻轻洗涤培养皿，并将洗涤液通过同一细胞筛过滤。留下已贴壁的 OP9 细胞。将收集的细胞在 400 G 和 4 摄氏度下离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 3 毫升完全 OP9 培养基中。计数细胞后，移除处于最佳汇合状态的 OP9 培养物中的培养基，并将 500,000 个细胞以 10 毫升的终体积接种到 OP9 培养板中。在每个分析时间点，向每孔共培养体系中补充5纳克/毫升的人重组Fit3配体，并将培养板放入培养箱中。在第8天于显微镜下观察共培养体系，应可见造血祖细胞（HPCs）形成的亮泽细胞簇松散地附着于OP9单层细胞上。使用移液管和培养皿中已有的培养基轻轻冲洗OP9单层细胞，尽可能收集更多的细胞，注意不要过度破坏单层结构。为防止产生气泡，移液管吸头中始终应保留至少一毫升的培养基。将收集的细胞通过40微米细胞筛过滤，然后用8毫升PBS冲洗培养板。在显微镜下确认所有造血前体细胞（HPCs）均已收集，再将PBS冲洗液过滤至含有同一培养板细胞的离心管中。离心后弃去上清，将细胞沉淀重悬于添加了新鲜配制fit的OP9培养基中。将三种配体和IL-7混

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

对T细胞推导在体外从小鼠胚胎干细胞

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9...

从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

人类胚胎干细胞具有自我更新能力，并能分化为体内所有类型的细胞，这表明它们在医学应用以及作为研究发育和疾病基本问题的工具方面具有巨大潜力。本文提供了一种简明的逐步实验方案，通过免疫外科手术法分离内细胞团，从胚胎中获取人类胚胎干细胞。...

通过免疫手术法建立人类胚胎干细胞系

胚胎生殖细胞在早期发育阶段分化为原始生殖细胞的能力，是研究我们关于癌症与不育假说的理想模型。本方案展示了如何从小鼠交配后10.5至11.5天胚胎的发育性性腺中分离原始生殖细胞。...

小鼠胚胎生殖细胞的分离与获取

在本视频中，我们演示了小鼠囊胚的分离以及从囊胚中建立滋养层干细胞的方法。同时介绍了维持干细胞特性的培养条件，以及在体外诱导其分化的方案。...

从小鼠囊胚中分离滋养层干细胞

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

本视频展示了一种利用三维胸腺培养系统，从诱导多能干细胞（iPSC）来源的不成熟T细胞生成具有功能性的抗原特异性T细胞的实验方案。将iPSC来源的不成熟T细胞与内源性淋巴细胞耗竭的小鼠胎儿胸腺叶共培养后，T细胞成功成熟，形成CD8αβ+ MHC...

用于生成诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

初始CD4+ T细胞在激活时会根据所处环境极化为不同的亚群。体外诱导初始CD4+...

小鼠初始型CD4+ T细胞分离与 体外 T细胞亚群的分化

本文描述了通过分析T细胞前体的生成动力学、表型及数量，来表征胸腺定植前体细胞的体内和体外方法。...

利用小鼠胚胎胸腺定植前体细胞的表征 体内 和 体外 检测方法

本文介绍了一种从囊胚阶段小鼠胚胎中高效建立和培养多能干细胞系的实验方案。...

从小鼠植入前胚胎中建立干细胞系

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本方案描述了初始CD4+ 将T细胞转化为致病性Th17细胞 体外特别是当与基于多参数流式细胞术的方法相结合时，可从初始CD4细胞中获得纯度达90%的致病性Th17细胞+...

小鼠初始CD4+ T细胞体外分化为致病性Th17细胞

了解使用OP9-DL1共培养系统从小鼠胚胎干细胞体外分化T细胞的方法。该技术为研究造血和T淋巴细胞发育的分子与细胞事件提供了可靠的体外模型。

T细胞的制备体外从小鼠胚胎干细胞

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T细胞的制备 体外 从小鼠胚胎干细胞

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