高分辨率电子显微镜观察 幽门螺杆菌 铁可利用性不同条件下产生的 Cag IV 型分泌系统菌毛

该实验流程用于观察在铁限制条件下幽门螺杆菌（H. pylori）IV型分泌系统Cag的高表达现象。首先，在铁限制条件下培养幽门螺杆菌。第二步是将幽门螺杆菌与胃上皮细胞共培养。随后，对共培养样品进行扫描电子显微镜制样处理。

最终，高分辨率扫描电子显微镜被用于显示在铁限制条件下CAG IV型分泌系统针状结构的产生增加。本论文中所述技术对于幽门螺杆菌相关疾病（如胃癌）具有重要意义，因为CAG IV型分泌系统与疾病不良预后风险的增加相关。因此，深入理解这一重要细菌表面结构的调控机制十分关键。

细胞器可能揭示新的化疗靶点。与荧光显微镜等现有方法相比，高分辨率扫描电子显微镜的优势在于能够直接观察单个IV型分泌 pilus。初次使用该电子显微镜方法的研究人员在实验操作中常遇到困难，特别是湿化学步骤，因其需要精确的时间控制和精细的操作技巧。在血琼脂平板上培养细菌时尤其如此。

幽门螺杆菌PMs、S型细菌及其等基因CAGe突变株（缺乏功能性IV型分泌系统）。将菌种接种于添加胆固醇的改良Ella肉汤培养基中，过夜培养。随后，将GS人胃上皮细胞接种至12孔板中经多聚赖氨酸处理的盖玻片上，用于不同铁可用性条件下的实验。

将幽门螺杆菌（h pylori）用改良布鲁氏菌肉汤（modified bru broth）单独稀释至600 nm处的光密度（OD600）为0.3。培养基中分别添加100 μmol/L的氯化铁、200 μmol/L的合成铁螯合剂dipper，或200 μmol/L的dipper加200 μmol/L的氯化铁进行培养。培养4小时后，以1000 ×g离心细菌，将菌体沉淀重悬于等体积的新鲜改良布鲁氏菌肉汤中，该肉汤额外添加了胆固醇。

测定细菌密度。随后，以感染复数为20:1的条件用幽门螺杆菌（h pylori）感染上皮细胞。进行系列稀释，并将细菌细胞接种至血琼脂平板上。

为评估细菌细胞的活力，将共培养物置于细胞培养箱中孵育四小时。弃去幽门螺杆菌I与A GS共培养物的上清液。用0.05摩尔的磷酸盐缓冲液轻柔洗涤贴壁细胞三次。

然后在室温下固定样品 2 至 4 小时。接着用 0.05 摩尔的 sodium ca coate 缓冲液洗涤样品三次。进行二次固定时，将 0.1% 四氧化锇溶于 0.05 摩尔的 sodium ca coate 缓冲液中，分两次进行，每次固定 10 分钟。

然后经过三次洗涤后，用浓度递增的乙醇对样品进行脱水。将样品放入临界点干燥仪中，随后向腔室内充入液态二氧化碳。将乙醇从腔室中排出，并再次向腔室内充入液态二氧化碳。

然后将样品置于31.1摄氏度和1073 PSI的临界点条件下，接着将盖玻片安装到铝制扫描电镜样品台（SEM sample stubs）上，并在样品边缘涂上一薄条胶体银以实现接地。在扫描电镜成像过程中，使用溅射镀膜仪在样品表面镀上5纳米厚的金钯合金，以增强样品的二次电子信号和边缘效应。使用场发射电子枪扫描电子显微镜，在高真空模式下、工作距离为5至10毫米的条件下对样品进行观察。

将加速电压设置为五千伏特。然后将光斑尺寸设为2至2.5。现在将样品倾斜15至25度，以获得更佳的宿主-病原体界面视野，便于高倍观察。

优先对附着在上皮细胞边缘的细菌进行成像，以观察在宿主-病原体相互作用中富集的PI活菌。在ImageJ软件中打开显微图像文件。将PI li鉴定为细菌细胞与宿主细胞之间形成的结构，其宽度均匀，为10至13纳米，长度为60至150纳米。

使用直线工具绘制一条线，然后从下拉菜单中点击“分析”选项卡，以校准测量工具。选择“设置比例”，在“已知距离”下输入放大标尺的数值，并将长度单位设置为纳米，然后点击确定。

现在使用直线工具在引物的长度或宽度上进行绘制，然后按 Ctrl+M 测量每个引物，并将测得的数值记录到电子表格程序中。利用先前建立的长度和宽度参数，排除不符合 CAG IV 型分泌系统特征的结构。随后，基于在统计范围内的数值，对 PI I 的数量进行量化，并使用双尾学生 t 检验对 PI LI 的量化结果进行统计分析。

在本实验中，采用合成螯合剂二吡啶基二氮杂戊二烯（dip parital）在铁耗竭条件下培养幽门螺杆菌（h pylori），所用浓度对细菌生长无明显抑制作用。当该细菌与人胃上皮细胞共培养时，可产生大量CAG型IV型分泌系统PII。相反，当存在外源性营养铁时，CAG型IV型分泌系统PII的形成受到抑制。

在宿主-病原体界面处对PII进行定量分析表明，在铁限制条件下，幽门螺杆菌（H. pylori）的CAG IV型分泌系统PI眼（PI eye）增加了一倍，与仅在培养基中培养的细胞相比，堆叠细胞百分比增加了11%。有趣的是，尽管通过宿主IL-8分泌所测定的CAG IV型分泌系统活性在铁限制条件下增强，在铁过量条件下受到抑制，但PI LI的尺寸在所有铁可用性条件下均保持一致。与此一致的是，CAG IV型分泌系统的参与表明，铁的可利用性并不影响CAG突变体在形成后其表面PI LI的生物发生。

这种扫描电镜技术为CAG IV型分泌系统领域的研究人员探索蛋白质定位铺平了道路。关于CAG IV型分泌系统 pilus（菌毛）的研究，最近发现效应蛋白CAG A定位于IV型分泌 pilus 的尖端。