在流动条件下评估白细胞-内皮细胞相互作用 离体 自动灌流微流控腔室检测法

本实验的总体目标是建立一个离体动静脉闭路循环系统，以在生理流动条件下评估白细胞与内皮黏附分子之间的相互作用。该目标首先通过将感兴趣的内皮黏附分子包被于薄玻璃腔室表面来实现；第二步，将聚乙烯和硅胶管连接至该腔室，再通过手术方式连接到小鼠体内。

随后，颈动脉血液流经导管，原代白细胞与包被的玻璃腔室之间的相互作用被实时记录。最终，可随时间计算不同处理对白细胞在与固定化黏附分子相互作用时的位移和滚动速度的影响。

与现有的流式细胞分析等技术相比，该技术的主要优势在于，可以在生理流动条件下评估白细胞与内皮分子的相互作用。实验前一天，将一段1厘米长的PE-10聚乙烯导管连接至一段6厘米长的硅胶导管，再连接一段5厘米长的聚乙烯导管。为准备动物颈静脉侧的导管装置，对于颈动脉侧，按照上述方法连接导管，并在6厘米长的硅胶导管内插入一个TTU，位置距离1厘米长的聚乙烯导管约1.5厘米处。

接下来，将一段10厘米长的硅胶管一端连接到压力传感器上，并将颈动脉侧支T型管的T形端插入硅胶管的另一端。确保各连接部位紧密且无泄漏。然后使用连接25号针头的1毫升注射器，向每个微流控腔内注入新配制的内皮表面包被蛋白（目标蛋白），并将包被后的微流控腔置于15毫升离心管中，于4°C条件下过夜保存至次日。

为将颈静脉和颈动脉导管连接至微流控室，将一段1厘米长的硅胶管连接至微流控室的两侧，然后在导管与微流控室连接处覆盖一小块矩形的聚氨酯膜以密封接口。使用注射器将0.1%牛血清白蛋白注入微流控室及导管中。检查无泄漏后，将微流控室孵育45分钟。

在孵育接近结束且室温条件下，将微流控室置于培养皿的凹槽处，并在每个凹槽处滴加少量硅胶以固定微流控室。然后将颈静脉和颈动脉导管分别连接至微流控室的两侧。在硅胶干燥过程中，将一支装有肝素的60毫升锁定注射器连接至压力传感器，并使100 USP级肝素流经导管和微流控室，直至其中无气泡存在。

在将小鼠连接到微流室之前，打开计算机、显微镜和相应的压力记录设备。软件设置完成后，固定一只10至12周龄的小鼠。使其呈仰卧位，用剪刀在颈部区域做一切口，然后解剖甲状腺以暴露气管和血管。

清理颈动脉直至完全暴露，注意不要损伤迷走神经。然后将一段折叠缝线的弯曲部分从颈动脉下方穿过，并在弯折处剪断缝线。

因此，在动脉下方有两根缝合线。将每根缝合线分别打成松散的线圈结而不收紧，然后以相同方式放置左侧颈静脉的缝合线。颈静脉缝合线就位后，向小鼠腹腔内注射1毫升肝素。

注射后，收紧颈动脉上方的缝线，并在动脉暴露段尽可能低的位置放置血管夹。用镊子夹住上方缝线固定动脉，然后用精细的显微剪刀在靠近上方缝线处沿动脉周长约八分之一的位置做一小切口。接着使用导管夹持器将颈动脉导管经此切口插入动脉，并使其通过下方缝线处继续向下推进。

然后结扎下方缝线，再结扎上方缝线，使动脉在导管周围密封，打多个结以确保密封紧密。对颈静脉导管重复相同操作（无需使用血管夹），随后暂时打开颈动脉导管上的血管夹以测试血流。

若无泄漏，将小鼠移至显微镜下，并将颈动脉和颈静脉导管与微流室导管连接，以记录白细胞通过微流室的滚动速度。完全松开颈动脉夹以灌注微流室。让血液循环三到五分钟，使流动条件稳定。

同时，调节显微镜载物台，使腔室与显微镜物镜齐平，并使其边缘与屏幕上视频记录窗口平行。接着，准备一个含有室温水的培养皿，然后将10倍水浸物镜浸入培养皿中，以便观察流经腔室的细胞，根据需要调节光照强度以模拟中等生理流动压力，调节管路上的夹具，使传感器读数稳定在30毫米汞柱。随后按下开始按钮，启动白细胞迁移和压力的同步记录，首次延时成像从腔室的颈静脉端附近开始，逆着流动方向向颈动脉端移动，直至完成。

当记录结束后，关闭输入端的阀门以停止血流，必要时更换为涂有不同黏附分子的新腔室。在每次记录过程中，只有发生相互作用的白细胞会在腔室内清晰可见。例如，在下列每张图像中，白色箭头指示的是被目标黏附分子捕获并在腔室表面滚动的单个白细胞，而其他未结合的细胞则自由流动。

在血流中，所有图像中均可观察到 chamber 外部常见的伪影，即较大的黑色球形结构，这些结构可帮助观察者以固定点为参照，理解白细胞的运动情况。图中展示了数据的最终绘图结果。与对照组的滚动速度相比，第一种实验处理显示出滚动速度减慢，表现为曲线向左偏移；而第二种实验处理则显示出速度增加，表现为曲线向右偏移，以上结果均基于此实验流程得出。

其他方法，如标记白细胞以及使用活体成像技术（vivo x Viva），可用于进一步探究特定白细胞亚型在疾病进展中的作用。