基于荧光引物延伸法确定转录起点和核糖核酸酶的切割位点在体内
2014年10月31日
我们在这里描述了一种基于荧光的引物延伸方法，以使用自动凝胶测序仪确定细菌转录本和体内 RNA 加工的转录起点。
该程序的总体目标是使用荧光引物延伸反应从细菌中鉴定体内的转录起点和 RNA 切割位点。这是通过首先培养细菌（如大肠杆菌或 S aria）并分离 RNA 分子来实现的。接下来，使用特异性荧光引物和逆转录酶对 RNA 进行逆转录，得到 CD NA 片段。
然后从细菌细胞中分离 DNA 或质粒，并使用测序试剂盒从 DNA 模板创建荧光 Sanger 测序梯。最后，使用自动凝胶测序仪在聚丙烯酰胺凝胶上分离并同时检测 CDNA 片段和测序分子量标准，并相互比较。最终，荧光引物延伸用于将 RNA 分子的五个主要末端定位到一个碱基分辨率。
与其他方法（例如基于种族或放射性的一元延伸）相比，该技术的主要优点是快速识别 RNA 分子的五个末端，因为在电泳过程中检测同时进行。灵敏度类似于基于红色活性的初级扩展，但使实验室人员无需进行速率活度辐射安全培训即可使用该方法。我们已经成功地使用这种荧光初级延伸技术来研究毒素抗毒素系统的 RNA 成分。
演示该程序的葡萄球菌将是我实验室的研究生 Christopher Schuster。在制备高产量的 RNA 并根据文本方案设计引物后，首先将热循环仪预热至 95 摄氏度，进行引物延伸反应。对于每个 RNA 样品，将以下化合物混合在 PCR 管中，在 95 摄氏度下使样品变性 1 分钟。
然后将试管置于冰上 5 分钟，使引物和 RNA 杂交。接下来，将 PCR 机器设置为 47 摄氏度。然后按照此处的说明制备逆转录预混液。
向每个杂交的 RNA 样品中加入 4 μL（一种逆转录预混液），并在 47 摄氏度下孵育试管 1 小时。要停止反应，请将样品加热至 95 摄氏度 2 分钟。然后加入 6 微升甲酰胺上样染料，并在零下 20 摄氏度的黑暗中储存过夜或长达两周。
制备基因组 DNA 或质粒后，根据文本方案，通过将 12 微升约 10 至 15 微克基因组 DNA 或 100 至 500 纳克质粒 DNA 与 1 微升荧光标记引物和一微升 DMSO 移液管混合来组装 Sanger 测序反应。将每种测序混合物 1 μL 放入单独的预标记 PCR 管中。然后向每个试管中加入 3 微升 D-N-A-D-M-S-O 引物混合物。
将 PCR 机器设置为以下程序，并将样品放入机器后运行它。运行后，向样品中加入 6 微升上样染料，然后在冰上加入。如果立即使用或在零下 20 摄氏度下长期使用干净的无尘 25 厘米板，请在后玻璃板上放置 0.25 毫米的垫片，并将顶部的缺口玻璃板降低，玻璃板的缺口端和导轨入口导向器均朝上。
将凝胶导轨连接到玻璃板的两侧，并轻轻拧紧旋钮以灌注凝胶。将此处列出的化合物混合在带有搅拌棒的烧杯中，并放在磁力搅拌板上。添加 PS 并分组后，立即使用 50 毫升注射器吸取丙烯酰胺溶液，并在尖端放置 0.45 纳米过滤器。
将夹心板以 10 至 20 度角放置，在玻璃板之间缓慢分配凝胶溶液，同时不断将注射器尖端从一侧移动到另一侧。一旦凝胶溶液到达玻璃板的底端，就停止分配凝胶溶液。使用气泡钩，去除可能形成的任何气泡。
然后将凝胶袋垫片滑入缺口端的玻璃板之间，将其浸入凝胶溶液中，并通过连接铸板轻轻固定上轨螺钉进行固定，让凝胶凝固一到两个小时。在取下铸板和袋垫片之前，使用蒸馏去离子水清洁袋中的盐和凝胶残留物以运行凝胶。将缓冲液槽支架滑入前玻璃板上的凝胶导轨中，并拧紧旋钮。
将凝胶放入自动凝胶成像仪的下部凝胶槽中，靠在加热板上，并将导轨入口导向器滑入设备支架进行固定。使用一种 XTBE 缓冲液填充上下凝胶缓冲液室。然后关闭下缓冲室，并使用电源线将上缓冲室连接到电源。
如果凝胶袋中存在盐，请使用缓冲液反复移液到凝胶袋中进行清洁。然后使用顶部缓冲盖关闭顶部缓冲槽腔室。打开成像仪和计算机并根据文本协议启动基础图像 IR 数据收集软件后，使用此处列出的设置设置扫描仪控件。
接下来，选择电压开启并按 Enter，将空凝胶预电泳 20 分钟。同时，使用 PCR 机将测序分子量标准和引物延伸产物加热至 90 摄氏度 2 分钟，在冰上冷却之前，停止电泳，打开自动凝胶测序仪并取下上缓冲槽盖。然后将鲨鱼牙梳插入玻璃板之间和鲨鱼牙之间。
将 1 至 2 微升引物延伸产物或测序分子量标准反应物轻轻刺穿凝胶移液管到每个凝胶袋中。对于任何空口袋。使用上样染料填充它们，以防止不一致的运行行为，关闭缓冲槽和凝胶测序仪的门。
然后通过为激光器选择电压 on，选择扫描状态 on，然后按 enter 键来启动电泳。一旦感兴趣区域通过激光，如图所示停止电泳。引物延伸反应可用于确定目标转录本的转录起点或 TSP，并有助于推断启动子区域。
在这个例子中，MPE mRNA 的 TSP 被鉴定为 G，与之前发表的数据一致。负 35 和负 10 启动子元件被推断为 T-T-G-T-A-A 和 T-A-G-A-C-T，这些基序仅与使用它们的每个共有序列的碱基不同，使用引物延伸来识别 mRNA 切割产物。当 RNA 不存在或无活性时，此处显示了 RNA Ybi SEC 2 在 START co 附近切割的 RNA 映射，由于 RNA 活性，在靠近起始 CO ON的地方没有形成引物延伸产物。
然而，该图上起始涂层下游出现两条强条带，表明由于逆转录反应中过量的 RNA 导致引物延伸实验失败，从而无法识别单个条带。这表明模板 RNA 的总量必须根据目标 RNA 的丰度进行调整。观看本视频后，您应该对如何使用荧光引物和自动凝胶测序仪在体内阐明转录起点和 RNA 切割位点有一个很好的了解。
此方法执行起来既快速又简单。祝你的实验好运。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文描述了一种基于荧光的引物延伸方法，用于从细菌转录本中鉴定转录起始点和RNA切割位点。该方法利用自动化凝胶测序仪进行检测和分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 分子生物学
- 遗传学
背景
- 理解转录起始点对基因表达研究至关重要。
- 荧光引物增强了RNA分子的检测。
- 自动化凝胶测序提高了RNA分析的效率。
- 该方法适用于各种细菌种类。
研究目的
- 以高分辨率绘制RNA分子的5'端。
- 鉴定体内RNA加工事件。
- 开发一种研究细菌转录的可靠方法。
使用的方法
- 细菌培养的生长（例如，大肠杆菌，S. aria）。
- 从细菌细胞中分离RNA分子。
- 使用特定荧光引物进行逆转录。
- 创建荧光Sanger测序标准。
主要结果
- 成功绘制转录起始点。
- 鉴定RNA切割位点。
- 展示了使用自动化测序进行高分辨率检测。
- 在不同细菌种类中验证了该方法。
结论
- 基于荧光的引物延伸方法对研究细菌转录本有效。
- 这种方法提供了对体内RNA加工的见解。
- 该方法可适用于分子生物学的各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate mapping of transcriptional start sites and RNA cleavage events enables mechanistic de-risking in target validation for antibacterial drug discovery. This fluorescence-based primer extension technique provides base-resolution data to support lead identification and predictive confidence in early-stage programs. The method’s speed and safety profile facilitate integration into discovery workflows requiring rapid hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses and clarification of promoter architecture in bacterial targets.
- Operational Value: Provides functional validation of RNA processing events, reducing mechanistic ambiguity in toxin-antitoxin system studies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering high-resolution mapping of RNA ends to inform target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative cDNA fragment data suitable for assay standardization and reproducibility assessment.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening campaigns via simultaneous detection during electrophoresis.
- Scalability: Facilitates platform reuse through rapid one-day workflow compatible with automated gel sequencers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-phase RNA mapping to preclinical continuity by identifying processing sites relevant to virulence or stress response pathways.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable detection of cleavage sites in vivo.
- Predictive Value: Enhances translational biomarker alignment by defining exact RNA termini for follow-up functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions within early discovery to support hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports transcriptional start site mapping and RNA cleavage analysis to clarify gene expression mechanisms in bacterial models.
- Screening: Delivers assay-ready quantitative outputs via fluorescent cDNA fragment separation for comparative condition analysis.
- Analytics: Enables simultaneous detection of extension products and sequencing ladders to improve data confidence and reduce technical variance.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining RNA processing events that may influence target suitability for antibacterial development.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for RNA end mapping across multiple bacterial species in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through base-resolution mapping of transcriptional starts and RNA processing sites.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability via fluorescent detection and automated gel sequencing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by delivering high-confidence data on RNA ends for target advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology techniques including RNA isolation, primer design, and reverse transcription.
- Dependent on access to automated gel sequencers and denaturing polyacrylamide gel electrophoresis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for primer design, RNA quantification, and gel running conditions.
- Involves adaptation considerations for varying RNA abundance and secondary structure across different bacterial models.
- Practical limitations include the need to optimize RNA input amounts to prevent signal saturation and ensure band resolution.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:59
Primer Extension and Sanger Sequencing
4:26
Assembly of Gel Casting Chamber and Gel Casting
6:15
Running and Visualizing the Primer Extension Gel
8:41
Results: Transcriptional Start Point and RNase Cleavage Site Determination Using Fluorescent Primer Extension
10:20
Conclusion
