细胞与分子极化的快速和强大的分析趋化因子诱导信号
2014年12月12日
趋化因子信号转导引起细胞形态的显着改变和细胞内蛋白质的一些重要重新分布。在这里，提供了一个快速而详细的方案来研究这些事件。
以下程序的目标是快速、自动地量化细胞形态的变化和响应特定刺激的大量细胞中目标特定蛋白质的亚细胞定位。这是通过首先用化疗种类刺激 T 细胞来实现的。在第二步中，对细胞进行荧光标记，然后通过成像流式细胞术进行分析。
在最后一步中，可以根据每次染色的像素位置和强度来评估形态极化淋巴细胞的数量和荧光标记物的分离量，具体取决于所选的掩模。最终，这种成像流式细胞术技术可用于快速、稳健地量化趋化因子刺激后淋巴细胞的形态变化，以及目标特定蛋白质在极化细胞内的位置。与显微镜等现有方法相比，该技术的主要优点是可以重复处理和自动分析大量细胞，从而确保对形态变化和蛋白质分布的统计分析。
在趋化因子刺激的 T 淋巴细胞中，T 细胞的 Boche 型刺激首先在补充有 10 毫摩尔 HEPs 的温热 HBSS 中洗涤 5 次，每个实验条件的中心 5 次，在室温 G.At 340 次离心，去除脊髓酸痛并将沉淀重新悬浮在每管 0.3 毫升温热的 HBSS he 片中。然后将细胞悬液转移到单独的 1.5 ml 微量离心管中。向每支试管中加入每毫升 10 至 500 纳克趋化因子，然后翻转试管数次混合。
在 37 摄氏度的水浴中孵育细胞。8 到 10 分钟后，用 0.3 毫升温热的 2% 石戊醛和 10 毫摩尔终止极化。他豌豆。
然后将试管与更多翻转混合，并在 37 摄氏度下再孵育 5 分钟，以对细胞进行染色以进行免疫荧光分析。接下来，将受刺激的 T 细胞转移到相应的流式细胞仪管中。用染色缓冲液完全填充试管。
然后旋转细胞并将沉淀重悬于 PBS 中的 100 微升 5% 胎牛血清中。现在向每个试管中加入 5 微升 ZI N-T-H-L-A-A-B-C。涡旋它们并在孵育结束时在室温下在黑暗中孵育细胞 30 分钟。
洗涤细胞两次，然后在 500 微升 1% 对位甲醛中孵育。10 分钟后，在更多的染色缓冲液中洗涤细胞，然后用渗透缓冲液完全填充试管。在渗透缓冲液中洗涤细胞两次后，离开试管以去除旋突物，然后涡旋它们以解离细胞沉淀。
现在用零点 25 μg/mL，trixi for lino 对样品进行染色，涡旋并在室温下避光孵育 30 分钟。然后在孵育期结束时，在渗透缓冲液中洗涤细胞。再一次，复苏。
将沉淀悬浮在 200 微升 PBS 中，然后将细胞转移到单独的微量离心管中，以确定趋化因子刺激后极化 T 细胞的百分比。首先打开成像流式细胞仪，让它根据制造商的说明进行自我校准。绘制直方图，以量化在 RMS 梯度上选择的聚焦群体的 RMS 梯度值。
将微量离心管插入机器后，直方图在区域的直方图上描绘单细胞群，调整单个细胞的激光功率步态并获取 5， 000 T 淋巴细胞。在想法分析软件中。打开采集的文件，然后创建一个直方图，显示为每个单独细胞获得的明场图像的梯度 RMS 值，在细胞上绘制一个门，显示 RMS 梯度值高于 57。
在分析菜单中，从明场图像 M 零 1 侵蚀 2 像素的形态蒙版的形态蒙版中创建一个名为 erode M1 two 的新蒙版。然后在分析特征菜单中，从前一个门中创建的单元格中创建在侵蚀 M1 两个掩码上计算的面积的新特征。打开显示细胞面积的直方图 使用这个新创建的掩码，在单个 T 细胞上绘制一个门，不包括小区域中的校准珠和碎片，以及大区域中的双合体。
然后打开 a. 机器人，由 H-L-A-A-B-C 染色的原始最大值组成，作为分析掩码菜单中 Phin 染色的原始最大像素的函数，在分析掩码菜单后面的新掩码称为 erode M 两个，来自形态掩码的 H-L-A-A-B-C 染色细胞侵蚀了两个像素。然后在分析特征菜单中，创建一个新特征，该特征由在侵蚀物 M 2 2 上计算的圆度参数组成。
随后创建另一个直方图，以报告先前门控像元的圆度特征值。然后查看未刺激细胞的直方图形状，极化细胞的 RO 玛瑙，从最低圆度值开始，直到圆度极限值，其中绘制了大多数未刺激细胞以评估细胞内肌动蛋白染色的极化。加上明亮细节相似度的直方图，R 3 值，用于比较染色中的 H-L-A-A-B-C 和 foid。
然后使用与刚才演示的相同的门控策略，加上对非共定位分离染色的非共刺激细胞的 GA。统计面板在此处显示具有极化肌动蛋白染色的 T 细胞的百分比。显示了落在非极化或极化细胞门中的 CCL 19 刺激的 T 淋巴细胞的例子。
可以清楚地观察到两个亚群之间形态的差异。刚刚演示的门控策略也可用于绘制在不存在 CCL 19 的情况下落在极化门中的细胞百分比。正如预期的那样，很明显趋化因子刺激增加了极化 T 细胞的百分比。
也可以绘制在两种条件下获得的整个细胞群的平均圆度指数。事实上，CCL 19 刺激导致该指数下降。然而，由于只有一半的细胞是极化的，因此在 CCL 19 刺激下观察到的平均圆度指数的变化很小。
在该实验中，用 GFP 和 code 极性复合物 par 6 的显性阴性突变体的质粒对 T 细胞进行 cot 横切。PKC zeta.非 t 转染细胞的直方图允许对相关 GFP 阳性 T 细胞进行特异性设门，表明整个细胞群的一小部分已被转染。
然后通过仅测量 GFP 阳性细胞的圆度指数和 T 细胞的附加步态来量化这些转染细胞的形态极化程度。创建表现出低圆度值的 cookie 以估计在所采取的每种条件下极化电池的百分比。总之，这些数据表明，par 6 PK CZ 对信号通路功能的破坏抑制了 CCL 19 和 c Xcl 12 趋化因子诱导的 T 细胞极化。
与之前的调查结果一致。在尝试此程序时，在整个溶出亲缘刺激步骤和随后的固定过程中始终在 37 摄氏度下工作非常重要，以确保淋巴细胞的形态极化强大而可靠。
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概述
本方案概述了一种在趋化因子刺激后定量分析T细胞形态变化和蛋白质定位变化的方法。该方法利用成像流式细胞术对大量细胞群体进行快速分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 免疫学
- 定量成像
背景
- 趋化因子信号传导影响细胞形态。
- 细胞内蛋白质的重新分布对细胞功能至关重要。
- 传统显微镜方法在通量方面存在局限性。
- 成像流式细胞术可实现对大量细胞的自动化分析。
研究目的
- 定量分析趋化因子刺激后淋巴细胞的形态学变化。
- 评估特定蛋白质在极化细胞内的定位情况。
- 通过高通量处理提高统计分析的准确性。
使用的方法
- 用趋化因子刺激T细胞。
- 细胞的荧光标记。
- 通过成像流式细胞术进行分析。
- 细胞形态和蛋白质分隔的评估。
主要结果
- 快速定量极化淋巴细胞。
- 荧光标记分布的评估。
- 形态学变化的统计学稳健分析。
- 与传统显微镜方法的比较。
结论
- 成像流式细胞术可用于有效分析细胞形态。
- 该方法有助于深入理解趋化因子信号传导的作用。
- 它能够高效地研究大规模细胞群体。
常见问题
行业重要性概述
该方法可实现对趋化因子诱导的细胞极化及蛋白质重分布进行高通量定量分析，解决了免疫调节药物研发中靶点验证的关键瓶颈问题。通过在数千个细胞中自动化地进行形态学和共定位分析，该方法提高了对趋化因子受体通路早期阶段机制性风险评估的预测可信度。该策略支持对化合物对细胞极性影响的可扩展、可重复的评估，直接为临床前项目组合筛选中的立项/终止决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过定量测量肌动蛋白极化和磷酸化ERM蛋白的区隔化，作为信号通路激活的功能性读出指标，从而实现对趋化因子受体信号转导假说的验证。
- 操作价值：基于大规模细胞群体提供统计学上稳健的数据，降低变异性，提高对靶点结合评估结果的可信度。
- 转化价值：通过将受体刺激与明确的细胞骨架重排联系起来，在后续投入资源之前阐明其生物学功能，从而支持机制层面的风险降低。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：建立了一种基于成像的定量极化检测方法，可同时捕捉细胞形态变化和蛋白质重分布，从而实现对化合物效应的多参数分析。
- 操作价值：采用成像流式细胞术，每种条件下可处理5,000多个细胞，并通过自动设门确保检测在不同实验间的标准化和可重复性。
- 转化价值：生成可扩展、可多重检测的读数，适用于趋化因子靶向筛选项目中的苗头化合物验证和先导化合物优化。
转化与临床前研究
- 科学价值：可用于评估抑制性化合物（例如肌动蛋白聚合阻断剂）和基因扰动（例如 Par6/aPKC 突变体），为通路特异性的风险评估提供与疾病相关的实验体系。
- 操作价值：能够在同一样本内对极化与非极化亚群进行并行比较，提高内部对照水平和数据可解释性。
- 转化价值：通过将形态学极性与亚细胞蛋白分隔相关联——后者是功能性趋化因子应答的标志性特征——支持转化生物标志物的匹配与验证。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物发现的整个研究过程，为生化水平的受体结合与功能性细胞表型之间提供了定量关联。它能够早期评估化合物是否不仅调节受体结合，而且影响免疫细胞功能所依赖的关键下游效应机制。
- 发现生物学：通过量化形态极化和蛋白质共定位作为趋化因子受体信号传导的直接输出，阐明原代淋巴细胞中的通路活性，支持假设验证。
- 筛选：通过标准化的染色、刺激和成像流式细胞术方案实现检测就绪，生成用于化合物筛选的定量圆形度和共定位指标。
- 分析：提供均方根梯度、面积、圆形度和共定位读数，支持对不同条件及化合物对细胞极性影响的统计学比较。
- 转化研究：通过建立与疾病相关的读数（肌动蛋白/磷酸化ERM蛋白分离），反映体内极化事件，连接早期发现与临床前研究的连续性。
- 企业级复用：作为模块化即插即用的技术能力，适用于免疫学和肿瘤学团队研究趋化因子驱动的细胞迁移，可适配多种刺激条件和读出方式。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接、多参数可视化趋化因子受体信号通路中的极化事件，减少机制上的模糊性，从而提高预测的可信度。
- 操作价值：借助自动成像流式细胞术分析实现标准化和可扩展性，最大限度降低操作者偏差，并支持在不同实验场所间一致执行。
- 战略价值：通过提供对功能通路调控的早期定量洞察，改善“推进/终止”决策，减少因未预料到的生物学复杂性导致的后期研发失败。
- 项目组合影响：基于候选分子诱导或抑制真实细胞极化表型的能力，实现对趋化因子靶向候选物的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备成像流式细胞术操作、补偿调节以及基于掩模的形态学和荧光参数分析的专业知识。
- 依赖于成像流式细胞仪设备及配套软件，用于特征参数提取（如均方根梯度、圆形度、共定位等）。
- 需要在不同操作者之间对细胞刺激、固定和染色方案进行标准化，以确保极化检测结果的可重复性。
- 需针对每种细胞类型和刺激条件优化趋化因子浓度和孵育时间，以避免过度或不足刺激带来的假象。
- 仅适用于可耐受成像流式细胞术剪切力的贴壁细胞或悬浮细胞；对于脆弱或活力不足的原代样本，未经优化则不适用。
