在脊髓损伤的实验挫伤型号神经干细胞移植
2014年12月17日
脊髓损伤是一种创伤性条件，导致严重的发病率和死亡率高。在这项工作中，我们详细描述脊髓损伤的小鼠，随后通过神经干细胞的移植挫伤模型。
该程序的总体目标是详细描述小鼠脊髓损伤的挫伤模型，然后移植神经干细胞。这是通过首先用生命示踪剂 PKH 26 标记死后细胞、神经前体细胞或 PM NPC 来实现的。接下来，在小鼠上做一个背切口，露出脊髓。
然后使用无限水平或 IH 撞击器装置在脊髓上产生病变。最后，将 PKH 26 标记的 PM 和 PC 注射到小鼠的尾静脉中。最终，遵循移植的 PKH 20 下午 6：00 和病变部位 PC 的命运。
损伤模型复制了脊髓损伤男性。原发性机械损伤之后是进行性继发性变性，其中研究了细胞和药物治疗。所描述的应用可能为进一步了解信仰提供方法论基础。
在发生退化和炎症事件时诱导干细胞移植到脊髓中。演示病变的将是实验室的博士生 Tony Laja Longo 博士。虽然尾部注射将由 Dr.Ache 进行，但 Dr.Ache 是实验室的博士后研究员，从符合文本协议中描述的标准的神经干细胞开始。
复苏将细胞悬浮至每 150 μL 6 个细胞的 1 倍 150 倍。每只小鼠准备至少 1.2 乘以 10 到 6 个细胞，以有足够的细胞来加载移液器。使用神经干细胞培养基，在 10 mL 锥形瓶中洗涤细胞 3 次，在室温下以 500 倍 G 旋转 5 分钟以沉淀细胞。
每次洗涤后，在最后一次离心计数之前，细胞在离心后吸出上清液，留下约 25 μL 液体以防止吸出任何细胞。接下来，通过向细胞上颚中加入 1 毫升稀释剂 C 来制备 2 X 悬浮液，并使用轻柔的移液立即重悬。染色前，通过将 4 微升 PKH 26 乙醇 D 溶液加入试管中的 1 毫升稀释剂 C 中，在稀释剂 C 中制备 2 x 染料溶液，并充分混合。
为了快速分散，将 1 毫升 2 x 细胞悬液加入 1 毫升 2 XD 溶液中，并立即通过移液混合样品。将细胞死亡悬液孵育 1 至 5 分钟后，加入等体积的 1% BSA HBSS 溶液并孵育 1 分钟以终止染色。然后以 500 倍 G 离心细胞 10 分钟，并小心去除上清液。
使用 10 mL 完全培养基重悬细胞沉淀，以评估细胞回收率、细胞活力和荧光强度。离心细胞，弃去上清液，向细胞沉淀中加入 10 毫升 HBSS。用 HBSS 洗涤两次，并将细胞重悬于无菌生理溶液中。
根据文本方案准备手术区域和小鼠后，将动物背侧朝上放在载玻片加热器上，以避免手术过程中用手术刀体温过低，使用镊子在从 T 7 到 T 12 的感兴趣区域做一个垂直切口。在立体显微镜下握住在第五和第六胸突之间空间之间的皮肤和浅表脂肪垫。将血管下的过程数为 T 6，然后移至 T 7。
然后在鼠标的腹侧下方放置一个小轴承以增加脊柱的曲率，并使用 grof 镊子挡住脊柱以固定它。接下来，使用手术刀在椎体水平从 T 7 到 T 10 双侧切割椎肌旁，直到椎板的背表面接触手术刀尖端。然后用手术刀在椎体水平上勾出从 T 7 到 T 10 的连接处，直到椎板的背表面接触到 T 8 和 T 9 之间空间内的手术刀尖端挡块微小的突起。
然后用微型剪刀剪下 T 8 和 T 9 以及 T 9 和 T 10 之间的组织。现在使用 rongeur 删除 T nine 进程。使用微型剪刀小心地刮掉肌肉层，露出连接处。
继续作，直到露出骨骼。使用镊子从椎板中取出肌肉，并在椎骨之间打开一个小空间。然后轻轻地将微型剪刀插入骨头下方。
切开两侧的薄板，用镊子将其取出，露出脐带。使用 ron jour 去除留下的任何游离或锯齿状骨头碎片。然后去除 T 九背突的上半部分。
遵循 IH 撞击器方案后，根据文中的指南，使用四 oh 可吸收缝合线闭合切口，首先在去除的椎板部位覆盖暴露的脊髓。注意不要夹住下面的肌肉。使用两个或三个反射夹闭合皮肤。
在下背部皮下注射两毫升生理盐水，然后将鼠标放入加热垫上的预热笼中以恢复。进行细胞尾静脉注射。将细胞重悬于试管中，并将 75 μL 加入 0.3 mL注射器中，确保细胞悬液中没有气泡。
为避免细胞沉降，请将注射器保持在水平位置。将鼠标放在加热灯下方以扩张尾静脉。然后轻轻地将鼠标拉入限制器中，以观察外侧尾静脉，它显示为一条狭窄的蓝线。
用酒精棉签清洁尾巴，一旦看到静脉，就用左手中指和拇指抓住尾静脉。本视频中演示的 T 9 挫伤导致后肢功能短暂丧失 3 乘以 10 到第五个细胞，或者 PBS 在受伤后 30 分钟、6 小时和 18 小时分三次注射到尾静脉中。如图所示，在两到三周内，PBS 治疗受伤，小鼠改善，后肢功能达到基底小鼠量表的 3 个点或用 PM.NPCs 治疗的 BMS 小鼠，然而，显示出更高的恢复率并达到 4.5 个 BMS，如图所示，大多数移植的 pm NPC 标记有 PKH 26，积聚在病灶边缘形成簇。
给药后不久，移植的细胞沿着病变边缘迁移，并以更分散的方式分化为神经元。在病变和移植后 30 天，pm NPC 的细胞体大小增加，在大多数细胞中，树突状过程很明显，并且通过特异性抗体进行完全免疫染色 在获得此专业程序时，重要的是要记住，由于更严重的伤害，更高的力可能会增加动物的死亡率。因此，我们建议使用我们的病变范式，然后是更具可重复性的恢复过程。
看完这个视频，你应该对如何使用无限视界撞击器获得小鼠创伤性脊髓损伤的可重现实验模型有了很好的了解。
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概述
本研究详细描述了一种小鼠脊髓挫伤模型，随后进行神经干细胞移植。该程序包括标记神经前体细胞和创建脊髓损伤。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 再生医学
- 细胞生物学
背景
- 脊髓损伤导致严重的健康问题。
- 神经干细胞具有修复和再生的潜力。
- 理解损伤模型对于开发治疗方法至关重要。
- 挫伤模型在研究中常被使用。
研究目的
- 描述一种在小鼠中诱导脊髓损伤的方法。
- 研究移植神经干细胞的效果。
- 追踪移植后标记前体细胞的命运。
使用的方法
- 用PKH 26标记尸后神经前体细胞。
- 做背部切口以暴露脊髓。
- 使用无限视野冲击器创建脊髓损伤。
- 将标记的前体细胞注射到小鼠的尾静脉中。
主要结果
- 成功创建了小鼠的挫伤模型。
- 在损伤部位追踪嫁接的前体细胞。
- 洞察移植细胞在损伤后的行为。
- 对未来脊髓损伤治疗的潜在影响。
结论
- 挫伤模型有效用于研究脊髓损伤。
- 移植的神经干细胞显示出再生的潜力。
- 需要进一步研究以优化治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
This contusion model enables reproducible preclinical evaluation of neural stem cell therapies for spinal cord injury, supporting target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine pipelines. By combining a standardized injury paradigm with intravenous stem cell delivery, the approach facilitates quantitative assessment of engraftment, differentiation, and functional recovery, informing go/no-go decisions in early discovery. The model’s reproducibility and translational alignment enhance predictive confidence for portfolio triage in neurodegenerative disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding stem cell-mediated repair in a clinically relevant injury context.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for functional target validation of neural precursor cells through standardized lesion parameters.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by tracking labeled cell fate and differentiation at the injury site over time.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable histological and functional outputs (e.g., BMS scoring, fluorescence intensity) for compound or cell therapy screening.
- Reproducibility: The Infinite Horizon Impactor ensures consistent lesion severity, reducing variability in downstream efficacy assessments.
- Scalability: Tail vein injection allows systemic delivery testing, enabling evaluation of biodistribution and engraftment efficiency across doses.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models progressive secondary degeneration following primary mechanical injury, mirroring human spinal cord injury pathophysiology.
- Translational Continuity: Tracks engrafted PM NPCs migrating to lesion edges and differentiating into neurons, supporting biomarker-aligned efficacy evaluation.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables comparison of PBS versus stem cell-treated groups on functional recovery (BMS scores), informing preclinical go/no-go criteria.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for cell-based therapies in neurodegenerative indications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stem cell mechanisms of action in secondary injury cascades.
- Screening: Enables standardized assessment of cell therapy engraftment and lesion modulation via PKH 26 labeling and imaging.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables including BMS scores, cell survival metrics, and differentiation markers for cross-group comparison.
- Translational Research: Connects early engraftment behavior to longer-term regenerative outcomes, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable surgical and transplantation workflow for iterative testing of multiple cell lines or dosing regimens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stem cell therapy MOA through direct tracking of labeled precursors.
- Operational Value: Standardizes injury induction and cell delivery, improving inter-lab reproducibility and assay robustness.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early failure detection in regenerative candidates.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization based on functional recovery thresholds and engraftment patterns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical spinal cord exposure and Infinite Horizon Impactor calibration.
- Dependent on sterile cell handling, fluorescence microscopy, and behavioral scoring infrastructure.
- Necessitates cross-functional standardization between surgery, cell preparation, and pharmacology teams.
- Adaptation considerations include species-specific scaling of injury parameters and cell dosing.
- Practical limitations include variability in secondary degeneration kinetics and cell survival rates, as noted in the source.
