脊髓损伤实验性挫伤模型中的神经干细胞移植
2014年12月17日
脊髓损伤是一种导致严重发病率和高死亡率的创伤性疾病。在本研究中，我们详细描述了一种小鼠脊髓损伤的挫伤模型，随后进行神经干细胞移植。
本实验的总体目标是详细描述一种小鼠脊髓损伤的挫伤模型，并随后进行神经干细胞移植。首先，使用活体示踪剂PKH 26标记死后神经前体细胞（PM NPCs）。接着，在小鼠背部做一背侧切口，暴露脊髓。
然后使用无限远侧或 IH 撞击器装置在脊髓上制造损伤。最后，将 PKH 26 标记的 PM 和 PCs 注射到小鼠尾静脉中。最终，追踪移植至损伤部位的 PKH 26 标记的 PM 和 PCs 的归宿。
该损伤模型可复制人类脊髓损伤。在初始的机械性损伤之后，会继发进行性继发性退变，可在该模型中研究细胞和药物治疗。所述应用可为深入探索该领域提供方法学基础。
在脊髓发生退行性变和炎症反应的同时，诱导移植的干细胞。由实验室博士生 Tony Laja Longo 博士演示病损部位的处理，而尾部注射将由实验室博士后研究员 Dr.Ache 操作。实验起始于符合文本方案中所述标准的神经干细胞。
重悬细胞，使其浓度达到每150微升含1×10⁶个细胞。每只小鼠至少准备1.2×10⁶个细胞，以确保有足够细胞用于上样移液。使用神经干细胞培养基，在10毫升锥形管中洗涤细胞三次，每次在室温下以500×g离心5分钟，使细胞沉淀。
每次洗涤后，在最后一次离心前，离心结束后吸除上清液，保留约 25 微升液体，以防止吸走任何细胞。接下来，通过向细胞沉淀中加入 1 毫升稀释液 C，制备两倍浓度的悬浮液，并立即用轻柔的移液操作充分重悬。染色前，在离心管中将 4 微升 PKH 26 乙醇 D 溶液加入 1 毫升稀释液 C 中，配制成两倍浓度的染料溶液，并充分混匀。
为了快速分散，将一毫升两倍浓度的细胞悬液加入一毫升两倍稀释液中，并立即通过移液混匀样品。将细胞悬液孵育一至五分钟之后，加入等体积的含1% BSA的HBSS溶液以终止染色，并孵育一分钟。然后在500 × g 条件下离心10分钟，小心移去上清液。
使用 10 毫升完全培养基重悬细胞沉淀，用于评估细胞回收率、细胞活力和荧光强度。离心细胞，弃去上清液，向细胞沉淀中加入 10 毫升 HBSS。用 HBSS 洗涤两次，并将细胞重悬于无菌生理溶液中。
按照文本方案准备手术区域和小鼠后，将动物背侧朝上置于载物片加热板上，以防止手术过程中发生低体温。使用镊子在显微镜下定位第五和第六胸椎突之间的区域，从T7至T12水平使用手术刀做一纵向切口。在体视显微镜下夹住皮肤及位于该区域胸椎突间隙间的浅层脂肪垫。以血管下方的椎突计为T6，随后移至T7位置。
然后在小鼠腹侧下方放置一个小轴承，以增加脊柱的弯曲度，并使用鳄嘴钳夹住脊柱使其固定。接着，使用手术刀在椎体水平从 T7 至 T10 双侧切开椎旁肌，直至椎板背侧面接触到手术刀尖端。随后，使用手术刀在椎体水平从 T7 至 T10 处轻轻刮除骨连接组织，直至椎板背侧面接触到手术刀尖端，并在 T8 与 T9 椎骨之间的小突起间隙处停止操作。
然后使用显微剪刀在第八胸椎与第九胸椎之间以及第九胸椎与第十胸椎之间剪开组织。现在使用咬骨钳去除第九胸椎的突起。用显微剪刀小心刮除肌肉层，以暴露连接部位。
继续操作直至骨骼暴露。使用镊子去除椎板上的肌肉，并在椎骨之间打开一个小空间。然后将显微剪刀轻轻插入骨下。
在两侧切开椎板，并用镊子将其移除，暴露脊髓。使用咬骨钳清除残留的游离或尖锐骨碎片。然后切除第九胸椎棘突的上半部分。
根据文中的指南，遵循IH撞击器设备的操作方案后，使用4-0可吸收缝线关闭切口，首先覆盖在去除椎板处暴露的脊髓。注意不要夹住下方的肌肉组织。使用两到三个回形夹关闭皮肤。
在小鼠下背部皮下注射两毫升生理盐水，并将小鼠置于预热的笼子中，放在加热垫上使其恢复。进行尾静脉细胞注射时，将细胞在试管中重悬，并吸取75微升至0.3毫升注射器中，确保细胞悬液中无气泡。
为避免细胞沉淀，应将注射器保持在水平位置。将小鼠置于加热灯下以扩张尾静脉。然后轻柔地将小鼠拉入固定器中，以观察侧尾静脉，该静脉呈现为一条细的蓝色线条。
使用酒精棉片清洁小鼠尾巴，待静脉显现后，用左手拇指和中指夹住尾静脉。本视频中展示的T9挫伤模型导致后肢功能短暂丧失。将3 × 10⁵个细胞或PBS通过尾静脉分三次注射，分别在损伤后30分钟、6小时和18小时进行。如图所示，在2至3周内，经PBS处理的损伤小鼠后肢功能有所改善，达到基础小鼠运动评分（BMS）的3分；而经PM.NPCs治疗的小鼠恢复更佳，达到BMS评分4.5分。如图所示，大多数移植的PKH26标记的PM.NPCs在损伤边缘聚集，形成细胞簇。
移植后不久，移植的细胞沿损伤边缘迁移，并以更弥散的方式分布，随后分化为神经元。损伤和移植后30天，前脑来源的神经前体细胞（pm NPCs）的胞体体积增大，大多数细胞出现明显的树突样突起，并能被特异性抗体完全免疫染色标记。在实施该实验操作时，需注意施加过高的作用力可能会因造成更严重的损伤而增加动物死亡率。因此，我们建议采用本研究中的损伤模型，该模型可实现更可重复的恢复过程。
观看本视频后，您应能够充分理解如何利用无限地平线撞击器在小鼠中建立可重复的创伤性脊髓损伤实验模型。
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概述
本研究详细描述了一种小鼠脊髓损伤的挫伤模型，随后进行神经干细胞移植。该操作步骤包括标记神经前体细胞以及构建脊髓损伤病灶。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 再生医学
- 细胞生物学
背景
- 脊髓损伤会导致严重的健康问题。
- 神经干细胞在修复和再生方面具有潜力。
- 理解损伤模型对于开发治疗方法至关重要。
- 挫伤模型在研究中被广泛使用。
研究目的
- 描述一种在小鼠中诱导脊髓损伤的方法。
- 研究移植神经干细胞的效果。
- 追踪移植后标记前体细胞的命运。
使用的方法
- 使用 PKH 26 标记死后神经前体细胞。
- 做背部切口以暴露脊髓。
- 使用无限地平线撞击器制造脊髓损伤。
- 将标记的前体细胞注射到小鼠尾静脉中。
主要结果
- 成功建立小鼠挫伤模型。
- 追踪移植前体细胞在损伤部位的定植情况。
- 深入了解损伤后移植细胞的行为特征。
- 对未来脊髓损伤治疗具有潜在意义。
结论
- 挫伤模型对研究脊髓损伤具有良好的效果。
- 移植的神经干细胞在促进再生方面显示出潜力。
- 需要进一步研究以优化治疗策略。
常见问题
行业重要性概述
该挫伤模型可实现对脊髓损伤的神经干细胞治疗进行可重复的临床前评估，支持再生医学研发流程中的靶点验证和机制性风险排除。通过结合标准化的损伤范式与静脉内干细胞输送，该方法有助于对细胞植入、分化及功能恢复进行定量评估，为早期发现阶段的决策提供依据。该模型的可重复性与转化一致性可提高神经退行性疾病项目中候选方案筛选的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在具有临床相关性的损伤背景下，验证关于干细胞介导修复的治疗假说。
- 操作价值：通过标准化的损伤参数，为神经前体细胞的功能性靶点验证提供可重复的实验平台。
- 预测价值：通过随时间追踪标记细胞在损伤部位的命运及分化情况，支持机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：可生成可量化的组织学和功能学输出结果（例如 BMS 评分、荧光强度），用于化合物或细胞治疗的筛选。
- 可重复性：无限地平线撞击器（Infinite Horizon Impactor）可确保损伤程度的一致性，降低后续疗效评估中的变异性。
- 可扩展性：尾静脉注射可实现全身给药测试，从而能够在不同剂量下评估生物分布和移植效率。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：模拟原发性机械性损伤后进行性继发性退变，反映人类脊髓损伤的病理生理过程。
- 转化连续性：追踪移植的PM NPCs迁移至损伤边缘并分化为神经元的过程，支持基于生物标志物的疗效评估。
- 风险校正的进展评估：可比较PBS组与干细胞治疗组在功能恢复（BMS评分）方面的差异，为临床前决策（继续或终止）提供依据。
流程与工作流整合
该方法可整合到从靶点验证、先导化合物鉴定到临床前药效学测试的整个发现流程中，尤其适用于神经退行性疾病领域的细胞治疗研究。
- 发现生物学：支持在继发性损伤级联中对干细胞作用机制进行假设验证。
- 筛选：通过PKH26标记与成像，实现对细胞治疗移植及病灶调控的标准化评估。
- 分析：提供包括BMS评分、细胞存活指标和分化标志物在内的定量因变量，用于组间比较。
- 转化研究：将早期移植行为与长期再生结果相联系，支持生物标志物的匹配。
- 企业级复用：建立可重复使用的手术与移植工作流程，用于多种细胞系或给药方案的迭代测试。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接追踪标记的前体细胞，减少干细胞治疗作用机制中的机理性模糊。
- 操作价值：标准化损伤诱导和细胞递送流程，提高实验室间的可重复性和检测的稳健性。
- 战略价值：通过实现对再生候选疗法早期失败的检测，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：基于功能恢复阈值和细胞植入模式，指导经风险调整后的优先级决策。
实施注意事项
- 需要具备显微外科脊髓暴露和Infinite Horizon撞击器校准的专业技术。
- 依赖无菌细胞操作、荧光显微镜观察和行为学评分基础设施。
- 需要手术、细胞制备和药理学团队之间的跨功能标准化。
- 适应性考虑因素包括损伤参数和细胞剂量的物种特异性缩放。
- 实际局限性包括继发性变性动力学和细胞存活率的变异性，如原文所述。
