使用停流荧光法与标记核苷酸分析驱动蛋白的ATP转换循环

本实验的总体目标是测量驱动蛋白在 ATP 转运循环过程中核苷酸结合与解离的动力学。首先制备不含核苷酸或负载荧光标记核苷酸的驱动蛋白，随后利用停流荧光仪将制备好的驱动蛋白与核苷酸混合，观察荧光标记核苷酸结合或解离过程中荧光信号的变化。

然后将荧光变化拟合到指数函数，以获得速率常数。最后，对测得的速率常数进行解析，并将各个速率常数归因于ATP转化循环中的特定步骤。最终，通过结合荧光标记核苷酸与停流荧光技术，用于测量核苷酸结合与解离的动力学过程。

本实验操作将由本实验室的博士后Jennifer Patel和研究生Hannah Belch进行演示。根据文本方案所述，在无镁缓冲液中加入浓度最高达20 µM的驱动蛋白（kinesin），并加入1 mM EDTA和1 mM DTT，于25°C孵育15分钟，以测定驱动蛋白结合荧光标记核苷酸后的荧光强度。随后，搭建重力流G-25 SX凝胶过滤柱，并用至少三个柱体积的无镁缓冲液进行平衡。然后将驱动蛋白溶液上样至柱中，以分离游离的核苷酸和EDTA与驱动蛋白的复合物。

通过向空收集管中加入100毫摩尔氯化镁溶液，使氯化镁的终浓度为1毫摩尔，从而修复收集管。收集驱动蛋白溶液后，使用适当的无镁缓冲液快速洗脱驱动蛋白。收集管中存在氯化镁有助于驱动蛋白从层析柱洗脱后立即保持稳定。将驱动蛋白置于冰上保存，并在1至2小时内使用。

同时，准备一系列不同浓度的 mant ATP 溶液。根据可用的驱动蛋白浓度选择合适的浓度范围。针对每一种 mant ATP 浓度，配制相应浓度的驱动蛋白，使荧光标记的核苷酸相对于驱动蛋白的核苷酸结合位点过量 5 至 10 倍（摩尔比）。

将停流荧光仪的激发波长设置为365纳米，并使用长通滤光片将发射波长设置在400纳米以上。接下来，从最低浓度的Manta TP开始，使用停流荧光仪将Manta TP与无核苷酸的驱动蛋白以1:1的体积比混合。利用以下公式，将每个Mant A TP浓度下测得的荧光强度变化拟合为指数函数，并叠加一条具有恒定负斜率的直线，以校正Mant基团的光漂白效应。

根据这些拟合结果，确定每个 mantATP 浓度下的速率常数，然后通过将 kobs 对 mantATP 浓度作图，解析出结合与解离速率。随后将这些数据拟合为线性函数，以获得斜率和 y 轴截距。

梯度代表 man a TP 结合的速率常数，单位为每摩尔每秒。截距代表解离速率常数，单位为每秒。为测量解离速率常数，将 DP 发酵至含有 2 µM 驱动蛋白的合适缓冲液溶液中，温度为 50。

微摩尔浓度意味着将DP在25摄氏度的培养箱中孵育30分钟。在使用G-25 Sedex层析柱去除游离的mant后，获得与动力蛋白结合并负载了mant-ADP的DP，然后按照本视频前面所述设置停流混合装置，利用停流装置将mant-ADP-动力蛋白复合物与50倍或更高摩尔过量的未标记ATP以1:1的体积比混合。随时间观察到的荧光强度下降可用单指数函数加上一条恒定负斜率的直线进行拟合，后者用于校正荧光基团的光漂白效应。

通过该拟合得到的 kops 是 mant-ADP 解离的速率常数，单位为每秒。mant 标记的核苷酸结合或解离时信号变化的幅度取决于特定的驱动蛋白。因此，首先进行平衡状态测量以确认荧光强度变化的存在及其幅度是十分必要的。

此处展示了 TP 和 DP 在溶液中以及与驱动蛋白 M CAC 形成复合物时的荧光光谱。该图描述了将 man ATP 与无核苷酸的驱动蛋白混合后发生的反应。当 man ATP 结合到 M CAC 时，荧光强度增加，此处展示了荧光强度变化的速率常数随 man 浓度的变化拟合结果。

此处所示的 ATP 浓度与线性函数的关系可用于解卷积影响 kops 的速率常数，从而获得 ATP 结合与解离的速率常数。该图展示了如图所示 ADP 从 MCEC 解离时观察到的荧光强度降低。通过将该数据拟合至指数函数，可确定荧光标记的 ADP 从驱动蛋白解离的速率常数。一旦掌握，每种方案均可在三小时内完成。

尽管该方法可用于研究驱动蛋白，也可应用于其他核苷酸结合蛋白，如肌球蛋白和G蛋白。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用荧光标记的核苷酸和停流装置来测量驱动蛋白的核苷酸结合与解离动力学。