使用改良基因枪在脑组织切片中实现区域选择性基因枪轰击

本实验的目的是利用基因枪快速高效地转染或标记组织切片的不同区域。首先制备具有活性的脑组织或其他组织的器官型切片，然后制备用于生物递送的DNA或包被金颗粒。

接下来，将器官型脑片置于稳定的基因枪支架下，将包被的微粒轰击入组织，以实现游离基因转化或标记。最后一步是观察或分析外源基因在分离区域中所产生效应。最终，该方法可使研究人员精确地将不同外源基因转染至器官切片的特定区域。

与现有方法相比，该方法的主要优势在于生物递送技术能够转染终末分化的细胞，同时将作用范围限制在较小的直径内。该方法有助于理解关键的神经生物学问题，例如解析单个基因在特定区域的功能贡献。开始此操作时，将新鲜脑组织放入一个小的接收模具中。

用已预热至略高于室温的 ARO 溶液覆盖，然后将模具置于冰上，迅速冷却至 4°C。待 ARO 凝固后。

5到10分钟后，将包埋好的脑组织从模具中取出。随后将其粘附到切片机平台上，并将该平台转移至含有无菌冰冻PBS的振动切片机腔室中。

切片后，将切片轻轻放置在六孔板中的细胞培养插件上，插件外侧加入培养基。在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。在此步骤中，使用直径为40纳米的金颗粒制备纳米弹丸：首先将50微升0.05摩尔的亚精胺和10微升浓度为1毫克/毫升的DNA加入10毫克金颗粒中。

然后将氯化钙加入溶液混合物中，以促进DNA分子与金纳米颗粒的结合。随后用注射器将溶液吸入导管中。将导管置于导管制备站内。

让金颗粒沉降，然后用注射器抽吸去除上清液。旋转管壁，使金颗粒均匀分布。

随后在恒定的氮气流下干燥颗粒，氮气流速为每分钟五升。为制备DNA子弹，使用管子切割器将管子切成一厘米长的小段。然后立即将其插入基因枪的弹匣中，或在无菌超净工作台中将其干燥保存于4摄氏度，待使用时再将含有DNA包被金颗粒的弹匣装入弹匣架。

然后将载样台装入基因枪中。使用无菌镊子将改造过的基因枪枪管连接到载样台上。将含有组织型脑片的滤膜插入无菌塑料培养皿中。

移除组织切片中的培养基。接着，使用装置将气体压力设定为 50 PSI。将基因枪置于切片目标区域上方 10 毫米处，以进行基因递送。

然后小心对准枪管中心，将包被的微粒射入组织。生物转染后，用 PBS 轻轻洗涤切片两次。随后将切片置于含 4% 冰冷 PFA 的 PBS 中孵育 20 分钟，以进行固定。

随后，用 PBS 清洗切片两次。再次使用解剖刀小心地将膜从插入物上切下，注意不要扰动切片。然后用镊子将膜支撑物放置在显微镜载玻片上，使器官型切片自然平放于其上。

接下来，在切片上加入一滴封片剂。将盖玻片轻轻放置，避免施加任何压力，使其直接接触组织。随后，用一层薄薄的指甲油固定盖玻片。

该图显示了将编码荧光蛋白的DNA通过生物递送方式导入六周龄小鼠脑片组织切片的过程。如图所示，在小脑的比基尼层与分子层交界处发现的一个比基尼神经元，其具有显著的树突结构，在使用P-E-G-F-P-N1进行短暂生物转染后呈现出明显的标记。此处为带有树突棘的树突高倍放大图像，而此处则为海马CA1区发现的一个锥体细胞。

在完成PDS Red FP包被的金纳米颗粒的生物递送后，一旦掌握该技术，可在该操作后的三到四天内仅用数小时即可完成实验。其他方法（如共聚焦显微镜）可用于回答进一步的问题，例如特定神经元如何与邻近区域建立连接。