Name: 区域选择性基因枪瞄准的器官脑片用改进的基因枪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习使用改进的基因枪对器官型脑片进行区域选择性基因转染的方法。该技术利用DNA包被的金颗粒实现精准递送，可在保持组织体内特性的同时高效标记和操控终末分化细胞，为神经生物学研究提供有力工具。

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作者感谢MRC-LMB车间制造了改进型基因枪枪管。我们还要感谢多伦多大学的David R. Hampson博士提供设备和资源支持。

动物及动物组织的使用应严格遵守当地法规和伦理委员会的批准。本研究中所获取的所有组织均遵循MRC-LMB的动物实验指南。
1. 材料准备 &amp;#38; 培养基
<ol>
	<li>所有溶液均使用Millipore水配制，仅使用分析纯级试剂。所有试剂在室温下配制和储存（另有说明者除外）。</li>
	<li>配制500 ml HEPES缓冲盐水（10 mM HEPES，120 mM NaCl，pH 7.2）。用0.2 µm无菌滤器过滤，4 °C保存。</li>
	<li>配制500 ml磷酸盐缓冲液（PBS；10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4，137 mM NaCl，2.7 mM KCl，pH 7.4）。通过高压灭菌进行灭菌。</li>
	<li>通过向DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中添加25 mM HEPES、10%胎牛血清、30 mM葡萄糖、1:100 N2添加剂、青霉素-链霉素（1,100 U/ml）来配制神经元培养基；调节pH至7.2。用0.2 µm无菌滤器过滤，4 °C保存。</li>
	<li>用20 mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶于1 ml 100%乙醇中配制PVP储备液。将此溶液分装为每份1 ml，冷冻并储存在-20 °C。工作液浓度为0.05 mg/ml，因此每4 ml 100%乙醇中加入10 µl PVP储备液。</li>
	<li>用Millipore水配制0.05 M亚精胺（spermidine）储备液；调节pH至7.2。</li>
	<li>在DMEM中配制2%琼脂糖溶液（在灭菌螺口瓶中将2 g电泳级琼脂糖溶于100 ml DMEM中）。微波加热至琼脂糖完全溶解。必要时可在4 °C冰箱中保存数周。</li>
</ol>
2. 器官型切片的制备
<ol>
	<li>通过 CO2 窒息法处死所需年龄的 C57 Black 6 小鼠，随后进行断头。从枕骨大孔开始沿颅骨侧面剪开至嗅球处，取出脑组织。从后方轻轻抬起颅骨以暴露脑组织。</li>
	<li>在嗅球与前额皮层之间以及小脑前方进行切割。轻轻抬起脑的前部并剪断视神经。最后取出完整脑组织，置于盛有冰上预冷的 HEPES 缓冲盐溶液的培养皿中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用精细镊子剥离软脑膜，并小心清除脑组织周围的血管和脑膜。</li>
	<li>将新鲜脑组织放入小型模具中，倒入略高于室温的琼脂糖溶液覆盖脑组织，然后迅速将模具置于冰上冷却至 4 °C。 
	注意：应尽快处理脑片，以避免组织活性下降。</li>
	<li>待琼脂糖凝固（5–10 分钟）后，将包埋好的脑组织从模具中取出（必要时修整），并将其粘附于振动切片机平台上。将平台放入含有无菌冰上预冷 PBS 的振动切片机腔室中。使用前用 70% 乙醇对切片机腔室进行消毒，以减少后续污染。</li>
	<li>使用定制或同等商用的振动切片机进行脑组织切片。该设备的设计理念是产生相对于刀刃方向的大振幅、高频率水平运动，同时最大限度减少垂直振动。</li>
	<li>设置振荡频率为 90 Hz，振幅为 1.5–2.0 mm，切割刀片与水平面成 15° 角；调节承载琼脂糖包埋脑组织的固定块以 1.7 mm/min 的速度向刀片移动。将切得的脑片（厚 150 µm）收集至含有冰上预冷培养基（DMEM 含青霉素/链霉素 + 10% FCS）的容器中。有关脑片切割与操作的视频，请参见 Arsenault 和 O'Brien13 的补充视频。</li>
	<li>将脑片轻柔地转移至细胞培养插入式滤膜（孔径 0.4 µm，直径 30 mm）中，置于 6 孔板内，使培养基位于滤膜外侧，并在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育。 
	注意：为保持组织良好活性，在转移和操作脑片时务必格外轻柔。过多液体将阻碍脑片贴附于滤膜表面。若发生此情况，应吸除多余液体或重新接种。</li>
	<li>尽管脑片可培养数周，但为获得最佳转染效率，应在接种后不超过 4 天内进行转染操作。 
	注意：为防止长期培养过程中胶质细胞过度生长，可使用 AraC 或无血清培养基2。</li>
</ol>
3. DNA包被微粒的制备 &amp;#38; 纳米级弹体
<ol>
	<li>使用直径为 40 nm 的金颗粒制备纳米微弹。简而言之，将 50 µl 浓度为 0.05 M 的亚精胺和 10 µl 浓度为 1 mg/ml 的 DNA（pEYFP-N1）加入到 10 mg 金颗粒中。
	<ol>
		<li>在制备 DNA-金微粒的过程中，需将氯化钙和亚精胺加入溶液混合物中，以促进 DNA 分子与金纳米颗粒的结合。 
		注意：每毫克金载体所用的 DNA 量（DLR）应在 1 至 5 µg DNA/1 mg 金之间。此外，每个弹药筒中用于轰击的金载体颗粒量（MLQ）应介于 0.1 至 0.5 mg 金之间。DLR 和 MLQ 的具体数值应根据研究者所使用的特定实验体系、微粒类型及基因枪型号进行尝试和优化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在缓慢分次（每次 10–15 µl）加入 50 µl 浓度为 1 M 的 CaCl2 的同时，使用涡旋振荡器混合。间歇性涡旋振荡 5 分钟后，在 1,000 × g 条件下离心 30 秒，弃去上清液。将金颗粒沉淀重悬于 3.5 ml 浓度为 0.075 M 的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液中。</li>
	<li>使用注射器将上述悬浮液吸入管路（内径为 2.36 mm）。将管路置于管路制备站中，静置使金颗粒沉降，再用注射器抽吸去除上清液。旋转管路以使金颗粒均匀分布，随后在每分钟 5 升的恒定氮气流下干燥。</li>
	<li>为制备 DNA 微弹，使用管路切割器将管路切成 1 cm 长的小段。可立即插入基因枪弹药筒中使用，或在干燥条件下（4 °C）保存备用。</li>
</ol>
4. 器官型脑片的基因枪转染
<ol>
	<li>在无菌超净工作台内执行以下步骤。</li>
	<li>将9 V电池和空的基因枪弹夹架插入Helios基因枪中。</li>
	<li>将基因枪通过氦气管连接至氦气瓶。以50 psi压力发射2-3次空载（空位）以使氦气管和枪内储气罐增压。</li>
	<li>将含有DNA包被金颗粒的 cartridge 装入 cartridge 载体中，并将载体装入基因枪。</li>
	<li>拧下基因枪的间隔器，并将改装后的基因枪枪管连接到基因枪上。</li>
	<li>使用无菌镊子，将含有组织型切片的滤膜插入物放入无菌塑料培养皿中。</li>
	<li>移除器官型脑片中的培养基。</li>
	<li>将气体压力设定为 50 psi。 
	注意：必须佩戴眼部防护装备，建议佩戴听力保护装置。</li>
	<li>使用安装支架将基因枪固定在10 mm的适当距离处。仔细对准枪管中心，使其正对目标遗传物质递送区域。</li>
	<li>射流完成后，将插入物放回培养皿中，并加入新鲜培养基，然后置于正常生长条件下继续培养。 即，37 °C，5% CO2 培养箱</li>
	<li>完成后，关闭氦气罐，释放基因枪中的压力，并将基因枪与氦气罐分离。</li>
	<li>取下卡匣架，丢弃卡匣，并清洁基因枪。</li>
	<li>使用倒置显微镜观察切片，检查组织形态及穿透是否成功。若使用微粒，需确保金颗粒均匀分散；切片上不应出现金颗粒密集区域。由于纳米颗粒尺寸较小，常规显微技术无法将其作为单个单位观察到。</li>
	<li>在适当的时间间隔（通常为1至2天）后，用4%多聚甲醛（PFA）固定切片，以供显微镜观察。 
	注意：并非总是需要使用PFA固定。进行活细胞成像时，请省略此步骤。</li>
</ol>
5. 脑切片的固定与可视化
<ol>
	<li>基因枪转染后，用 PBS 清洗切片两次，每次 2 分钟。</li>
	<li>将切片在新配制的、冰上预冷的含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液中孵育 20 分钟，进行固定。</li>
	<li>用 PBS 再次清洗切片两次，每次 2 分钟。</li>
	<li>用解剖刀小心地沿膜支撑物边缘切割，注意不要扰动固定在膜上的切片。使用镊子将每一片膜支撑物/切片转移至载玻片上，使组织片自然贴附在载玻片表面的膜上。</li>
	<li>在切片上滴加一滴封片剂，然后轻轻加盖盖玻片，避免施加压力或直接接触组织片。</li>
	<li>用一层薄薄的指甲油密封盖玻片边缘。</li>
	<li>在合适的显微镜下观察切片。</li>
</ol>
6. 共聚焦显微镜的应用
<ol>
	<li>使用配备60倍/1.4数值孔径（NA）油浸物镜的直立式激光共聚焦显微镜观察切片。 
	注：共聚焦显微镜最关键的特征是其针孔尺寸（设定为1 AU），该尺寸能够分离并采集特定焦平面的信号，从而消除荧光样品中常见的离焦“晕影”。这些晕影通常会遮蔽精细结构，在非共聚焦显微镜中无法检测到。</li>
	<li>将氩离子激光器的激发波长设为488 nm，并优化发射光的收集范围至500–520 nm波段。通常以1,024 × 1,024像素采集图像，并以0.5 μm间隔进行z轴断层扫描，以覆盖所分析每个神经细胞的完整宽度。
	<ol>
		<li>为观察细胞核形态，可用DAPI对这些细胞进行复染（激发波长设为405 nm，发射光收集范围为420–440 nm）。最后，为检测红色荧光，将激光激发波长设为561 nm，发射光收集范围设为565–620 nm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通常采用4倍扫描缩放，覆盖约57.6 μm2的区域；图像尺寸约为1,024 × 1,024像素。以0.5 μm间隔采集z轴断层图像堆栈，并合并5–8帧进行投影重建。</li>
</ol>

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</ol>

John A. O'Brien 博士拥有改进型基因枪枪管的专利。美国专利号 10/380,452 和欧洲专利号 01974517.3。

本方案描述了利用增强型基因枪将染料和遗传物质导入成年动物器官型脑片的方法。由于可使用的染料种类多样，且能够递送多种基因，该方法具有多功能性，适用于回答广泛的生物学问题。本研究所采用的区域选择性递送方法——在此例中针对特定脑区——为实验开辟了新的途径，因为在具有生物学相关性的组织架构内，对局部区域进行异源基因调控在此前并不容易实现。我们先前已证实，该方法可用于成年动物的器官型脑片，在此类脑片中成熟的突触已完全形成，且该方法表现出良好的细胞存活率以及持续数周的异源基因表达13。随着哺乳动物脑组织及其他组织培养条件的不断改进，区域选择性基因调控技术将在多种生物化学分析中发挥日益重要的作用。
正如我们在此处以及此前其他研究者所强调的那样24，许多不同因素可能显著影响基因枪介导递送的准确性和可靠性。首先，与染料或DNA结合的金微粒的制备必须充分优化，以防止颗粒聚集，并促进弹药舱中载物的有效喷射。在DNA-金微粒溶液中添加氯化钙和亚精胺有助于DNA分子与金纳米颗粒的结合。此前已有研究证实，在减压条件下纳米颗粒穿透细胞的能力17。其次，基因枪必须尽可能稳固地安装，并保持正确的角度与距离。一个可靠的气压表对于实验的可重复性、组织完整性的维持以及金微粒向靶标组织的准确加速至关重要。事实上，设备的距离、方向和稳定性同样是实现区域选择性递送精准定位的关键因素。由于这些脑部结构非常微小，发射角度的微小偏差都可能导致整个操作的可靠性显著下降。最后，活体外脑片组织的制备与维持数十年来一直存在诸多困难，但目前已有大量可靠且适用于不同动物种类、脑区、年龄阶段及共培养体系的实验方案可供参考2,4,25,26。在将组织用于基因枪实验之前，应先对这些方案进行用户个性化优化。这将更有利于使用者客观评估基因枪微粒本身的影响以及外源基因在其培养体系中的效应。为此，使用荧光报告基因（如EYFP和EGFP）不仅可帮助新用户验证靶向递送的精确性，还可通过长期监测外源基因的表达来评估细胞活力13。以下三段将重点说明本实验方案中实现可靠与可重复结果的关键步骤。
为了实现高效的转染，DNA 浓度必须适当。浓度过低会降低转染效率，而浓度过高则可能导致纳米颗粒发生聚集。金颗粒的聚集会显著降低转染效率，造成分布不均，并可能导致细胞毒性增强和氧化应激增加。涂层效率问题很可能源于亚精胺溶液的过期（应每 2 至 3 个月更换一次）。为了获得足够的基因枪轰击扩散效果，标记必须均匀。金纳米颗粒/DNA 悬液标记不均一可能与聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液有关，该溶液也应每 2 至 3 个月更换一次。金纳米颗粒的包被情况可通过琼脂糖凝胶电泳观察，表现为分子量更高的条带27。
所研究的每种生物系统以及所使用的不同仪器可能都需要对气体压力进行微调，以达到最佳的转染效率和基因枪轰击扩散效果。关键参数是氦气脉冲的压力，该压力需足以将微米或纳米载体从塑料 cartridge 上剥离，并推动其进入组织。过高的气体压力会影响细胞存活率，因为它会在靶组织上产生冲击波，导致组织从基质上破裂或脱落17。正确对准基因枪枪管，并确保装置与组织表面完全垂直，对于实现精确的基因枪递送至关重要。所选区域应准确置于枪管正中心，并距离外开口恰好10 mm。这将使金颗粒在轰击中心周围形成直径约3 mm的递送区域。每次使用后，应使用70%乙醇清洁基因枪枪管。为防止大颗粒聚集体损伤组织，枪管内还装有尼龙筛网，应定期更换以保持最佳性能。更换筛网时，先旋下端盖，然后将新的尼龙筛网置于端盖与O形圈之间，再重新拧紧。
转染后至少1至2天，应在震中周围观察到荧光标记的细胞。标记缺失或错位可能是由于基因枪安装准备不足或不稳定所致。使用共聚焦显微镜观察细胞时，结果受多种因素影响：激发/发射光波长、针孔大小、物镜的数值孔径（NA）、光路中各组分的折射率、组织深度以及仪器的校准情况。这些因素应针对所研究的每个系统进行优化。
本方法的成功得益于基因枪技术的最新进展。本研究中使用的基因枪枪管经过改良，旨在降低所需压力，并将基因枪轰击的散射模式集中到更局限且特定的区域17,19。其他枪管改进尝试也致力于限制基因枪轰击的扩散范围并降低输出压力28，但由 O'Brien 博士专门设计的这款基因枪枪管是一种可安装于标准 Helios 基因枪的单一组件。此外，我们采用亚微米级金颗粒，以减少此前发现的微米级颗粒所导致的细胞损伤，避免外源基因持续表达的丧失。这些对基因枪轰击技术的改进显著提高了该方法的整体可行性与可重复性13。在脑片制备方面，其他改进措施，如对切片过程进行深入的问题排查、使用 DMEM-琼脂糖基质保护脑组织，以及此前报道的多种器官型脑片制备技术的进步13，使我们能够探索使用已形成成熟突触网络的成年脑片。
在本研究中，我们主要使用染料和荧光异源基因来可视化细胞形态，以此作为转染效率的读出指标，并用于观察小鼠脑组织中神经元的形态学特征。在特定半径范围内，随机递送所产生的信噪比使我们能够在天然环境中完全分离出单个细胞的树突区域。由于目前已有大量研究致力于探索这些形态学特征、绘制“连接组学”图谱或对单个细胞进行标记以用于各种分析，因此该方法可轻松地与现有方案（如电生理学和神经突测量）相结合29,30。显然，通过组合使用多种荧光异源基因，可更有效地界定单个细胞，因为荧光蛋白的随机分布及其组合将决定各个细胞的颜色31,32。在异源基因外显子上游使用细胞特异性启动子（如突触素启动子和胶质纤维酸性蛋白启动子）也可将基因表达限制在特定亚群中33。事实上，利用金纳米颗粒通过相同的方法，也可实现多种遗传物质的区域选择性递送。因此，可采用传统方法（如组织解剖并取该区域进行蛋白质印迹免疫检测）来分析整个转染区域，以研究异源基因的局部效应。
器官型脑片技术的改进将有助于更广泛地利用脑组织进行长期实验，同时也可促进其他组织及共培养体系的应用，并有助于转染操作的实施。已有研究报道，脂质体和聚合物转染方法会影响膜稳态、内吞作用以及蛋白质通透性34，且通常对终末分化的神经元转染效率极低。细胞特异性递送载体仅适用于表达特定细胞表面受体以介导内吞的细胞类型；尽管该方法具有高度选择性，但往往缺乏靶向性的区域特异性35。而病毒载体通常生产难度大、成本高，需遵循严格的监管要求，且偶有安全风险的报道。相比之下，基因枪递送技术在活体组织中对神经元及其他细胞类型实现区域特异性转染方面具有无可比拟的优势。由于金颗粒无毒性，生物弹道技术的进一步发展有望为生物医学应用开辟新途径，例如经皮药物递送、无创的体内基因递送以及局部非病毒基因治疗等。

最初，基因枪技术（biolistic，是“生物弹道学”biological ballistics的简写）是为通过微粒介导将基因转入植物细胞而建立的1。这种物理转化方法通过将微米或纳米级颗粒加速至高速，以穿透细胞膜等不可渗透的物理屏障，从而递送DNA或染料等物质。由于该方法不依赖于特定的配体-受体相互作用或细胞表面膜的生化特性，微粒介导的基因转移可广泛应用于多种生物系统，例如脑组织器官型切片。
使用器官型切片相较于其他方法具有优势 体外 平台，因为它们保留了许多与解剖学和生物化学相关的特性 体内 生物学2-4切片在很大程度上保留了其来源区域的局部结构特征，并维持了突触的神经化学活性与连接性。随着可用于测量和监测大脑神经生物学行为的生物技术操作手段日益增多，脑切片在基础研究及药物研发中的应用也相应增加。 体内 例如上下文3,5-7使用基于器官型脑片的检测系统的主要优势在于其能够提供简便的实验控制，并允许对细胞外环境进行精确操控。
已有多种脑区成功建立了有成效的器官型脑片培养系统，包括但不限于大脑皮层、脊髓和小脑8-10。此外，已有多种共培养体系被建立，可用于评估远端脑区之间以及神经元与病理细胞之间的细胞间通讯11,12。目前已有大量成熟的器官型脑片培养方案，能够长期维持脑片的存活能力，其中许多近期研究采用了膜-界面培养法及其多种改良方法13。该方法的基本原理是将脑片置于多孔膜上，使其处于培养液与培养箱湿润空气之间的界面位置，从而通过毛细作用使培养液为脑片提供充足的营养。通常，这些脑片取自出生后早期的动物（3至9日龄；P3–9）。然而，这些早期脑片组织具有较高的细胞可塑性，并对机械应力具有内在的耐受性，有利于获得存活的培养物，但成熟突触和神经解剖回路在体内直到2至3周龄才完全发育in vivo14。例如，先前的研究观察到，尽管从出生0至1天（P0–1）的新生动物获取的海马脑片在制备后具有很高的存活率，但会逐渐丧失某些形态学特征。事实上，这些脑片被证明不适合长期培养，提示未成熟细胞相较于来自较年长动物的器官型培养物更容易发生去分化15,16。因此，本方法已针对成年动物的器官型脑片进行了优化，此时脑组织的成熟度和结构发育已达到终末阶段13,17-21。尽管如此，该方法同样适用于新生期和幼年期的器官型脑片。
一旦制备出具有活性的器官型脑片，即可将含有脑片的整个培养板转移至基因枪装置，进行区域选择性递送与转染。基因枪的正确安装（如文中所述） 图1），方向旋转90°，距离切片正上方10 mm（从孔径至组织），可实现40 nm金颗粒包被的载体快速弹道递送。此类载体包括染料、荧光DNA载体以及任何目的基因，均可轻松高效地递送至具有活性的脑片中。因此，本方法描述了将包被载体的金纳米颗粒区域选择性递送至活性器官型脑片所需的实验方案。基因枪枪管及最佳安装方式如图所示 图1有关改进的巴雷尔和纳米颗粒弹道学的更多信息，请参见 O'Brien， 等17.
后续优化步骤也需用户注意，以调整诸如每个靶区域递送的金颗粒适量（定义为微载体加载量，MLQ）以及每毫克金颗粒所负载的DNA量（定义为DNA加载比率，DLR）等条件。在将DNA沉淀至金颗粒并将其装入构成基因枪“弹药”的特氟龙（Tefzel）管之前，必须计算每次转染所需的DNA和金颗粒的用量，该用量可能因组织类型和实验条件略有差异（金与DNA的比例应维持在1 mg金对应1 µg DNA至1:5之间）。正确配比MLQ与DLR至关重要，否则DNA包被的金颗粒可能发生黏附，形成超出预期的团聚，从而降低基因枪轰击分布的整体均一性，并可能增加组织损伤和细胞毒性。
该方法展示了基因枪递送技术的最新改进，已通过测试并证实适用于新生期、幼年期及成年期的脑组织器官型切片。此外，通过利用基因枪枪管减小后的弹道扩散范围，使用者现在能够选择性地转染脑内的特定区域。经过适当的孵育时间后，荧光蛋白的表达在24至48小时达到峰值，可通过落射荧光显微镜和共聚焦显微镜进行观察。这些荧光蛋白可用于在生物学相关结构中对单个细胞进行形态学分析和定位。然而，也可通过适用于此类样本的其他任何检测方法，监测外源基因对器官型切片的区域选择性调控作用。局部基因递送的可能操作策略见图2。

<table><tbody><tr><td>Helios 基因枪系统</td><td>Bio Rad</td><td>165-2431</td><td>基因枪和管材制备站</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>83264-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S7907-100G</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791-100G</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 无菌滤器</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>用于过滤培养基</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma</td><td>p4333</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td>Sigma</td><td>856568-100G</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>277649-100ML</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Bio Rad</td><td>161-3100EDU</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Laica</td><td>VT1200</td><td>我们使用了定制设计</td></tr><tr><td>基因枪支架</td><td></td><td></td><td>多伦多大学自行研制</td></tr><tr><td>加湿细胞培养孵育箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>金纳米颗粒</td><td>cytodiagnostics</td><td>G-40-20</td><td></td></tr><tr><td>pEYFP-N1</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>管材切割器</td><td>Bio Rad</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>Tefzel 管材</td><td>Bio Rad</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>枪管</td><td></td><td></td><td>由 LMB 定制制造</td></tr><tr><td>细胞培养插件</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>76240 Fluka</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td></td><td></td><td>为方便操作</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td></td><td></td><td>根据用户需求配置</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR</td><td>2588-CA48323-185</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>2448-CA48366-067-1</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1400&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

使用改良基因枪在脑组织切片中实现区域选择性基因枪轰击

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

DNA转染对生物科学领域具有重要价值，随着类器官型脑切片制备技术的近期进展，可在保留脑组织诸多原有特征的同时，便捷地研究各种异源基因的作用。 体内 生物学。近年来，人们对终末分化的神经元转染兴趣日益增加，而传统的转染方法在应用于此类细胞时常常面临诸多困难，例如转染效率低和细胞活力显著下降。基因枪转染技术可克服其中许多难题，然而该技术直到最近才经过改良，使其适用于哺乳动物组织。
对加速室进行的新改造提高了基因枪的射击精度，增加了其穿透深度，同时允许在不降低转染效率的前提下使用较低的气体压力（50 psi），并可实现粒子在3 mm范围内的聚焦性区域选择性分布。此外，该技术比繁琐的显微注射操作更简便、更快捷。纳米粒子轰击技术可实现瞬时和稳定的表达，其中附加体表达可在24小时内检测到，且细胞存活率优于或至少相当于传统方法。然而，该技术具有一个关键优势：它能够将转染限制在单一限定的半径范围内，从而让用户在解剖学上分离出异源基因的作用效应。本文中，我们提供了一套详细的实验方案，用于制备具有活性的成年动物组织切片，并利用改进后的基因枪对其进行区域选择性转染。

可使用乳酸脱氢酶活性、碘化丙啶标记以及dUTP染色来监测器官型脑片的存活率，如先前报道所述13,22。显然，脑片的存活率和完整性对于递送的遗传物质实现长期稳定表达至关重要。在通过基因枪将遗传物质递送至器官型脑片后，采用共聚焦显微镜监测荧光异源基因的表达情况。使用改良型发射管时基因枪转染区域的集中程度如图3A所示。图3B展示了利用DNA包被的金纳米颗粒转染的海马区代表性图像。图4展示了转染后的成年小鼠器官型脑片的代表性图像。如图4A所示，在小脑浦肯野层与分子层交界处发现的一个具有显著树突结构的浦肯野神经元，在使用pEGFP-N1进行瞬时基因枪转染后表现出明显的标记信号。图4B展示了这些树突的高倍放大图像，可观察到树突棘结构。图4C展示了通过递送pDSredFP包被的金纳米颗粒后，在海马CA1区发现的一个锥体细胞。
染料可替代荧光编码的DNA货物，以类似方式用于可视化器官型脑片中的形态学特征。DiO可标记质膜，能更快速地勾画出单个细胞的形态，或与包被DNA的基因枪法共同使用，以确认同一区域的区域选择性。如图5A所示，海马区经DiO染色的神经元显示出具有大量树突棘的长树突。箭头指示轴突，其可通过突触小结的存在与其它神经突起上的树突棘相区分。图5B展示了CA1区的另一个示例，其中使用DAPI复染细胞核，以突出显示大量海马投射纤维。图5C展示了此类平行排列树突的高倍放大图像，可见其上具有大量树突棘。
显然，这些图像展示了细胞标记后的形态学特征。该方法也可用于递送任意数量的外源基因，这些基因可包被在金纳米颗粒上。为了直观确认转染是否成功，可构建单一质粒，使其在同一载体上共表达目的基因和荧光报告蛋白。
<img alt="超声波钻孔装置；示意图与实验；矿物样品处理；精密钻孔。" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 基因枪枪管及固定装置。 (A) 由MRC-LMB的O'Brien博士开发的改进型枪管，其具有受限的生物弹道扩散，可通过降低粒子加速所需压力来最小化组织损伤。(B) 由多伦多大学的Henderson博士和Andras Nagy博士开发的优化型基因枪固定装置的侧视图。该装置可将基因枪精确固定在与组织切片垂直90˚的位置，同时允许使用者准确控制生物弹道递送的距离。为达到最佳生物弹道条件，枪管开口应置于组织切片上方10 mm处，正对目标区域。(C) 基因枪固定装置的后视图。待转染的目标区域需准确放置在枪管开口正下方。可通过染料标记（二醇弹道法）或荧光蛋白转染（生物弹道法）来确认靶向效果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑组织透明化过程、脑组织在水凝胶中的成像装置、横截面图分析。" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 器官型脑片制备与区域特异性靶向。 (A) 已包埋于DMEM中的成年小鼠脑组织，准备进行切片。 (B) 将模具粘附至振动切片机的载物台上，刀片就位，准备切割脑片。 (C) 通过基因枪递送法实现冠状面器官型脑片中区域特异性异源基因表达的策略。图像根据Allen脑图谱解剖参考图谱23提供的图片制备。左图展示了两个被靶向的不同脑区示例：(1) 将基因表达限制在左侧半球的皮层区域；(2) 将异源基因表达限制在下丘脑区域。中图显示，可在同一器官型脑片中分别独立表达两种异源基因（3和4），并比较两个半球的海马区，从而基本消除了使用不同切片可能带来的偏差，或提供了研究这些基因远距离相互作用的可能性。右图展示了转基因递送的潜在重叠情况：在精确的皮层区域表达第一个基因（5），同时在另一个不同但部分重叠的皮层区域表达另一个基因（6）。这使得能够在同一脑片中分别分析每个异源基因遗传调控的效应，也可研究二者联合作用的效应。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Neural differentiation microscopy; panel A: cell stages, panel B: immunofluorescence, neural network." src="/files/ftp_upload/52148/52148fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 滤纸上观察到的基因枪散射模式及低倍镜图像。 （A） 改进的基因枪发射到滤纸上以确定金颗粒的分布情况。左侧显示改进型枪管的分布，右侧显示普通枪管的分布。黑色标尺：1 cm。图片来自 O'Brien， 等17. （B） 低倍镜图像显示6周龄小鼠海马区3 mm基因枪轰击范围内随机的转染模式。白色标尺： 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="神经元形态，显微图像中标记的树突，神经元结构的可视化。" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 将编码荧光蛋白的 DNA 通过基因枪递送至 6 周龄小鼠的脑片组织培养物中。 (A) 小脑组织培养切片中经 pEGFP-N1 包被的金颗粒转染的浦肯野细胞的倒置共聚焦图像。图像以 40 倍放大倍数采集。黑色标尺：30 µm。 (B) 显示另一浦肯野细胞树突区域在 60 倍放大倍数下的图像，以突出树突棘结构。黑色标尺：5 µm。 (C) 显示从海马区获取的固定切片的共聚焦图像，图中为 60 倍放大倍数下的四个经 DSredFP 转染的锥体细胞。黑色标尺：10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="神经树突结构，荧光显微镜图像，突出显示神经元连接和分支。" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 膜标记荧光染料通过基因枪法递送至脑片组织切片。 (A) 显示在20倍放大下用DiO标记的海马神经元的活体成像。树突棘清晰可见，轴突可通过缺乏树突棘以及存在由白色箭头指示的突触小结来识别。白色标尺：30 µm。(B) 使用DiO对海马区进行明显染色，并用DAPI复染。白色标尺：30 µm。(C) 海马CA1区树突棘的高倍放大图像（60倍）。白色标尺：5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

近年来，脑组织切片培养技术的进步使其在生物技术应用中得以广泛利用。脑组织切片能够保持局部结构特征 体内 生物学，包括功能性突触连接。本文介绍一种区域选择性的基因枪递送方法，用于标记并进行遗传学操作这些脑片。

DNA转染对生物科学领域具有重要价值，随着近期器官型脑切片制备技术的进步，各种……

本实验的目的是利用基因枪快速高效地转染或标记组织切片的不同区域。首先制备具有活性的脑组织或其他组织的器官型切片，然后制备用于生物递送的DNA或包被金颗粒。接下来，将器官型脑片置于稳定的基因枪支架下，将包被的微粒轰击入组织，以实现游离基因转化或标记。最后一步是观察或分析外源基因在分离区域中所产生效应。最终，该方法可使研究人员精确地将不同外源基因转染至器官切片的特定区域。与现有方法相比，该方法的主要优势在于生物递送技术能够转染终末分化的细胞，同时将作用范围限制在较小的直径内。该方法有助于理解关键的神经生物学问题，例如解析单个基因在特定区域的功能贡献。开始此操作时，将新鲜脑组织放入一个小的接收模具中。用已预热至略高于室温的 ARO 溶液覆盖，然后将模具置于冰上，迅速冷却至 4°C。待 ARO 凝固后。5到10分钟后，将包埋好的脑组织从模具中取出。随后将其粘附到切片机平台上，并将该平台转移至含有无菌冰冻PBS的振动切片机腔室中。切片后，将切片轻轻放置在六孔板中的细胞培养插件上，插件外侧加入培养基。在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。在此步骤中，使用直径为40纳米的金颗粒制备纳米弹丸：首先将50微升0.05摩尔的亚精胺和10微升浓度为1毫克/毫升的DNA加入10毫克金颗粒中。然后将氯化钙加入溶液混合物中，以促进DNA分子与金纳米颗粒的结合。随后用注射器将溶液吸入导管中。将导管置于导管制备站内。让金颗粒沉降，然后用注射器抽吸去除上清液。旋转管壁，使金颗粒均匀分布。随后在恒定的氮气流下干燥颗粒，氮气流速为每分钟五升。为制备DNA子弹，使用管子切割器将管子切成一厘米长的小段。然后立即将其插入基因枪的弹匣中，或在无菌超净工作台中将其干燥保存于4摄氏度，待使用时再将含有DNA包被金颗粒的弹匣装入弹匣架。然后将载样台装入基因枪中。使用无菌镊子将改造过的基因枪枪管连接到载样台上。将含有组织型脑片的滤膜插入无菌塑料培养皿中。移除组织切片中的培养基。接着，使用装置将气体压力设定为 50 PSI。将基因枪置于切片目标区域上方 10 毫米处，以进行基因递送。然后小心对准枪管中心，将包被的微粒射入组织。生物转染后，用 PBS 轻轻洗涤切片两次。随后将切片置于含 4% 冰冷 PFA 的 PBS 中孵育 20 分钟，以进行固定。随后，用 PBS 清洗切片两次。再次使用解剖刀小心地将膜从插入物上切下，注意不要扰动切片。然后用镊子将膜支撑物放置在显微镜载玻片上，使器官型切片自然平放于其上。接下来，在切片上加入一滴封片剂。将盖玻片轻轻放置，避免施加任何压力，使其直接接触组织。随后，用一层薄薄的指甲油固定盖玻片。该图显示了将编码荧光蛋白的DNA通过生物递送方式导入六周龄小鼠脑片组织切片的过程。如图所示，在小脑的比基尼层与分子层交界处发现的一个比基尼神经元，其具有显著的树突结构，在使用P-E-G-F-P-N1进行短暂生物转染后呈现出明显的标记。此处为带有树突棘的树突高倍放大图像，而此处则为海马CA1区发现的一个锥体细胞。在完成PDS Red FP包被的金纳米颗粒的生物递送后，一旦掌握该技术，可在该操作后的三到四天内仅用数小时即可完成实验。其他方法（如共聚焦显微镜）可用于回答进一步的问题，例如特定神经元如何与邻近区域建立连接。

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