Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

该程序的总体目标是为研究人员提供一个自动化平台，该平台能够仅对 10， 000 个细胞进行染色质免疫沉淀实验。这是通过首先为染色质免疫沉淀制备高质量的剪切染色质来实现的。在第二步中，创建自动染色质免疫沉淀实验，并使用免疫沉淀的 DNA 运行自动文库。

通过定量 PCR 和下一代测序分析免疫沉淀的 DNA。最终，通过将原始 10， 000 个细胞样品上生成的染色质免疫沉淀序列图谱与对 100， 000 个细胞和现有数据集进行的实验进行比较以供参考，可以验证自动化技术的成功。这种方法可以帮助回答表观遗传学领域中的关键问题，以进一步了解各种组织中特定生物标志物的功能。

发育阶段和疾病状态。这项技术对多种疾病的诊断具有意义，因为它将有助于识别健康和疾病中的表观遗传生物标志物，准确可靠。自动化技术是研究人员对特定细胞类型、亚群和活检进行表观遗传学分析的重要工具。

对于标准的自动染色质免疫沉淀实验，首先将 120 μL 染色质免疫沉淀缓冲液 H 添加到 100 至 200 万个细胞的剪切染色质中，为输入样品保留 2 至 20 μL 染色质。然后在 IP star compact 上设置自动化实验，选择方案并单击染色质免疫沉淀图标。选择染色质免疫沉淀直接方法，然后在下一个屏幕中，选择染色质免疫沉淀 200 μL 方案并指定样品编号。

将抗体包被的染色质免疫沉淀实验参数设置为 4 小时。步骤 免疫沉淀步骤 15 小时，每个洗涤步骤 5 分钟。然后按照布局信息屏幕上显示的说明设置试剂，并添加适当的试剂和经过高度验证的 ChIP-seq 级抗体。

然后加入 20 μL 蛋白质，每个反应加入 A 包被的磁珠，过夜 ChIP 方案和反向交联后的染色质样品结束。使用基于磁珠的 DNA 纯化试剂盒纯化 DNA。使用高灵敏度的市售荧光测定法定量免疫沉淀的 DNA。

接下来，对至少一个阳性和一个阴性对照基因组区域使用引物。根据分析材料的适当参数，通过定量 PCR 分析免疫沉淀的 DNA 的质量。结果表示为方案下用于下一代测序的输入回收率的百分比。

现在单击文库制备图标，然后选择首选的文库制备技术，并根据布局信息屏幕上的说明设置试剂。例如，在本实验中，生成了与基因表达相关的六种不同组蛋白修饰的测序图谱。在这些组蛋白标志物之间观察到的高峰值相关性表明自动化系统能够生成准确可靠的数据。

此外，这些图表显示了特定基因组区域不同组蛋白修饰的峰分布。最后，对于低细胞数样品的自动染色质免疫沉淀实验，如刚才所示，在自动化系统上设置自动染色质免疫沉淀 200 μL 方案。接下来，在系统中加载 ChIP-seq，分级抗体和试剂经过优化，每个反应仅使用 10 μL 蛋白质 A 包被磁珠即可处理 10， 000 至 100， 000 个细胞的染色质数量。

芯片后，运行文库制备，选择 micro plex 文库制备方案，并按照布局信息屏幕上显示的说明设置试剂。在来自 10， 000 个细胞起始样品的染色质免疫沉淀的代表性定量 PCR 中，观察到阳性对照区抗组蛋白抗体的显著富集和阴性对照区的信号可忽略不计。这里显示了一系列 10 个免疫沉淀反应，这些反应是可重现的，并且与手动染色质免疫沉淀实验高度相似，证明了自动化系统能够处理少量细胞，与手动免疫沉淀相比，实验间的变异性没有明显增加。

这些数据说明了 10， 000 和 100， 000 序列库的生物信息学分析。染色质免疫沉淀后的 He a S3 细胞，证明了低细胞数染色质免疫沉淀样品的出色结果。该数据集对应于 10， 000 个细胞起始材料的实验，包含低背景噪声和高度可靠的富集峰，100， 000 个细胞数据集和 Broad Institute 参考数据集都证实了这一点。

对于编码项目，需要注意的是，10， 000 个单元格数据与 Broad Institute 数据显示的峰几乎相同，其中最好的 40% 峰的重叠率为 98%，按最终代码项目中使用的显著性分数排序。IP star 自动化系统需要最少的作员干预，将染色质免疫沉淀的 HandsOn 时间缩短至仅 1 至 2 小时。此外，自动化过程取代了手动染色质免疫沉淀的众多容易出错的步骤，并提供高度一致的结果。

在尝试此程序时，重要的是要记住，良好的染色质免疫沉淀和良好的高度特异性和敏感性抗体选择是实验成功的关键。这项技术为生物学各个领域的研究人员提高治疗的准确性、可重复性和一致性铺平了道路。表观遗传学研究。