Name: 多囊肾一种可能的斑马鱼型号：击倒 Wnt5a的原因在斑马鱼肾囊肿 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 了解利用吗啉代敲低wnt5a基因在Tg(wt1b:GFP)转基因斑马鱼中建立多囊肾病模型的方法。该模型通过荧光显微镜观察肾囊肿形成，为研究肾脏发育和疾病机制提供重要工具。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）（L.H. 获资助号 DK093625，J.H.L. 获资助号 DK069909 和 DK047757）以及美国退伍军人事务部（VA）（J.H.L. 获功绩奖 I01BX000820）资助。我们感谢宾夕法尼亚大学斑马鱼核心设施的 Michael Pack 博士和 Jie He 博士提供了重要的支持。

注：伦理声明：所有斑马鱼实验均已获得东弗吉尼亚医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. Morpholino 准备
<ol>
	<li>根据制造商说明，为感兴趣基因设计并合成翻译阻断型（AUG-）和剪接抑制型（Splice-）反义吗啉环寡核苷酸（MO）（图&#160;1A）。请参见表1中的制造商信息。 
	注意：MO以冻干粉形式装于玻璃瓶中运输。</li>
	<li>向玻璃瓶中加入高质量无菌水，将MO重悬至终浓度为25 μg/μl。确保寡核苷酸完全溶解。若仍有固体残留，将含有储备液的管子在65 °C加热5至10分钟，并短暂涡旋。</li>
	<li>将MO储备液在室温下保存。不要在4 °C或-20 °C保存，因为较低温度可能导致MO寡核苷酸结合到容器壁上。每次制备新的MO储备液时，使用分光光度计测量其浓度（请参见表1）。</li>
	<li>在注射当天，用高质量无菌水将储备液稀释至所需剂量，制备MO工作液。加入0.5%酚红，使其终浓度达到0.05%。例如，为配制浓度为15 ng/nL的5 μl工作液，需加入3 μl MO储备液、0.5 μl 0.5%酚红和1.5 μl水。 
	注意：在此工作浓度下，每次注射一滴（500 pl）含有7.5 ng MO，两滴共含15 ng MO。</li>
</ol>
2. 注射装置的准备
<ol>
	<li>购买预拉制的玻璃针（详见表1中的详细信息）。或者，使用拉针仪自行拉制玻璃注射针。</li>
	<li>打开空气压缩机，并将压力调节至50 psi。打开解剖显微镜光源和Pico微量注射泵，调节参数如下：持针压力20 psi，喷射压力10 psi，周期值2.5，门控范围100 μsec。</li>
	<li>将5 μl注射溶液吸入预拉制的玻璃针中，并将针头垂直放置，尖端朝下。等待溶液完全到达针尖，确保无可见气泡。将针头夹持器放置在显微镜旁合适位置，并将玻璃针插入夹持器中。调整注射角度至45度。</li>
	<li>在显微镜下将针尖移入视野，位置略高于载物台，聚焦于针尖最细的区域。使用尖头镊子轻轻折断针尖。</li>
	<li>在显微镜下并排放置一把刻度尺和一根内径为0.15 mm的毛细管；将溶液注入毛细管一端，形成一段液柱。调节喷射时间，使每1 mm长度的液柱产生17滴，此时每滴体积为1 nl（滴体积 = π × 半径2 × 液柱长度 / 滴数）。 
	注意：直径为0.1 mm的液滴，其注射体积约为500 pl（滴体积 = 4/3 × π × 半径3）。</li>
</ol>
3. 受精斑马鱼胚胎的制备及吗啉代寡核苷酸显微注射
<ol>
	<li>根据已发表的斑马鱼饲养与维护标准方案，设置 Tg(wt1b:GFP) 转基因斑马鱼的繁殖配对。在自然产卵后收集胚胎，并将其置于盛有E3水（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4）的10 cm培养皿中。立即开始MO显微注射13。在显微镜下观察胚胎形态，确保MO注射在单细胞期完成，最迟不超过四细胞期。
	<ol>
		<li>将胚胎转移至带有楔形琼脂槽的10 cm培养皿中。吸除多余的E3水，并轻轻将胚胎压入槽内。</li>
		<li>使用显微移液器调整胚胎位置，在解剖显微镜下识别单细胞期胚胎。穿透卵膜后继续刺入卵黄，向卵黄中注射一至两滴MO（1滴 = 500 pl）。将注射后的胚胎转移至含有E3水的10 cm培养皿中，在28.5 °C条件下培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射完成后，移除死亡胚胎并记录已注射胚胎的数量。每24至48小时更换一次培养皿中的E3水。</li>
</ol>
4. 表型挽救实验
<ol>
	<li>选择来自另一物种的直系同源基因，该基因具有不同的主要碱基对结构（通常存在3-7个碱基对错配），因而对吗啉代寡核苷酸（MO）具有抗性，可用于挽救实验。例如，在本实验中，我们选择了小鼠，因为小鼠 Wnt5a mRNA序列与斑马鱼序列不同。</li>
	<li>设计引物序列，其中正向引物从翻译起始位点开始，反向引物位于mRNA编码区末端附近。在正向引物序列的5’端添加T7启动子序列。本实验中使用的引物序列为：正向： 5’- taa tac gac tca cta tag gga cta tga tgc tgc tga agc tga a-3和反向： 5’- tca ctt gca gac gta ctg gtc- 3’</li>
	<li>使用上述设计的引物组（每种引物0.5 μM）和含有小鼠基因的0.1 μg模板DNA，进行50 μl的聚合酶链式反应（PCR） Wnt5a cDNA序列扩增采用以下PCR程序：95 °C预变性1个循环，5分钟；95 °C变性30秒、58.5 °C退火30秒、72 °C延伸1分钟，共35个循环；最后72 °C延伸7分钟。</li>
	<li>循环结束后，取 2 μl PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，以确认条带大小正确。使用 PCR 纯化试剂盒按照制造商说明书纯化 PCR 产物。用分光光度计检测 DNA 浓度。将纯化的 PCR 产物于 -20 °C 保存，或直接用于下一步的加帽 RNA 转录。</li>
	<li>合成 体外 使用加帽RNA合成试剂盒，按照制造商说明书合成带加帽的mRNA。将mRNA溶于20 μl无RNase的水中，测定其浓度。分装RNA并储存于-80 °C。</li>
	<li>注射当天，用无RNase的无菌水配制mRNA工作液。注意，40 pg通常是不出现RNA非特异性或毒性效应的最大RNA剂量。将工作液置于冰上保存。先向胚胎注射吗啉代寡核苷酸（MO），再注射挽救用mRNA，或两者共同注射。例如，若第4.5步制备的mRNA浓度为0.6 μg/μl，则取0.67 μl mRNA（含0.4 μg）加入4.33 μl无RNase水中，终浓度为0.08 μg/μl，如此每次注射一滴（500 pl）即含有40 pg mRNA。MO的配制方法见第3步。</li>
</ol>
5. 荧光成像用注射胚胎的制备
<ol>
	<li>在 28.5 °C 下孵育过夜后，向 E3 水中加入 0.003% 的 N-苯硫脲（PTU），以防止黑色素化，从而避免影响使用荧光显微镜观察前肾结构。然而，在原肠胚形成之前不得添加 PTU，因为它会影响早期胚胎发育。</li>
	<li>在 48 hpf 时，使用精细镊子手动去除胚胎的绒毛膜。在解剖显微镜下拍摄 48 hpf 和 72 hpf 胚胎的图像。 
	注意：这些图像可在无需麻醉的情况下拍摄。</li>
	<li>在进行荧光显微镜成像前约 10 分钟，将胚胎置于含有 160 μg/ml 缓冲三卡因的 10 cm 培养皿中进行麻醉。等待 5–10 分钟后，轻轻触碰斑马鱼以确认其不再活动，表明麻醉已生效。</li>
	<li>胚胎麻醉后，在 3% 甲基纤维素中将其固定，并在解剖显微镜下（请参见表 1）将其调整为俯卧位。</li>
	<li>在荧光显微镜下（请参见表 1）观察前肾结构，并在不同放大倍数（10X 和 20X）下拍照。</li>
</ol>

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<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+coreceptor+Ryk+regulates+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+by+modulating+the+degradation+of+the+core+planar+cell+polarity+component+Vangl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2.</a> J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).</li>
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<li>Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease.</a> Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

多囊肾病（PKD）是人类终末期肾病的主要病因之一，其特征是进行性囊肿形成、肾脏增大以及肾小管发育异常14。常染色体显性多囊肾病（ADPKD）是一种遗传性疾病，由编码多囊蛋白-1（PC1）的PKD1基因或编码多囊蛋白-2（PC2）的PKD2基因发生突变所致，导致多囊肾的形成。许多其他基因，尤其是编码初级纤毛中蛋白质的基因，也被认为参与了肾囊肿的发生。然而迄今为止，尚无理想的工具用于筛选这些基因。本文描述了一种在斑马鱼中通过基因敲降后快速、简便地观察肾脏囊肿形成的方法。该方法有望用于筛选其他候选的多囊肾病相关基因。
该技术的优点之一在于其简便性。Tg(wt1b:GFP) 斑马鱼中，GFP 在肾小球、肾小管和导管中表达，使其成为研究整个前肾肾脏结构的特别合适的模型。Tg(wt1b:GFP) 斑马鱼可在基因敲低后直接观察前肾结构及肾脏囊肿的形成。此前怀疑Wnt5a敲低可能导致小鼠出现平面细胞极性（PCP）通路缺陷和肾脏囊肿形成。然而，Wnt5a 全身性敲除小鼠在出生后致死，无法用于观察出生后的肾脏...

斑马鱼（Danio rerio）胚胎被广泛用作研究肾脏发育和多囊肾病的模型。使用斑马鱼作为动物模型具有诸多优势：可研究基因间的相互作用，可利用反义吗啉代寡核苷酸（MO）实现蛋白敲低，能够快速检测大量胚胎，并且易于在活体幼鱼中观察器官表型1。前肾是脊椎动物中最早发育的肾脏，在斑马鱼幼体中具有功能2。与哺乳动物最终发育形成的后肾（第三也是最后一个肾脏）相比，斑马鱼前肾的结构相对简单。肾单位是肾脏的功能单位，每个人类肾脏含有50万至100万个肾单位3,4，每只小鼠肾脏约有1.3万个肾单位5，这使得在人类或小鼠肾脏中观察单个肾单位结构变得困难。斑马鱼仅有两个肾单位，而每个斑马鱼肾单位均包含小鼠和人类肾小球及肾小管中存在的所有主要结构成分6，并具有类似的特化肾细胞类型。与其他脊椎动物模型（如Xenopus）相比，斑马鱼肾单位更接近哺乳动物肾单位，因其具有封闭的系统7。
近年来，斑马鱼基因组已被测序，使得遗传工具、大量突变体资源以及转基因报告基因品系在斑马鱼模型中得到广泛应用。斑马鱼的前肾在受精后12至72小时（hpf）期间形成，可在透明胚胎中轻松观察。Wilms肿瘤蛋白WT1是肾脏发育的关键因子。在wt1b启动子控制下表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因斑马鱼品系Tg(wt1b:GFP)，自17 hpf起在胚胎的前肾区域特异性表达GFP8。肾单位纤毛病（NPHP）是一种常染色体隐性遗传的囊性肾病，由NPHP基因突变引起9。通过吗啉代寡核苷酸敲低NPHP4可在Tg(wt1b:GFP)鱼中导致囊肿形成10。因此，该转基因鱼品系是观察肾脏发育过程中肾脏结构及囊肿形成的理想模型。重要的是，利用该品系可以高效、省时省力地研究肾脏发育调控因子的影响。
本文描述了利用 Tg(wt1b:GFP) 斑马鱼模型，在基因调控后可视化观察肾脏囊肿形成的过程。我们使用起始位点和剪接位点的反义吗啉代寡核苷酸（MO）来敲低斑马鱼中的 wnt5a 基因。Wnt5a 是 Wnt 家族的一种非经典分泌型糖蛋白，在多种器官的发育及出生后细胞功能中发挥重要作用11。Wnt5a 通过非经典 Wnt 信号通路发挥作用，其中包括平面细胞极性（PCP）通路，该通路已被发现参与肾小管伸长过程中的定向细胞分裂。Wnt5a 通过与类受体酪氨酸激酶（Ryk）形成复合物来调控 Wnt/PCP 通路，进而通过与 VANGL 平面细胞极性蛋白 2（Vangl2）形成复合物传递 Wnt5a 信号，从而促进 Vangl2 的稳定性12。PCP 通路的缺陷可导致细胞分裂方向紊乱，进而引发肾囊肿的形成。我们利用 Tg(wt1b:GFP) 斑马鱼品系，在 wnt5a 基因敲低后观察肾脏囊肿的形成。该 Tg(wt1b:GFP) 斑马鱼模型支持活体成像，可实时观察肾脏结构。在 wnt5a 基因敲低后，肾脏囊肿自 24 hpf 开始出现；至 72 hpf 时，可在肾小球和近端小管中观察到囊肿。该方法也可用于筛选其他可能引起肾脏囊肿形成的基因。

<table><tbody><tr><td>0.5% 酚红</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>注射用显色指示剂</td></tr><tr><td>吗啉代寡核苷酸（Morpholino）</td><td>Genn Tools, LLC</td><td>(customized)</td><td>针对目标基因定制设计</td></tr><tr><td>预拉制注射针</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-PP</td><td>若需大量注射针，也可购买拉针仪并在实验室自行制备</td></tr><tr><td>T7 mMessage 试剂盒</td><td>Ambion</td><td>1344</td><td>用于体外转录合成带帽mRNA，以进行挽救实验</td></tr><tr><td>N-苯硫脲</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>用于防止黑色素形成</td></tr><tr><td>三卡因（Tricaine）</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>又称乙基-3-氨基苯甲酸酯，用于斑马鱼麻醉</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma</td><td>M-0387</td><td>用于固定斑马鱼&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>用于纯化PCR产物以合成带帽RNA</td></tr><tr><td>dNTP 混合液</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>用于PCR</td></tr><tr><td>Tag DNA 聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>10342-053</td><td>用于PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td>用于测定吗啉代寡核苷酸和RNA浓度</td></tr><tr><td>空气压缩机</td><td>Werther International, Inc.</td><td>Panther Compact 106</td><td>提供注射用气源</td></tr><tr><td>Pico 微量注射泵</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>PV830 Pneumatic PicoPump</td><td>也可使用其他类型的显微注射系统</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>MMJR</td><td>右手型（左撇子使用MMJL）</td></tr><tr><td>持针器</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>5430-ALL</td><td>用于在显微操作中夹持注射针</td></tr><tr><td>杜蒙特镊子（Dumont Tweezers）</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>11253-20</td><td>用于折断针尖</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica M205C&amp;nbsp;</td><td></td><td>用于观察和成像斑马鱼胚胎</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss Axio Observer D1m &amp;nbsp;</td><td></td><td>用于成像斑马鱼前肾</td></tr><tr><td>毛细管（内径 0.15 mm）</td><td>VitroCom</td><td>CV1525Q-100</td><td>用于测量每次注射液滴的体积</td></tr></tbody></table>

一种可能的多囊肾病斑马鱼模型：敲低wnt5a可导致斑马鱼肾脏出现囊肿

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

多囊肾病（PKD）是终末期肾病最常见的病因之一，是一种目前尚无治愈手段的严重疾病。导致PKD囊肿形成的分子机制仍不十分明确，但认为涉及多个基因。Wnt5a是一种非经典糖蛋白，可调控多种发育过程。Wnt5a通过平面细胞极性（PCP）通路发挥作用，该通路在肾小管上皮细胞伸长过程中调控细胞的定向分裂。PCP通路的缺陷已被发现可导致肾囊肿的形成。本文介绍了一种通过使用针对wnt5a基因的反义吗啉代寡核苷酸（MO）敲低wnt5a基因，建立斑马鱼多囊肾病模型的方法。Tg(wt1b:GFP)转基因斑马鱼用于在wnt5a基因敲低后可视化观察肾脏结构及肾囊肿。使用了两种不同的反义MO（AUG起始位点和剪接位点），两者均在wnt5a敲低后导致尾部向下卷曲的表型及囊肿形成。注射对MO具有抗性的小鼠Wnt5a mRNA（因其一级碱基配对结构不同）可挽救异常表型，证明该表型并非由吗啉代寡核苷酸的“脱靶”效应引起。本研究结果支持利用斑马鱼模型研究wnt5a基因在肾脏中功能的有效性。

Wnt5a 通过在单细胞期向斑马鱼胚胎中注射翻译阻断型吗啉代寡核苷酸（AUG-MO）或外显子/内含子边界剪接型吗啉代寡核苷酸（splice-MO），实现基因敲低。AUG-MO 靶向起始密码子，因此可抑制母源性和合子型转录本的翻译 wnt5a 信息。该剪接MO靶向wnt5a的第三个剪接供体位点，仅抑制其合子转录本（图 1A）。AUG 和剪接突变体彼此表型模拟，均表现出多种缺陷，包括尾部向下卷曲及心包水肿（图 1B）。小鼠 Wnt5a mRNA 能部分挽救形态发生素表型（图 4B），表明该表型并非由脱靶效应所致。 Tg(wt1b:GFP) 表达由 wt1b 启动子驱动的 GFP 的转基因斑马鱼，使 GFP 的表达模式重现内源性 wt1b 的表达 wt1b用于描绘前肾结构。 Tg(wt1b:GFP) 在48 hpf时，wnt5a基因敲降后斑马鱼出现肾小球囊肿形成，而仅注射酚红的对照组胚胎则表现出正常的前肾发育，形成“U”形融合的肾小球，并具有向外侧延伸的...

我们描述了一种建立多囊肾病斑马鱼模型的方法。我们使用Tg(wt1b:GFP)转基因鱼来观察肾脏结构。通过显微注射吗啉代寡核苷酸实现wnt5a基因的表达敲低。在该GFP转基因斑马鱼中，观察到wnt5a基因敲低后出现前肾囊肿的形成。

多囊肾病（PKD）是终末期肾病最常见的病因之一，是一种目前尚无治愈手段的严重疾病。

以下实验的总体目标是建立一种可能的斑马鱼多囊肾病模型。该模型通过在单细胞阶段向转基因 WT1:BGFP 斑马鱼胚胎中注射针对 Wnt5a 的吗啉代寡核苷酸（morpholino）来实现。随后，通过显微注射小鼠 Wnt5a mRNA 与 Wnt5a 吗啉代寡核苷酸共同进行挽救实验。随后，在受精后48小时和72小时对显微注射的胚胎进行麻醉并包埋，以观察肾脏结构及囊肿的形成。wind five A基因敲低后，根据荧光显微镜下前肾结构的观察结果，表明在转基因WT one BG FP斑马鱼中，wind five A基因敲低会导致前肾囊肿的形成。该技术的应用意义在于构建多囊肾病模型，因为斑马鱼胚胎具有透明特性，结合使用肾脏特异性荧光蛋白转基因品系，可在完整活体生物中直接观察肾脏结构。该方法有助于深入了解win五基因敲低导致斑马鱼肾囊肿形成的过程。也可用于检测其他许多疑似引起肾囊肿形成的基因。本实验方案简单且耗时较少。根据制造商的说明设计并合成吗啉代寡核苷酸（morpholino）后，向玻璃瓶中加入高纯度无菌水，充分重悬至终浓度为 25 微克每微升。使用分光光度计测定浓度，并在注射当天将原液于室温保存；使用高纯度无菌水将吗啉代寡核苷酸稀释至所需浓度，并加入 0.5% 酚红使其终浓度为 0.05%。接下来打开空气压缩机，将压力调节至 50 psi。然后打开体视显微镜光源和皮升微量注射泵，调节参数设置如下。使用 5 µL 注射液装载一支预先拉制的玻璃针，并在无可见气泡时将针头尖端朝下垂直放置，然后将针头插入持针器中。调整注射角度至 45 度。在显微镜下将针头尖端移入视野，位置应远离载物台，并聚焦于针尖最细的区域。然后使用尖头镊子折断针头。提示：在显微镜下放置一根内径为0.15毫米的毛细管。将溶液注入其中一端。调节皮升微注射泵的喷出时间，直至形成由17滴组成的、长度为一毫米的液柱，使每滴液体的体积等于一纳升。根据已发表的斑马鱼饲养与维持标准方案，设置转基因野生型单碱基绿色荧光蛋白斑马鱼繁殖配对。自然产卵后，收集胚胎并将其转移至含有E3水的培养皿中。选取处于1到4细胞期的胚胎，将其转移至带有楔形螺旋槽的10厘米培养皿中。在体视显微镜下，轻柔吸除培养基后，将胚胎压入槽中，并调整胚胎方向以观察细胞。然后用注射针穿透Corian，再刺入卵黄，向卵黄内注射一到两滴morpho。将注射后的胚胎转移至含有E3水的10厘米培养皿中，在28.5°C条件下培养。记录存活的注射胚胎数量，用于进行表型挽救实验。选择另一个物种中与目标基因具有不同主要碱基对结构因而对吗啉代寡核苷酸具有抗性的直系同源基因。在此示例中，选择了小鼠的 *wnt5a* 基因。设计一对引物，其中正向引物起始于翻译起始位点，反向引物靠近 mRNA 编码区的末端。在引物的正向引物序列5'端添加一个T7启动子序列，并加入含有小鼠wind

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