无外源基因人诱导性多能干细胞系的建立与表征及其向明确临床级条件的转化

以下实验的总体目标是获得基于慢病毒的、无重编程因子的人诱导多能干细胞，并将这些细胞转化为具有潜在临床应用级别的状态。该目标首先通过使用单个大容量慢病毒干细胞表达盒（或称为 stem car）对成人皮肤来源的人成纤维细胞进行重编程，从而获得人诱导多能干细胞（HI PSCs）。随后，将重编程获得的 HI PSCs 暴露于腺相关病毒（adeno-associated virus），以实现 stem car 从宿主基因组中的完全切除和清除。

随后，从无饲养层的HI PSCs中提取基因组DNA，并通过AgeI酶切分析验证干细胞因子的正确切除。最后，采用逐步转换方法将三因子H IPCs转化为完全明确的无异源成分的、拟GMP级条件。最终，通过对人成体皮肤成纤维细胞进行病毒载体介导的重编程，并将H IPCs完全转化为临床级条件，凸显了该方法在重编程成体人细胞并将其转化为临床适用条件方面的广泛适用性。

该技术的意义在于推动人诱导性多能干细胞在临床中的应用，因为这些细胞完全无外源因子，并已转化为符合临床级标准的培养条件，因而适用于人类治疗。本方法的可视化演示至关重要，因为重编程因子的切除以及向临床级细胞的转化步骤操作复杂且流程精细，学习难度较高，必须严格遵循特定操作程序才能获得无外源因子且符合临床级标准的人诱导性多能干细胞。首先，在37°C水浴中解冻成人真皮来源的人成纤维细胞（HAFs），持续两分钟。

注意不要将离心管顶部浸入水中。将一毫升细胞悬液转移至一个15毫升离心管中，以重悬细胞，并逐滴加入培养基稀释DMSO。缓慢加入四毫升预热的huff培养基，然后在室温下以200 × g离心10分钟。

然后吸除上清液，收集新生细胞并重悬。将细胞重悬于培养基中，调整浓度至每毫升100,000个细胞，并接种于预先用0.2%明胶包被的六孔板中的一个孔内。加入两毫升细胞悬液，再向第二个孔中加入两毫升悬液。

将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中过夜培养前，为用于测定感染复数（MOI），需将培养板左右及前后轻轻摇动，使细胞均匀分布。24小时后，在计数细胞的同时，取出两份每份含有八次方转导单位（TU）的等效慢病毒浓缩液，用含8微克/毫升转染试剂的完全培养基将其稀释至每毫升含1×10⁸个转导单位（TU/mL）的浓度。以10的感染复数（MOI）比例对细胞进行转导。

在慢病毒转导后约24小时，将转导孔中的液体混匀并过夜孵育。吸去huff培养基，更换为标准的人多能干细胞（PSC）培养基。在第2至第6天期间每天更换培养基。在第6天，将1.5至1.75 × 10⁶个来源于补体成分因子1（CF1小鼠）的鼠胚胎成纤维细胞接种到两个经0.2%明胶包被的10厘米培养皿中，使用半量培养基，在第7天进行培养。

将室温的传代液加入一个六孔板的一孔中，该孔含有重编程的成纤维细胞。轻轻吹打使细胞脱落，以100 × g离心后，用新鲜的人类多能干细胞培养基将所有细胞以1:16的比例接种至两个10厘米的CFI基质胶包被培养皿中。以顺时针螺旋方式均匀分布细胞团，并在更换培养基前孵育约48小时。

三到四周后，使用21号针头挑选8至10个具有典型胚胎干细胞样形态的单个克隆菌落，在扩增后将其分别传代至CFI MFS的各个孔中。在确认干细胞载体整合位点（如随附文本方案所述）后，通过拟胚体形成及标志物表达分析验证细胞的多能性。首先将旧的人PSC培养基吸除，加入3 mL标准PSC培养基，以切除干细胞载体。

将45微升浓缩的腺病毒颗粒与8微克/毫升的转染试剂混合，然后加入细胞中，孵育24小时。孵育后，吸除病毒上清，使用人多能干细胞（hPSC）培养基洗涤细胞两次。随后，加入含有2微克/毫升嘌呤霉素的hPSC培养基，每天更换培养基。五天后，对剩余的克隆进行亚克隆，并按照视频中先前所述的方法进行扩增。

接下来，将一管预冷的Eloqua基底膜基质置于冰上解冻，并用冷的基础培养基将其稀释至1:30的最终浓度。每孔加入1毫升，包被所需数量的6孔板孔，室温静置1小时。然后使用18号针头，从先前包被有mes的孔中至少挑取20至30个克隆，进行十字划线。

注意尽量减少悬浮的基质并防止细胞从培养板上脱落。在孵育一小时后，使用200微升移液器吸除包被孔中的基质。通过轻轻刮取旧培养板上的克隆团块，将其转移至3毫升新鲜配制的培养基中，并将其中一份接种到已包被基质的培养板中。

孵育48小时后，当切除后无饲养层的转化人诱导多能干细胞（HI PSCs）达到80%融合度时，每天更换培养基。使用商品化的DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并采用此处所示特异性针对干细胞慢病毒外源性整合的引物。通过PCR分析DNA，确认正确切除，从而将切除后的HI PSCs转入GMP级培养条件。

将HPSC联合培养基一与符合临床级GMP标准的培养基或联合培养基二按80比20的比例混合，预热至37摄氏度。吸除细胞中的旧联合培养基一，更换为三毫升新的预热培养基溶液。连续三天每天更换培养基，按照文本方案进行传代，以维持适当的克隆大小和密度。在第四天，将培养基更换为等体积预热的联合培养基一和联合培养基二的混合液，继续培养三天。

从第7天开始每天更换培养基，改为使用预热的培养基一和培养基二按20比80的比例混合的完全培养基，每天更换一次，持续三天。第10天时，更换为预热的100%混合培养基二，并每天更换。此时细胞已处于完全明确的无异源培养基中。

接下来，使用一种明确的无异源成分基质包被六孔板的一个孔，然后将汇合细胞孔中的无异源培养基替换为含有1× Rock的新鲜培养基。在37°C孵育1小时后，使用18号针头通过机械方式将细胞切割并转移至新制备的孔中。让细胞在未受干扰的条件下孵育两天，以确保细胞充分贴壁，随后根据文本所述方案对细胞进行表征。

该图展示了采用干细胞载体（stem car）方法在间充质层上重编程后，三种不同预先切除的H-I-P-S-C细胞系的代表性图像。图中所示为切除后的逆转录PCR凝胶结果，显示某一特定亚克隆完全不含干细胞载体慢病毒，证据是缺乏针对干细胞载体内源性特定序列的扩增条带。本图还展示了在含异种成分的基质上培养的前体转化IPC细胞，以及在合成基质上培养的切除后无异种成分的GMP级H IPC细胞，并通过QPCR对SOX2、OCT4和Nanog等标准多能性相关因子进行了定量分析。

最后，如图所示，通过流式细胞术检测了在转换前、后将 HI PSCs 转化为 GMP 级别条件下的唾液酸和糖基神经氨酸，以确认是否存在非人类抗原。观看本视频后，您应充分掌握如何利用 Stemco 重编程病毒对人成体皮肤成纤维细胞进行重编程，将病毒从基因组中切除，并将这些 HI PSCs 完全转化为完全符合人类治疗应用的临床级别条件。请务必注意，操作 Staca（第三代抗病毒载体）可能存在极高危险性，必须采取相应防护措施。

进行此操作时，应使用适当的个人防护装备（PPE）以及VSL二级加组织培养室。