Name: 推导与表征的转基因无人类诱导多能干细胞系，并转换成定义的临床级条件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学习利用慢病毒重编程成人皮肤成纤维细胞，获得无因子人诱导多能干细胞，并通过腺病毒Cre切除载体实现基因组无痕化，最终将其转换为符合GMP标准的临床级培养条件。

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我们感谢 Patrick C. Lee、Cyril Ramathal 和 Saravanan Karumbayaram（SK）在诱导多能干细胞（iPSC）的衍生与鉴定实验中提供的帮助；感谢 Aaron Cooper 完成 iPSC 分析实验；感谢 Vittorio Sebastiano 和 Renee A. Reijo Pera 指导最初的重编程工作；感谢 SK、William E. Lowry、Jerome A. Zack 和 Donald B. Kohn 指导建立加州大学洛杉矶分校（UCLA）符合药品生产质量管理规范（GMP）的设施，从而实现临床级 iPSC 的转化与鉴定；感谢 Gustavo Mostoslavsky 向我们提供了 STEMCCA 多顺反子重编程载体。本研究基于与 Fibrocell Science 及皮肤间充质来源衍生物临床研究计划（CIDMOD）的合作，旨在开发安全的个体化细胞治疗产品。本研究得到了加州大学洛杉矶分校再生医学与干细胞研究中心 Eli 和 Edythe Broad 中心、Phelps 家族基金会、Fibrocell Science 公司以及 UCLA 临床与转化科学研究所（CTSI）学者奖（授予 JAB）的资助支持。

注意：本方法已在 Awe et al.10 报道的研究中使用。
1. 使用 STEMCCA 重编程成人人类皮肤成纤维细胞
<ol>
	<li>将第4代或更低代次的成人真皮人成纤维细胞（HUFs）在37 °C水浴中解冻2分钟，注意不要让水淹没冻存管顶部。</li>
	<li>将1 ml人成纤维细胞悬液转移至15 ml锥形管中，逐滴缓慢加入4 ml已预热至37 °C的标准HUF培养基，以稀释二甲基亚砜（DMSO）并重悬细胞。</li>
	<li>在室温下以200 × g离心10分钟。吸除上清液，用适量培养基重悬细胞，制成浓度为100,000个细胞/ml的悬液，然后将2 ml细胞悬液加入已预先用0.2%明胶包被20分钟的六孔板的一个孔中。 
	注意：需在另一孔中接种相同数量的细胞，用于后续细胞计数和感染复数（MOI）计算。</li>
	<li>轻轻左右及前后摇动培养板，使细胞均匀分布。置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。</li>
	<li>在转导当天，从六孔板的对应孔中获取细胞计数，时间约为初次接种HUF后约24小时。</li>
	<li>解冻2 × 108 TU（或等效量）的慢病毒浓缩液（STEMCCA），并用HUF培养基稀释至1 × 108 TU/ml。</li>
	<li>在含有8 µg/ml转导试剂的HUF培养基中，以MOI为10的比例进行细胞转导。轻轻混匀各孔，置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。</li>
	<li>慢病毒转导约24小时后，将HUF培养基更换为标准的人多能干细胞（PSC）培养基。</li>
	<li>第2至第6天，每天更换一次人PSC培养基。</li>
	<li>第6天，在HUF培养基中接种两个经0.2%明胶包被的10 cm培养皿，每皿接种1.5至1.75 × 106个来自CF1小鼠的MEFs12。</li>
	<li>第7天，注意离心力不得超过100 × g，使用室温胰酶消化六孔板中一个孔的第7天重编程成纤维细胞，按1:16比例传代，将全部细胞均匀接种至前一天已铺有MEFs的两个10 cm培养皿中，加入新鲜人PSC培养基。以顺时针螺旋方式分布细胞团块，置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。</li>
	<li>重编程细胞接种至MEFs上约48小时后，以及此后每天，均需更换耗尽的培养基为新鲜人PSC培养基。</li>
	<li>3至4周后，使用21号针头挑取具有典型胚胎干细胞（ESC）样形态的单个克隆，并将每个克隆约8至10个片段分别转移至已预先用来自CF1小鼠的MEFs包被、并加入人PSC培养基的0.2%明胶包被的24孔板的不同孔中进行亚克隆。 
	注意：挑取并扩增后的克隆需通过拟胚体形成实验及多能性标志物在蛋白水平的表达分析，以确认其多能性。</li>
</ol>
2. 载体整合位点分析与STEMCCA切除
<ol>
	<li>采用非限制性线性扩增PCR方法分析STEMCCA整合位点，具体操作如文献10所述。</li>
	<li>检测确认基因组目标区域已发生单一位点整合后，通过吸除旧的人类ESC培养基来去除STEMCCA。然后，在3 ml标准PSC培养基中将45 µl浓缩的Adeno-Cre-PuroR病毒与8 µg/ml转染试剂混合，孵育24小时。</li>
	<li>24小时孵育后，吸除混合病毒上清液，并用人类PSC培养基洗涤细胞两次。加入新鲜的人类PSC培养基及2 µg/ml嘌呤霉素，持续5天，每天更换新鲜培养基和抗生素。</li>
	<li>5天后，使用21号针头将残留的克隆进行亚克隆，接种至已涂有0.2%明胶的12孔板中，该板预先包被了来自CF1小鼠的MEF细胞，并按上述方法进行扩增。 
	注意：在获得足够扩增量以制备冻存样本后，需转换为无饲养层条件。预计至少有95%的干细胞克隆死亡，因为大多数细胞未成功转导，在5天抗生素孵育期间会死亡。尽管Adeno-Cre-PuroR在感染细胞宿主染色体中的整合效率为0.001–1%，但将一批无外源因子的克隆重新暴露于嘌呤霉素中，若观察到100%细胞死亡，则可确认无病毒整合发生13。</li>
	<li>将预先分装的基底膜基质小瓶置于冰上缓慢融化约2小时（遵循制造商建议），直至基质呈液态，然后用冷的基础培养基稀释至1:30的终浓度。在六孔板中每孔加入1 ml进行包被，室温静置1小时。</li>
	<li>使用18号针头或玻璃/塑料“尖头”对先前包被MEF的孔中至少20至30个克隆进行划线交叉处理。操作时注意尽量减少MEF的掀起及转移。
	<ol>
		<li>可通过多种方式制备划线工具，包括在明火上加热、拉制并修整玻璃巴斯德吸管的复杂方法，或简单使用无菌塑料移液器吸头，或如本实验所用的21号和/或18号针头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育后吸除包被孔中的基质。</li>
	<li>用200 µl移液器轻轻刮取旧培养板上的克隆碎片，小心转移至已包被基质的六孔板中含3 ml新鲜混合培养基1的孔内。在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜孵育。传代后48小时更换培养基。</li>
	<li>从已完成STEMCCA切除并转换为无饲养层条件的hiPSCs中提取基因组DNA，细胞融合度需超过80%，使用商业化DNA提取试剂盒进行操作。</li>
	<li>使用针对STEMCCA慢病毒外源性整合特异的引物检测切除是否正确：gDNA-hendo-MycS-正向引物，5′-acgagcacaagctcacctct-3′；gDNA-hWPRE-反向引物，5′-tcagcaaacacagtgcacacc-3′。用PCR级水溶解冻干引物，配制成10 µM的储存液。</li>
	<li>进行PCR扩增，采用以下五步程序：95 °C预变性3分钟；随后35个循环，每个循环包括：98 °C变性20秒，62 °C退火15秒，72 °C延伸15秒；最后72 °C单次终延伸3分钟。</li>
	<li>配制3%琼脂糖凝胶：称取1.5克琼脂糖加入50 ml 1x TAE缓冲液中，微波加热至完全溶解，加入适量稀释的DNA凝胶染料，混匀后倒入凝胶模具，室温静置1小时使其凝固。</li>
	<li>将12 µl PCR产物与3 µl上样染料混合后上样至3%琼脂糖凝胶，80 V电压下电泳30分钟。</li>
	<li>在紫外光下观察，若无条带出现，则表明切除正确。</li>
</ol>
3. 利用定量PCR检测hiPSCs在切除前后基因表达差异的定量分析
<ol>
	<li>使用商业化RNA提取试剂盒，从去饲养层且已切除后的hiPSCs中提取总RNA。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用商业化试剂盒将最多1 µg的总RNA进行逆转录。使用锚定寡核苷酸(dT)18和随机六聚体引物。 
	注意：确保PCR方案针对长度大于或小于4 kb的基因转录本进行优化。需针对STEMCCA最初整合的基因设计特异性引物。</li>
	<li>用PCR级水溶解冻干引物，配制成20 µM的储存液。</li>
	<li>每20 µl反应体系中加入5 ng样本，反应体系包含10 µM UPL探针、2x LightCycler 480 Probes Master以及20 µM的正向和反向引物。</li>
</ol>
4. 转化为GMP级条件
<ol>
	<li>在将术后切除的 hiPSCs 转换至 GMP 级别培养条件的第一天，配制一种混合培养基，其中人 PSC 混合培养基 1（混合培养基 1）与临床级符合药品生产质量管理规范（GMP）的培养基（混合培养基 2）按 80:20 的比例混合。</li>
	<li>吸除原有的混合培养基 1，加入 3 ml 预先温育的、按 80:20 比例配制的新混合培养基 1 和 2。以此特定比例每日更换培养基，持续 3 天。将细胞放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中。</li>
	<li>第 4 天，将混合培养基 1 和 2 按 50:50 的比例配制。吸除旧培养基，更换为预温育的、按 50:50 比例配制的混合培养基 1 和 2。以此特定比例每日更换培养基，持续 3 天。将细胞放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中。</li>
	<li>第 7 天，将混合培养基 1 和 2 按 20:80 的比例配制。吸除旧培养基，更换为预温育的、按 20:80 比例配制的混合培养基 1 和 2。以此特定比例每日更换培养基，持续 3 天。将细胞放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中。</li>
	<li>第 10 天，将混合培养基 1 和 2 按 0:100 的比例配制。吸除旧培养基，更换为预温育的、按 0:100 比例配制的混合培养基 1 和 2。以此特定比例每日更换培养基。此时细胞已完全处于明确的无异源成分培养基中。将细胞放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中。 
	注意：在整个转换过程中，需常规使用 18 号针头进行传代，以维持适当的克隆大小和密度。应根据克隆大小、汇合度及分化情况，计划每 4 至 5 天传代一次。</li>
	<li>按照生产商推荐的方法，使用一种明确的无异源成分基质对六孔板中的一个孔进行包被。</li>
	<li>对已转换至无异源成分培养基条件的六孔板中汇合的细胞孔，使用 18 号针头进行机械传代。重要的是，在传代前需向细胞中加入新培养基（混合培养基 2）并添加 1× ROCK 抑制剂，孵育 1 小时，以预处理培养基。</li>
	<li>吸除细胞将要转移至的新培养板上的合成基质溶液。将含有干细胞团块的全部旧培养基从原培养板中移除，并转移至新培养板中。</li>
	<li>将细胞放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 2 天，期间尽量减少物理扰动（理想情况下，培养板一旦放入培养箱后不再直接触碰），以促进最大化的细胞贴附。 
	注意：细胞需每日更换培养基。持续每 4 天传代一次至关重要。使用 21 号针头，仅传代具有最佳 ESC 样形态（高核质比）的克隆部分。这将确保筛选出能够良好生长并最终形成均一克隆的正确 hiPSC 克隆。从初始混合培养基更换开始，获得 ESC 样克隆的总体时间为 15 至 20 天。</li>
	<li>冷冻保存 GMP 级别的术后切除 hiPSCs：首先使用 18 号针头在所有克隆上进行十字划线，然后用 200 µl 移液器将所有克隆碎片吹打下来，将含有细胞的全部培养基转移至 15 ml 锥形离心管中，在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>在细胞离心过程中，配制冻存液：将预冷的混合培养基 2 与冻存液按等体积混合，使终浓度为 7.5% DMSO。</li>
	<li>细胞沉淀完成后，吸除旧培养基，逐滴加入冻存液重悬细胞沉淀。立即转移至冻存管中，并放入 −80 °C 冰箱中保存。</li>
</ol>
5. GMP级人诱导多能干细胞（hiPSCs）切除后表征
<ol>
	<li>为确保转化后多能性标志物的正确表达，使用引物（见表1）并按照步骤3所述相同方法进行QPCR，定量检测关键多能性标志物（SOX2、OCT4 和 NANOG）的表达水平。QPCR方法遵循步骤3中列出的相同步骤。</li>
	<li>根据试剂盒中列出的标准条件，使用流式细胞术检测非人类唾液酸 Neu5Gc（N-羟乙酰神经氨酸），方法如先前文献报道10。</li>
	<li>使用1×磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤含细胞的细胞培养板。</li>
	<li>使用1×解离试剂在室温下孵育5分钟，使细胞集落解离。</li>
	<li>在步骤5.4的5分钟孵育期间，将封闭剂（试剂盒提供）用预冷的PBS配制成0.5%的封闭溶液，以准备封闭液。</li>
	<li>为流式细胞术分析标记以下一系列试管：未染色对照；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）；对照抗体1:200；一抗1:200；二抗1:200驴抗鸡IgG（H+L）；MEF样本；基质上切除后的细胞样本；合成基底上切除后的细胞样本。</li>
	<li>向步骤5.4所得细胞团块中加入2 ml封闭溶液，轻柔吹打使细胞团块悬浮，转移至15 ml锥形管中。在4 °C下以80 × g离心5分钟。</li>
	<li>用封闭溶液洗涤细胞两次，离心条件同步骤5.7所述。</li>
	<li>将约1 × 106个细胞用100 µl封闭溶液重悬，并加入相应稀释比例的各抗体。在4 °C下轻轻振荡孵育1小时。</li>
	<li>重复步骤5.8中的洗涤步骤共三次。</li>
	<li>对于步骤5.6中列出的第2、6、7和8号试管，将细胞沉淀重悬于400 µl稀释缓冲液（来自试剂盒）中，并加入1:100的DAPI。</li>
	<li>将细胞通过40 µm滤网过滤后上机进行流式细胞术分析。</li>
</ol>

<ol><li>Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+field+of+induced+pluripotency%3A+Recent+progress+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges.</a> J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).</li>
<li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation%2C+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).</li>
<li>Karumbayaram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+skin+biopsy+to+neurons+through+a+pluripotent+intermediate+under+Good+Manufacturing+Practice+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).</li>
<li>Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+magic+act+of+generating+induced+pluripotent+stem+cells%3A+many+rabbits+in+the+hat%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat.</a> Stem Cells. 30, 28-32 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+of+reprogramming+transgenes+improves+the+differentiation+potential+of+iPS+cells+generated+with+a+single+excisable+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector.</a> Stem Cells. 28, 64-74 (2010).</li>
<li>Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+safe+harbors+permit+high+beta-globin+transgene+expression+in+thalassemia+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).</li>
<li>Awe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+conversion+to+putative+clinical-grade+status%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status.</a> Stem Cell Res Ther. 4, (2013).</li>
<li>Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Geron+Corporation+Press+Release%22">Geron Corporation Press Release</a>. , Geron. (2009).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).</li>
<li>Mitani, K., Kubo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+as+an+integrating+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus as an integrating vector.</a> Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+nature+of+human+pluripotent+stem+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny.</a> Cell Res. 22, 178-193 (2012).</li>
<li>Schroder, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110, 521-529 (2002).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
</ol>

James A. Byrne（JAB）和 Agustin Vega-Crespo 接受 Fibrocell Science, Inc. 的研究资助。JAB 担任 Fibrocell Science, Inc. 的科学顾问。其他作者均无任何竞争利益需要披露。

我们介绍了一种在无外源因子条件下诱导生成人诱导多能干细胞（hiPSCs）的方法，并通过将这些细胞转化为符合药品生产质量管理规范（GMP）级别的培养条件，使其具备临床应用价值，为未来人类治疗中的下游细胞分化奠定基础。尽管本方案可广泛适用于多种细胞类型，但我们选择重编程人皮肤成纤维细胞，因其易于从患者体内获取，且适用于个体化人类治疗。一旦在完全分化为具有临床意义的终末细胞类型方面的局限性得到解决14，本文所述的向GMP级条件的转化将对更多不同类型的细胞具有更广泛的应用价值。
本研究的第一部分涉及使用STEMCCA慢病毒对人类成纤维细胞进行重编程。选择该技术在很大程度上是由于其可重复性高、重编程效率相对较高（0.02%），并且能够在多种不同细胞类型中稳健地实现重编程10。该技术优于其他重编程方法，例如仙台病毒、附加体质粒以及基于合成mRNA的重编程，后者存在重编程效率较低和可重复性差的问题10。尽管基于HIV的载体倾向于整合到基因活性热点区域15，但并不能保证其一定会整合到基因内部，更不用说整合到基因...

研究表明，通过基于慢病毒表达四种关键转录因子，成人人体细胞能够发生表观遗传重塑和重编程4,5。重编程领域的一项重要进展是使用单一可切除的慢病毒干细胞表达盒（STEMCCA），该载体包含全部四种重编程转录因子，可实现蛋白质表达的精确化学计量比6。此外，在特定感染复数范围内进行转导时，STEMCCA可在重编程过程中主要导致单一位点的基因组整合事件7。可切除型STEMCCA的引入利用了Cre/loxP技术，可在干细胞系建立后切除重编程载体，从而获得无外源因子的人诱导多能干细胞（hiPSC）系8。此外，为了增强hiPSC在治疗中的应用，亟需建立一种新型、快速且易于实施的方法，将含异源成分的细胞系转化为符合良好生产规范（GMP）级别的无异源成分细胞系。本文讨论了一种相关方法，可更精确地评估基因整合后的表达差异，特别是当基因整合至内含子时的情况，以及将临床级细胞系转化为潜在GMP条件的流程。
既往研究仅采用相对不敏感的微阵列转录分析来检测STEMCCA转导后整合基因的基因表达差异3,9。本文中，我们引入了高灵敏度的定量聚合酶链式反应（PCR）分析方法，以进一步深入研究整合基因的表达差异。尤为重要的是，当前的安全位点标准会剔除携带病毒整合基因的hiPSCs，从而限制了这些细胞在后续人类细胞治疗中的应用9。我们提出，使用经过全面表征且无外源基因整合的内含子重编程hiPSCs，可能改变这一现状。此外，我们还介绍了一种稳健的符合GMP标准的细胞转化方案，该方案可广泛适用于多种最初在含异种成分条件下获得的细胞类型10。这为未来需要在临床级条件下进行、以保持人类治疗相关性的细胞重编程实验提供了重要机遇。
这些方法为当前的安全港标准提供了基础，可据此扩展标准，纳入那些在整合的内含子中切除STEMCCA后仍保持正常基因表达谱的特征明确的STEMCCA重编程人诱导多能干细胞（hiPSC）系。此外，完全转换至无非人动物抗原的临床级培养条件，将有助于纳入更多此前仅在含异种成分条件下完成重编程和特征鉴定的细胞类型。上述方法相结合，为美国食品药品监督管理局（FDA）提供了有力依据，促使其考虑将目前仅限于人胚胎干细胞（ESC）衍生治疗产品的有限批准范围，扩展至hiPSC衍生治疗产品11。
我们近期详细阐述了一种无外源因子的hiPSC细胞系的建立过程，该细胞系已得到全面表征，并已转换至拟临床级培养条件10。本文中，我们详细描述了利用STEMCCA慢病毒进行hiPSC诱导的实验方案。这些干细胞随后经历基因切除过程，并进行基因表达特征分析。最后，通过逐步转换的方法将hiPSCs过渡至GMP级培养条件。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;培养基与试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM/F12（基础培养基）</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸（NEAA），100倍浓缩液</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax，100倍浓缩液</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（PenStrep），100倍浓缩液</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>在 4 &amp;deg;C 下解冻，分装后于 &amp;minus;20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>无血清替代物（Knockout serum replacement）</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>在 4 &amp;deg;C 下解冻，分装后于 &amp;minus;20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA，0.5%</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>用 1× PBS 将原液稀释至 0.05%</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子</td><td>GlobalStem (Rockville, MD, USA)</td><td>GSR-2001</td><td>用含 0.1% 牛血清白蛋白的 1× PBS 溶解，配制成 10 &amp;micro;g/ml 储存液，并于 &amp;minus;80 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Millipore (Billerica, MA, USA)</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel（基底膜基质）</td><td>BD Biosciences (San Jose, CA, USA)</td><td>356231</td><td>冰上操作，将 Matrigel 原液用 DMEM/F12 稀释 10 ml，实现 1:2 稀释。分装后于 &amp;minus;20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>CELLstart（合成基质）</td><td>Invitrogen</td><td>A1014201</td><td></td></tr><tr><td>Stemmolecule Y27632</td><td>Stemgent (Cambridge, MA, USA)</td><td>04-0012-02</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Probes Master</td><td>Roche (Basel, Switzerland)</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>ProFreeze-CDM 培养基/冷冻保存液</td><td>Lonza (Basel, Switzerland)</td><td>12-769E</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 凝胶染料，10,000倍</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>明胶（来源于猪皮）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>用 PBS 配制成 0.2% 储存液，高压灭菌后室温保存。</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)</td><td>5850</td><td>将 5 倍浓缩补充剂与基础培养基混合，分装后于 4 &amp;deg;C 保存，最多可使用 2 周。</td></tr><tr><td>Stemedia NutriStem XF/FF 培养基</td><td>Stemgent</td><td>05-100-1A</td><td>在 4 &amp;deg;C 下过夜解冻，分装后于 4 &amp;deg;C 保存，最多可使用 2 周。</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen (San Diego, CA, USA)</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Accutase（解离试剂）</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>驴抗鸡 IgG AlexaFluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)</td><td>703-546-155</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺/转染试剂</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>VWR (West Chester, PA, USA)</td><td>29442-038</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688819</td><td></td></tr><tr><td>18 号针头</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>148265D</td><td></td></tr><tr><td>21 号针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>BD LSRII 流式细胞仪</td><td>KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 软件，版本 6.1.3</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂盒&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PureLink 基因组 DNA 小量提取试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K182000</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR 试剂盒</td><td>KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>High Pure RNA 提取试剂盒</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptor 第一链 cDNA 合成试剂盒</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Sialix anti-Neu5Gc 基础试剂盒</td><td>Sialix (Newton, MA, USA)</td><td>Basic Pack</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>混合培养基 1</td><td>StemCell Technologies 和 Stemgent</td><td></td><td>由等体积的 mTeSR1 和 Nutristem 组成</td></tr><tr><td>混合培养基 2</td><td>StemCell Technologies 和 Stemgent</td><td></td><td>由等体积的 TeSR2 和 Nutristem 组成</td></tr><tr><td>HUF 培养基</td><td></td><td></td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基/F12 [DMEM/F12]，添加 10% 胎牛血清、1× 非必需氨基酸、1× Glutamax 和 1× Primocin</td></tr><tr><td>人多能干细胞培养基</td><td></td><td></td><td>DMEM/F12 添加 20% 无血清替代物、1× Glutamax、1× 非必需氨基酸、1× Primocin、1× &amp;beta;-巯基乙醇和 10 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子。</td></tr><tr><td colspan="4">DMEM/F12：Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基/F12；PBS：磷酸盐缓冲液。</td></tr></tbody></table>

无外源基因人诱导性多能干细胞系的建立与表征及其向明确临床级条件的转化

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）可通过基于慢病毒的重编程方法获得。然而，由于潜在致癌基因可能在基因组的活跃转录区域中残留，限制了其在人类治疗应用中的潜力1。此外，源于干细胞重编程或分化为具有治疗意义的衍生物过程中的非人类抗原，也阻碍了这些hiPSCs在人类临床环境中的使用2。在本视频中，我们介绍一种重编程和分析无外源性转录因子且不含外源基因的hiPSCs的方法。随后可对含有慢病毒的特定内含子区域进行基因表达异常分析。该分析可采用高灵敏度的定量聚合酶链式反应（PCR）进行，相较于此前用于检测基因表达差异的低灵敏度技术具有优势3。完全转化为符合临床级良好生产规范（GMP）的条件，使这些细胞具备人类临床应用的相关性。我们的方案提供了另一种方法——前提是当前的安全港标准未来能够扩展并纳入无外源因子、经充分表征的hiPSC衍生物用于人类治疗应用——以获得GMP级hiPSCs，从而消除因非人类抗原引发的免疫原性风险。本方案广泛适用于任何类型的慢病毒重编程细胞，并提供了一种可重复的方法，将重编程细胞转化为GMP级条件。

我们介绍了一种利用基于STEMCCA慢病毒的重编程方法获得临床级无因子hiPSC的方案。图1A展示了在MEF饲养层上使用STEMCCA方法重编程后，三个不同未切除前hiPSC细胞系的代表性图像。STEMCCA重编程方法的主要优势在于，不同研究团队和不同地点的多位科研人员均能实现稳定且可重复的重编程效果。图1B展示了切除后的逆转录PCR凝胶结果，其中某一特定亚克隆（2.3）完全不含STEMCCA慢病毒，表现为缺乏针对STEMCCA内源性特异序列的扩增条带。图2A展示了在含异种成分基质上培养的重编程前hiPSC，以及在合成基质上培养的切除后无异种成分的GMP级hiPSC。通过qPCR对多能性相关标志因子（SOX2、OCT4和NANOG）进行定量分析的结果如图2B所示。如图2C所示，通过流式细胞术检测了重编程前及转化为GMP级条件后的hiPSC中唾液酸N-羟乙酰神经氨酸（指示非人源抗原的存在）的表达情况。
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我们描述了一种基于慢病毒的重编程方法，用于获得无外源因子的人类诱导性多能干细胞，并在疑似临床级条件下进行表征和转化。

人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）可通过基于慢病毒的重编程方法获得。然而，可能存在致癌风险的残留序列……

以下实验的总体目标是获得基于慢病毒的、无重编程因子的人诱导多能干细胞，并将这些细胞转化为具有潜在临床应用级别的状态。该目标首先通过使用单个大容量慢病毒干细胞表达盒（或称为 stem car）对成人皮肤来源的人成纤维细胞进行重编程，从而获得人诱导多能干细胞（HI PSCs）。随后，将重编程获得的 HI PSCs 暴露于腺相关病毒（adeno-associated virus），以实现 stem car 从宿主基因组中的完全切除和清除。随后，从无饲养层的HI PSCs中提取基因组DNA，并通过AgeI酶切分析验证干细胞因子的正确切除。最后，采用逐步转换方法将三因子H IPCs转化为完全明确的无异源成分的、拟GMP级条件。最终，通过对人成体皮肤成纤维细胞进行病毒载体介导的重编程，并将H IPCs完全转化为临床级条件，凸显了该方法在重编程成体人细胞并将其转化为临床适用条件方面的广泛适用性。该技术的意义在于推动人诱导性多能干细胞在临床中的应用，因为这些细胞完全无外源因子，并已转化为符合临床级标准的培养条件，因而适用于人类治疗。本方法的可视化演示至关重要，因为重编程因子的切除以及向临床级细胞的转化步骤操作复杂且流程精细，学习难度较高，必须严格遵循特定操作程序才能获得无外源因子且符合临床级标准的人诱导性多能干细胞。首先，在37°C水浴中解冻成人真皮来源的人成纤维细胞（HAFs），持续两分钟。注意不要将离心管顶部浸入水中。将一毫升细胞悬液转移至一个15毫升离心管中，以重悬细胞，并逐滴加入培养基稀释DMSO。缓慢加入四毫升预热的huff培养基，然后在室温下以200 × g离心10分钟。然后吸除上清液，收集新生细胞并重悬。将细胞重悬于培养基中，调整浓度至每毫升100,000个细胞，并接种于预先用0.2%明胶包被的六孔板中的一个孔内。加入两毫升细胞悬液，再向第二个孔中加入两毫升悬液。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中过夜培养前，为用于测定感染复数（MOI），需将培养板左右及前后轻轻摇动，使细胞均匀分布。24小时后，在计数细胞的同时，取出两份每份含有八次方转导单位（TU）的等效慢病毒浓缩液，用含8微克/毫升转染试剂的完全培养基将其稀释至每毫升含1×10⁸个转导单位（TU/mL）的浓度。以10的感染复数（MOI）比例对细胞进行转导。在慢病毒转导后约24小时，将转导孔中的液体混匀并过夜孵育。吸去huff培养基，更换为标准的人多能干细胞（PSC）培养基。在第2至第6天期间每天更换培养基。在第6天，将1.5至1.75 × 10⁶个来源于补体成分因子1（CF1小鼠）的鼠胚胎成纤维细胞接种到两个经0.2%明胶包被的10厘米培养皿中，使用半量培养基，在第7天进行培养。将室温的传代液加入一个六孔板的一孔中，该孔含有重编程的成纤维细胞。轻轻吹打使细胞脱落，以100 × g离心后，用新鲜的人类多能干细胞培养基将所有细胞以1:16的比例接种至两个10厘米的CFI基质胶包被培养皿中。以顺时针螺旋方式均匀分布细胞团，并在更换培养基前孵育约48小时。三到四周后，使用21号针头挑选8至10个具有典型胚胎干细胞样形态的单个克隆菌落，在扩增后将其分别传代至CFI MFS的各个孔中。在确认干细胞载体整合位点（如随附文本方案所述）后，通过拟胚体形成及标志物表达分析验证细胞的多能性。首先将旧的人PSC培养基吸除，加入3 mL标准PSC培养基，以切除干细胞载体。将45微升浓缩的腺病毒颗粒与8微克/毫升的转染试剂混合，然后加入细胞中，孵育24小时。孵育后，吸除病毒上清，使用人多能干细胞（hPSC）培养基洗涤细胞两次。随后，加入含有2微克/毫升嘌呤霉素的hPSC培养基，每天更换培养基。五天后，对剩余的克隆进行亚克隆，并按照视频中先前所述的方法进行扩增。接下来，将一管预冷的Eloqua基底膜基质置于冰上解冻，并用冷的基础培养基将其稀释至1:30的最终浓度。每孔加入1毫升，包被所需数量的6孔板孔，室温静置1小时。然后使用18号针头，从先前包被有mes的孔中至少挑取20至30个克隆，进行十字划线。注意尽量减少悬浮的基质并防止细胞从培养板上脱落。在孵育一小时后，使用200微升移液器吸除包被孔中的基质。通过轻轻刮取旧培养板上的克隆团块，将其转移至3毫升新鲜配制的培养基中，并将其中一份接种到已包被基质的培养板中。孵育48小时后，当切除后无饲养层的转化人诱导多能干细胞（HI PSCs）达到80%融合度时，每天更换培养基。使用商品化的DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并采用此处所示特异性针对干细胞慢病毒外源性整合的引物。通过PCR分析DNA，确认正确切除，从而将切除后的HI PSCs转入GMP级培养条件。将HPSC联合培养基一与符合临床级GMP标准的培养基或联合培养基二按80比20的比例混合，预热至37摄氏度。吸除细胞中的旧联合培养基一，更换为三毫升新的预热培养基溶液。连续三天每天更换培养基，按照文本方案进行传代，以维持适当的克隆大小和密度。在第四天，将培养基更换为等体积预热的联合培养基一和联合培养基二的混合液，继续培养三天。从第7天开始每天更换培养基，改为使用预热的培养基一和培养基二按20比80的比例混合的完全培养基，每天更换一次，持续三天。第10天时，更换为预热的100%混合培养基二，并每天更换。此时细胞已处于完全明确的无异源培养基中。接下来，使用一种明确的无异源成分基质包被六孔板的一个孔，然后将汇合细胞孔中的无异源培养基替换为含有1× Rock的新鲜培养基。在37°C孵育1小时后，使用18号针头通过机械方式将细胞切割并转移至新制备的孔中。让细胞在未受干扰的条件下孵育两天，以确保细胞充分贴壁，随后根据文本所述方案对细胞进行表征。该图展示了采用干细胞载体（stem car）方法在间充质层上重编程后，三种不同预先切除的H-I-P-S-C细胞系的代表性图像。图中所示为切除后的逆转录PCR凝胶结果，显示某一特定亚克隆完全不含干细胞载体慢病毒，证据是缺乏针对干细胞载体内源性特定序列的扩增条带。本图还展示了在含异种成分的基质上培养的前体转化IPC细胞，以及在合成基质上培养的切除后无异种成分的GMP级H IPC细胞，并通过QPCR对SOX2、OCT4和Nanog等标准多能性相关因子进行了定量分析。最后，如图所示，通过流式细胞术检测了在转换前、后将 HI PSCs 转化为 GMP 级别条件下的唾液酸和糖基神经氨酸，以确认是否存在非人类抗原。观看本视频后，您应充分掌握如何利用 Stemco 重编程病毒对人成体皮肤成纤维细胞进行重编程，将病毒从基因组中切除，并将这些 HI PSCs 完全转化为完全符合人类治疗应用的临床级别条件。请务必注意，操作 Staca（第三代抗病毒载体）可能存在极高危险性，必须采取相应防护措施。进行此操作时，应使用适当的个人防护装备（PPE）以及VSL二级加组织培养室。

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科研

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生物学

推导与表征的转基因无人类诱导多能干细胞系，并转换成定义的临床级条件

尽管基因修饰技术已取得近期进展，人类胚胎干细胞（HESCs）的转染仍是一个不稳定的过程。据我们所知，目前尚未有报道关于系统性且高效转染人类诱导多能干细胞（iPSCs）的方法。本文中，我们描述了高效转染和核转染人类iPSCs的可靠方案。...

转染和核转染人诱导性多能干细胞

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

我们介绍一种利用编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体，将人类体细胞高效重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC），并通过Tra-1-81抗体活细胞染色鉴定正确重编程的hiPSC的实验方案。...

从成人成纤维细胞重编程获得的人诱导性多能干细胞克隆的筛选与分离

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4...

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

本文介绍了我们已建立的利用仙台病毒将人类体细胞重编程为无外源基因的人类诱导多能干细胞的方法，该方法具有稳定的结果和更高的效率。...

利用仙台病毒高效制备人诱导性多能干细胞

关键词：人诱导性多能干细胞，体细胞，仙台病毒，重编程，干细胞培养

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

本方案描述了如何在无饲养层条件下，利用含重编程因子的基质胶和仙台病毒载体，从人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。...

利用仙台病毒在无饲养层条件下由人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞

在将诱导性多能干细胞（iPSCs）用于其他应用之前，常规鉴定这些细胞以确认其多能状态的维持情况，是一项重要的步骤。本文介绍一种专为通过免疫细胞化学方法对人iPSCs进行简便且常规鉴定而设计的小规模传代培养方法。...

无血清条件下小规模扩增人iPSC用于常规免疫细胞化学鉴定

本方案描述了在完全化学成分明确的条件下，利用非整合型附加体质粒方法将原代羊水及羊膜间充质干细胞重编程为诱导性多能干细胞的过程。详细介绍了细胞的提取、培养、重编程以及通过严格方法对所获得的诱导性多能干细胞进行表征的实验步骤。...

在无异种成分条件下将原代羊水及羊膜细胞重编程为多能性状态

通过使用非整合型仙台病毒（SeV）载体介导的皮肤成纤维细胞重编程，成功实现了人诱导性多能干细胞（hiPS细胞）的高效获得。hiPS细胞的维持和克隆扩增采用无异源成分且化学成分明确的培养条件，使用重组人源层粘连蛋白521（LN-521）基质和Essential...

使用层粘连蛋白521基质无整合方法建立人诱导多能干细胞

本文介绍了一种在无饲养层且无异源成分的条件下，由人多能干细胞精确诱导生成生血性内皮细胞的实验方案。该方法在疾病建模及治疗性化合物筛选方面具有广泛的应用前景。...

无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

学习利用慢病毒重编程成人皮肤成纤维细胞，获得无因子人诱导多能干细胞，并通过腺病毒Cre切除载体实现基因组无痕化，最终将其转换为符合GMP标准的临床级培养条件。

无外源基因人诱导性多能干细胞系的建立与表征及其向明确临床级条件的转化

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