在乳腺癌检测人类白细胞抗原生物标志物的利用无标记生物传感技术

该程序的总体目标是测量患者体液中的人类白细胞抗原或 HLA 相关肿瘤抗原，以便将患者分层至相关免疫治疗。这是通过首先将模拟抗体的 T 细胞受体（称为 TCRM）固定到 MICROPLATE 表面来实现的。第二步是添加患者样品以及靶肽 HLA 单体的连续稀释，以生成标准曲线，从而可以定量患者样品中的靶抗原。

接下来，监测靶抗原与游离标记生物测定系统上抗体的结合，直到达到平衡。最后一步是通过使用标准曲线来量化患者样本中靶抗原的量，从而分析所得数据。最终，无标记生物传感器技术用于检测患者样本中的癌症生物标志物。

与现有技术（如 lc MSS）相比，该技术的主要优点是能够快速、高通量检测 HLA 相关抗原。这允许将癌症患者快速分层到治疗方式，因为它确实可以作为生物标志物检测平台。虽然这种方法与癌症生物标志物的筛选有关，但该系统实际上适用于许多应用，包括基于细胞的检测、免疫表型混合筛选或小分子文库的筛选。

我们第一次想到这种方法是在开发治疗性 T 细胞受体模拟抗体时。我们问自己，我们将如何确定将从这种疗法中受益最大的患者？演示此程序的是 Kristen Dahl，她是我实验室的一名生物技术研究生。

首先在 28 摄氏度下预孵育磷酸盐缓冲盐水或 PBS，以最大限度地减少与温度相关的共振偏移。向 avadon 衍生物包被板的孔中加入 50 微升磷酸盐缓冲盐水或 PBS pH 7.2。接下来，打开 bioassay 扫描仪软件。

按照设置向导定义实验程序，包括在板布局中选择空白、标准品和样品、温度设置、每分钟扫描次数和实验长度。然后将准备好的检测板插入无标记生物检测扫描仪并开始第一次扫描。基线是在实验开始时收集的初始扫描集。

如果这是对该特定板进行的第一次读取，请让扫描仪运行足够长的时间以平衡温度并消除基线漂移。在基线稳定或至少扫描 5 次后，暂停读取并弹出板。倾倒 PBS，将 50 微升 RL 21（一种生物素化抗体）添加到板上除对照孔之外的所有孔中。

然后向对照孔中加入 50 微升 PBS。接下来，将板重新插入生物测定扫描仪并恢复读数，直到达到饱和。大约 1.5 小时后，暂停读取并弹出板。

然后用每孔 200 微升 PBS 加 0.05% Tween 20 或 PBST 洗涤板 3 次。洗涤后，用每孔 200 微升的 PBS pH 7.2 冲洗 3 次，不含洗涤剂。在进行下一步之前，将盘子中多余的 PBS 轻拍在纸巾上。

接下来，向所有活性孔中加入 50 微升 PBS。然后将板重新插入生物测定扫描仪并恢复读数以监测洗涤后共振。读取后，停止读取并弹出板。

添加分析物。去除 PBS 并在每孔中加入 50 微升的适当检测缓冲液用于该检测。将市售的正常人血清在 PBS 中稀释 1 至 20 倍。

接下来，打开 bioassay scanner 软件并按照设置向导进行作。要定义实验程序，请将板插入生物测定扫描仪并开始基线读数 基线稳定后或至少扫描五次后，暂停读数并弹出板。然后从孔中取出检测缓冲液。

然后在测定缓冲液中加入含有相关或不相关肽的 HLAA oh 2 0 1 单体，浓度范围为 0.625 至 10 μg/mL。然后将 50 微升标准品添加到板的对照孔中。接下来，将 50 微升分析缓冲液中的分析物添加到板的样品孔中。

对于该测定，使用加标的市售人血清。将板重新插入生物测定扫描仪并恢复读数，直到饱和后约 30 至 60 分钟达到饱和，暂停读数并弹出板。继续用每孔 200 微升的 PBST 洗涤板 3 次，然后像以前一样用每孔 200 微升的 PBS 冲洗 3 次，然后向所有活性孔中加入 50 微升的测定缓冲液。

现在将板重新插入生物测定扫描仪并恢复读数以监测洗涤后共振，然后停止读取并弹出板。最后，使用 bioassay scanner 软件分析数据或将原始数据文件导出到首选的统计分析软件。Bioassay 扫描仪软件根据实验设置期间提供的板布局自动生成结合曲线。

生物素化的 RL 21 A-T-C-R-M 或 IgG 两个 A 固定在 AVID AVIDAN 检测板上代表性结果显示，在平衡和洗涤后的患者血浆样品中检测到靶肿瘤抗原 F-L-S-L-H-L-A。IgG 二 A 用作非特异性结合组织切片的对照，用阳性对照和阴性对照染色。对于 RL 21，RL 21 A 对肿瘤组织进行染色证实了 F-L-S-L-H-L-A 复合物的呈型。

观看本视频后，您应该对如何使用模拟抗体的 T 细胞受体测量患者体液中的 HLA 相关生物标志物，以及在无标记生物测定系统上监测靶抗原与抗体的结合有一个很好的了解。在尝试此程序时，请务必记住在使用前孵育所有样品缓冲液，以避免温度峰值，并为每个步骤使用正确的样品缓冲液。