冲红灯光感受器原子力显微镜使用PeakForce定量纳米机械性能映射
2014年10月24日
该程序的总体目标是使用原子力显微镜收集感光蛋白的高分辨率图像。这是通过首先获得感光器样品并稀释来实现的。第二步是将蛋白质样品涂在新鲜裂解和干净的云母表面约 30 秒。
然后用缓冲液冲洗 MICA，以去除未结合和松散连接的分子。接下来，将样品连接到配备有适当探针的液体池上。此程序集将加载到扫描仪上。
用缓冲液填充液体池后，将尖端与样品接合并开始扫描。最终，原子力显微镜结合了峰值力。定量纳米力学性能映射用于收集样品表面单个感光蛋白的图像。
结合峰值力 q 和 m 的原子力显微镜可以回答分子生物学领域的关键问题，例如决定生物活性大分子功能的重要结构和化学特征是什么。与当前方法（如 NMR 和 X 射线晶体学）相比，该技术的主要优点是它可以在生物相关环境中获得完整蛋白质和其他生物大分子的高分辨率图像。通常，刚接触这种方法的人会遇到困难，因为探针和溶液的调整需要多个步骤，其中一些步骤非常复杂。
使用峰值力 q 和 m 以及自动化软件，其中几个步骤变得更加简单，从而使新用户和本科生的过程变得更加容易。演示此程序的是我研究实验室的三名本科生 Marie Kroger、Blair Sorenson 和 Jessica Thomas。这些学生将在明年攻读微生物学、化学工程和化学领域的研究生课程。
这些项目必须按特定顺序开启。首先是计算机，然后是控制器，最后是光纤灯。显微镜需要读取 FM 和 LF fm。
摄像机必须位于软件中的 FM 光学头的中心。应选择以下内容。实验类别是机械性能。
实验组为定量纳米力学映射，实验为流体中的峰值力 q 和 m。正确选择设置后，可以加载和设置实验。应首先使用 Z 物镜设置相机焦距，然后使用航向控件定位载物台，目标是将 A FM 头孔放置在载物台表面前一毫米处，以纵带有新切割的云母的样品盘带有圆形圆盘抓手镊子。
首先从经过原始清洁的部件组装流体池。首先，将软管适配器连接到清洁流体单元上的端口。然后非常轻柔地使用平头镊子，将 O 形圈压入流体单元上的凹痕中。
接下来在探针固定器夹上，轻轻按压弹簧并将其从凹槽中转出。使用相同的镊子夹住探针并将其滑入凹槽中，使尖端面向细胞中心。然后使用夹子固定探头。
下一步是检查 A FM.It 上的夹子必须完全缩回。将组件朝下放在样品顶部。将组件安装到 A FM 的螺柱上以实现稳定。
降低 clamp。要检查 O 形圈，请按下显微镜上的向下开关，直到看到 O 形圈。它应该在支撑盘和流体单元之间牢固地压缩。
可以使用粗调旋钮对流体单元进行聚焦。接下来，使用 XY 调整，专注于探针尖端。它看起来像一个金属金色的三角形。
现在使用向下的压线杆，将尖端移近样品表面，调整尖端的焦点、反射，并监测与该反射相关的悬臂位置。目前，它们应该紧密对齐，但不要完全重叠。现在，准备注射器。
用 1 毫升缓冲溶液填充并连接适配器。然后将注射器连接到弹出软管上，并完全伸展柱塞。接下来，使用适配器将软管连接到流体单元以填充腔室，轻轻按下柱塞，直到腔室中心充满。
不应有任何气泡或从液体池溢出到显微镜上。然后将注射器放在腔室上方支撑良好的位置。接下来，使用 Camera Feed 和 XY 平移旋钮。
要在屏幕上找到激光，它应该显示为一个漫射的红点。找到后，使用激光控制器将其移动到探头上。现在最后，调整激光和反射镜控制，直到显微镜上的和信号最大化到 4 到 6 之间，调整象限二极管。
接下来，使用扫描头上的旋钮调整垂直和水平偏转，直到显微镜上的值尽可能接近零。在继续之前，请务必选择适当的采集选项。在 samples per line 窗口中将扫描速率设置为大约 1 赫兹。
输入 256。对于扫描辅助自动控制。选择单个 对于扫描辅助自动 Z 限制，选择关闭。
Z 限制应为 500 纳米，扫描尺寸应为 1 微米。正确设置后，测量探头。观察探针尖端接近表面时的 Z 帕佐电压变化。
如果尖端超出范围、撤回并重新接近，则可能需要更换探头尖端。如果这不起作用，当使用笔尖时，每个采集窗口上都应该出现线条，这些线条将构建一个图像。开始连续捕获云母的图像。
慢慢放大以确保 MICA 表面既平整又干净。用冷冻成像缓冲溶液准备一个四室培养皿。每个腔室至少需要 5 毫升。
在取一份稀释的蛋白质之前，用微量移液器轻轻搅拌。然后取 200 微升等分试样，将稀释的蛋白质涂在 MICA 表面。等待大约 30 秒，让溶液驻留在表面上。
然后使用圆盘夹具，在不倾斜的情况下提起圆盘，并立即将其浸入第一个缓冲溶液池中。在一秒钟内，确保光盘与工作台保持平行。在冲洗步骤中，保持样品与培养皿平行非常重要。
这些柔软、灵活的分子会在表面被强大的水溶液电流扭曲。接下来，将光盘短暂浸入其他三个池中，每个池一秒钟。然后将光盘转移到干燥无尘的布上。
让多余的水分转移到布上，但不要让光盘完全干燥。不要让布接触样品 小心地用圆盘夹持器从布上取下样品，然后将样品放在 A FM 扫描仪上。将液体池放在样品顶部，然后进行设置和成像。
在完成探针的所有参数后，正确设置弹簧尺寸和尖端半径。像成像时一样测量探头。Micah，观察尖端接近表面时的 ZP 偶氮。
拍摄图像时，允许扫描仪至少连续两次对同一区域进行成像。使用连续拍摄来保存每张图像。根据需要调整图像大小和位置。
一旦自动化软件完成对特定图像大小的扫描参数的调整。将软件关闭以达到正常状态。调整图像的焦点，手动调整扫描速率、Z 限制、行数和设定点。
如果图像变得太不聚焦，请重新打开软件以返回到原始起始位置。放大蛋白质时，降低扫描速率并按比例增加行数，以提高图像的分辨率。后。在分析图像时，首先，通过单击展平图标来拼合图像。
选择第 0 个订单并执行作。有时需要使用平面拟合来获得适当的平面图像。选择平面适合图标，然后使用光标在图像中的平面区域上绘制平面。
执行平拟合并根据需要重复该作。接下来，选择横截面选项卡以测量蛋白质的尺寸。用光标在要分析的分子或区域上画一条线。
在多个区域中重复此过程。如果需要覆盖，可以使用 FM 研究任何数量的生物分子，用于光适应状态下的感光蛋白，新鲜切割的云母底物是适合蛋白质吸收的平面。使用峰值力 QNM 模式可观察到单个感光蛋白二聚体。
箭头指出单个二聚体，星号表示使用图像分析软件的蛋白质聚集体。图像展平后，可以测量蛋白质的横截面。XY 数据与高度测量值相关。
这些可用于各种计算。观看此视频后，您应该能够设置 A FM 实验，以在生物相关环境中收集表面蛋白质的高分辨率图像。使用峰值力 q 和 m一旦掌握，这项技术可以在大约三到四个小时内完成。
因此，峰值力 q 和 m 是向参加仪器分析、生物化学和现代物理学等实验室课程的本科生介绍的合适形式的原子力显微镜。经过开发，该方法为扫描探针显微镜领域的研究人员探索生物分子（如蛋白质、核酸，甚至生物相关介质中的活细胞）铺平了道路。
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概述
本文描述了一种使用原子力显微镜（AFM）来研究蛋白质光受体结构的方法。采用PeakForce定量纳米力学性质测绘（PF-QNM）技术来揭示云母表面的完整蛋白质二聚体。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 结构生物学
背景
- 蛋白质光受体在各种生物过程中扮演着至关重要的角色。
- 原子力显微镜允许对生物分子进行高分辨率成像。
- 了解这些蛋白质的结构可以提供对其功能的洞察。
- PF-QNM是一种增强AFM成像能力的新技术。
研究目的
- 收集光受体蛋白的高分辨率图像。
- 研究蛋白质二聚体的结构完整性。
- 展示PF-QNM在可视化蛋白质结构中的有效性。
使用的方法
- 光受体蛋白的样品制备。
- 在应用前对蛋白质样品进行稀释。
- 将样品应用于新鲜剥离的云母表面。
- 用缓冲液冲洗以去除未结合的分子。
主要结果
- 成功在云母上成像完整的蛋白质二聚体。
- 展示PF-QNM在纳米力学性质测绘中的能力。
- 揭示光受体结构细节的高分辨率图像。
- 验证该方法对未来蛋白质结构研究的适用性。
结论
- 该方法提供了一种可靠的研究蛋白质光受体的方法。
- PF-QNM增强了对蛋白质结构-功能关系的理解。
- 该技术可以应用于其他生物分子进行类似的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy with PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) enables high-resolution imaging of intact protein photoreceptors in biologically relevant environments, supporting target validation by revealing structural details of light-sensing proteins. This approach reduces reliance on crystallization and NMR, offering a label-free method to assess protein integrity and oligomerization states early in discovery. The automation via ScanAsyst software improves reproducibility and accessibility for screening applications, accelerating mechanistic de-risking of photoreceptor targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of protein dimerization and aggregation states to interrogate therapeutic hypotheses about photoreceptor function.
- Operational Value: Provides label-free, native-condition imaging that avoids artifacts from fixation or staining, supporting reliable target confirmation.
- Predictive Value: Supports assessment of structural stability and conformational changes under physiological buffer conditions, informing lead selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces quantitative nanomechanical maps (e.g., adhesion, deformation) that serve as functional readouts for compound-induced conformational shifts.
- Reproducibility: ScanAsyst automation minimizes user-dependent variability in probe tuning and scanning parameters, enhancing assay robustness.
- Scalability: Compatible with fluid imaging and routine mica preparation, allowing repeated use across multiple protein targets in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to photoreceptor proteins involved in optogenetics and circadian signaling pathways, linking structural insights to functional modulation.
- Preclinical Continuity: Enables structural validation of photoreceptor variants or mutants prior to cellular or in vivo testing.
- Mechanistic De-risking: Correlates nanomechanical properties with light-adapted states, reducing uncertainty in target mechanism before downstream investment.
Pipeline & Workflow Integration
PF-QNM fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing structural and mechanical data that inform early go/no-go decisions. It complements biochemical assays by adding direct nanoscale imaging of target engagement and oligomerization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on photoreceptor oligomerization and structural integrity in native-like conditions.
- Screening: Generates reproducible, quantitative topographical and mechanical outputs for assessing compound effects on protein structure.
- Analytics: Delivers height, adhesion, and deformation maps at each pixel, enabling multiparametric comparison of protein states.
- Translational Research: Bridges structural discovery to preclinical validation by confirming target integrity before functional assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable AFM workflow for diverse macromolecules, reducing revalidation effort across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target structure by resolving dimers and aggregates without crystallization.
- Operational Value: Automation via ScanAsyst reduces training burden and improves inter-user consistency.
- Strategic Value: Enables faster structural triage of targets, reducing time spent on low-confidence candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of protein quality and stability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, fluid cell handling, and protein surface chemistry.
- Depends on access to AFM systems with PeakForce QNM and ScanAsyst software, fluid cells, and probes suitable for biological samples.
- Necessitates standardization of sample dilution, mica preparation, and buffer conditions across users and labs.
- Involves adaptation considerations for different protein concentrations, surface treatments, and environmental conditions (e.g., pH, ionic strength).
- Limited by sample adhesion efficiency and potential tip-induced deformation on very soft samples, as noted in the need for parameter optimization.
