Name: 隔离和小鼠主动脉切除;心血管疾病研究的一个多功能的技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学习小鼠主动脉分离与切除技术，用于心血管疾病研究。该方法通过暴露胸腔腹腔、冷盐水灌注及显微解剖，获得完整主动脉样本，支持分子生物学与组织学分析。

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作者无致谢。

所有动物实验均经辛辛那提大学机构动物护理和使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 85-23，1996 年修订版）的规定。
1. 小鼠的准备
<ol>
	<li>通过给予动物过量的麻醉剂（吸入异氟烷至有效）实施安乐死。通过脚趾夹捏作为有害刺激来确认主要安乐死效果。次要安乐死方法（横膈膜切断）将在后续步骤中进行。也可使用其他方法，前提是能够实现安乐死。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒小鼠腹部区域的毛发（初始切口部位），直至湿润，使毛发浸湿乙醇，防止松散或干燥的毛发进入该区域。</li>
	<li>将小鼠仰卧位放置于手术板上，四肢自然向外伸展。</li>
	<li>使用手术胶带将四肢固定在手术板上。</li>
</ol>
2. 心脏和主动脉的分离
<ol>
	<li>将小鼠正确固定后，使用镊子定位并分离胸骨剑突下方的腹部皮肤。</li>
	<li>通过垂直向上提起皮肤制造张力，并用剪刀去除表层皮肤，暴露腹膜上部及胸腔下部。</li>
	<li>提起剑突，沿肋缘下方作横向切口，进入腹膜腔。</li>
	<li>向上解剖进入胸腔，穿过膈肌时需注意避免损伤心脏或任何主要血管。</li>
	<li>将步骤2.3中所作的侧向切口向头侧延伸，以移除肋骨前部。如有必要，使用钝性解剖法将心脏从胸壁前部游离。</li>
	<li>使用无菌纱布吸除多余血液和液体，清理胸腔。待视野清晰后，移除肺脏以更好地暴露心脏和主动脉。</li>
</ol>
3. 心脏与主动脉灌注
注意：若需通过心脏穿刺获取血液，应在执行此步骤前立即进行。
<ol>
	<li>用10毫升无菌冰浴的1×磷酸盐缓冲液（PBS）填充一支10 cc注射器，并在注射器上安装一根25号针头。</li>
	<li>将针头轻柔地插入心脏的左心室。</li>
	<li>剪开右心房以释放灌注过程中积聚的压力。在2至3分钟内将注射器中的液体灌注到小鼠体内。</li>
	<li>在右心房切口处使用无菌纱布吸收灌注液。</li>
</ol>
4. 主动脉的分离与切除
<ol>
	<li>灌流完成后，使用无菌纱布吸除胸腔内视野中残留的液体。</li>
	<li>沿腹壁向尾侧剪开，将切口延伸至耻骨上区域，以暴露腹腔内容物。随后双侧进一步向四肢方向延长切口，形成可固定或切除的皮瓣。</li>
	<li>移除肝脏、胰腺、胃、脾脏和肠道组织，以更清晰地暴露主动脉。在肾周区域解剖时需格外小心，因为肾动脉分支处的主动脉位置较浅。 
	注意：此步骤应精确且细致地进行，因胃肠道富含细菌，易增加污染风险。</li>
	<li>用1×PBS冲洗该区域，并用无菌纱布吸除所有液体。</li>
	<li>使用无菌显微剪刀和显微镊子，从背侧将主动脉与脊柱分离，从腹侧与食管分离。建议采用钝性解剖法，并配合使用解剖显微镜进行操作。 
	注意：在分离主动脉时，可从髂动脉分叉处（尾端）开始，向头侧逐步清理并分离主动脉与体腔背侧表面；也可从头臂干动脉和颈总动脉（头端）开始，向尾侧解剖。两种方法均可行，可根据研究人员的操作习惯选择。</li>
	<li>使用精细的显微剪刀去除血管周围脂肪组织，注意避免损伤主动脉壁。此步骤至关重要，可最大限度减少培养主动脉平滑肌细胞时成纤维细胞污染的风险。</li>
</ol>

<ol><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129 (3), 28-292 (2014).</li>
<li>Ross, R., Harker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperlipidemia+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hyperlipidemia and atherosclerosis.</a> Science. 193 (4258), 1094-1100 (1976).</li>
<li>Clouse, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+aortic+dissection%3A+population-based+incidence+compared+with+degenerative+aortic+aneurysm+rupture%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Acute aortic dissection: population-based incidence compared with degenerative aortic aneurysm rupture.</a> Mayo Clin Proc. 79 (2), 176-180 (2004).</li>
<li>Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).</li>
<li>Pleumeekers, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneurysms+of+the+abdominal+aorta+in+older+adults.+The+Rotterdam+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Aneurysms of the abdominal aorta in older adults. The Rotterdam Study.</a> Am J Epidemiol. 142 (12), 1291-1299 (1995).</li>
<li>Brophy, C. M., Reilly, J. M., Smit, G. J., Tilson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+inflammation+in+nonspecific+abdominal+aortic+aneurysm+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">The role of inflammation in nonspecific abdominal aortic aneurysm disease.</a> Ann Vasc Surg. 5 (3), 229-233 (1991).</li>
<li>Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+a+single+murine+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta.</a> Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).</li>
<li>Weiss, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+murine+cardiovascular+system+with+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging the murine cardiovascular system with magnetic resonance.</a> Circ Res. 88 (6), 550-551 (2001).</li>
<li>Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+culture%2C+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> J Vis Exp. (79), 50289(2013).</li>
<li>Wassef, M., Upchurch, G. R. Jr, Kuivaniemi, H., Thompson, R. W., Tilson, M. D. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+abdominal+aortic+aneurysm+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in abdominal aortic aneurysm research.</a> J Vasc Surg. 45 (1), 192-198 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

主动脉疾病可导致严重的全身性病理改变，在严重情况下甚至可能致死。目前的治疗选择有限，因此需要在该领域持续开展研究10。小鼠模型是进一步研究疾病进展及潜在治疗方案的理想工具4。因此，成功实施本文所述方法将为研究人员提供评估疾病进展和药物疗效的必要工具。
可通过多种方式对该技术进行改进，以优化实验结果。使用外科放大镜或解剖显微镜有助于观察小鼠的解剖结构和血管细节，并便于从主动脉上清除周围的脂肪组织。此外，针对特定操作使用专用的外科器械可延长工具的使用寿命；例如，使用一把剪刀用于剪开皮肤，另用一把剪刀剪断肋骨，效果更佳。心脏灌流时建议使用小口径针头，这样组织可在穿刺部位闭合；而使用较大口径针头则会留下孔洞，不易闭合。
主动脉成功取出后，可用于多种检测。主动脉可用于分子学研究，如酶活性、蛋白质表达和基因表达谱分析。此外，主动脉还可经固定后用于组织学分析，其中 原位 也可利用这些检测方法对主动脉形态进行表征。最后，可从新鲜收获的主动脉中分离平滑肌细胞和/或内皮细胞用于后续研究...

主动脉在心血管功能中起着关键作用，负责向全身输送含氧血液；与其他身体部位一样，主动脉也容易受到疾病影响。常见的主动脉疾病包括动脉粥样硬化和动脉瘤，这些疾病是遗传因素和环境因素（如饮食、吸烟和久坐生活方式）共同作用的结果1。动脉粥样硬化是指以钙质和脂质为基础的斑块在主动脉壁上沉积，通常出现在慢性高脂血症患者中2。动脉瘤的特征是主动脉结构成分的降解以及血管壁变薄，随后血管直径增大，最终可能导致破裂3。
动物模型是研究疾病机制和潜在治疗方法有效性的关键工具。在心血管研究中常用的动物模型，特别是用于研究血管和代谢性疾病的动物模型，包括通过基因修饰改变脂质水平的小鼠，例如载脂蛋白E基因敲除小鼠和低密度脂蛋白受体基因敲除小鼠4。大多数用于评估疾病机制和治疗效果的方法都包括主动脉的分离与切除。
一旦定位并分离腹主动脉，即可进行形态测量分析，例如动脉瘤的存在，通常定义为直径增大超过50%5. 在必要步骤之后 原位 分析完成后，可切除主动脉进行进一步分析。切除的主动脉可进行速冻，用于蛋白质和/或基因表达检测等分子生物学研究，或用4%多聚甲醛固定后，经包埋、切片和染色，用于组织学分析。主动脉的组织学分析可显示主动脉疾病的常见特征，如结构退化、斑块形成以及白细胞浸润6,7此外，可利用切除的主动脉分离原代细胞系，包括内皮细胞和平滑肌细胞，这些细胞随后可用于多种实验 体外 研究7.
目前尚无其他方法能够如此深入地表征主动脉疾病，同时也为研究人员提供进一步研究心血管疾病的工具。磁共振成像、计算机断层扫描和超声成像等影像学方法虽可对主动脉进行形态学评估，但在小型动物中实施较为困难，且具备足够技术性能的设备价格昂贵8。研究人员可购买永生化细胞系以探究疾病的潜在机制及治疗方案的有效性，但这些细胞的人工特性限制了其在细胞生命周期和凋亡效应研究中的应用9。
本论文的总体目标是展示在心血管疾病研究中无菌分离和切除小鼠主动脉的方法。

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>Med-Vet International</td><td>#RXISO-250</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Fisher</td><td>07-678-001</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>手术胶带</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>Dukal Corporations</td><td>1312</td><td></td></tr><tr><td>25 号针头</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠主动脉的分离与切除：心血管疾病研究中的一种多用途技术

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

心血管疾病是一个广义术语，用于描述心脏和/或血管的疾病。向全身输送含氧血液的主要血管是主动脉。主动脉可能受到动脉粥样硬化和动脉瘤等疾病的影响。研究这些疾病的科研人员若能直接观察主动脉，将有助于表征疾病的进展过程，并评估潜在治疗手段的有效性。本实验方案的目标是描述正确分离和切除主动脉的方法，以协助从事心血管疾病研究的科研人员。通过主动脉的分离与切除，研究人员可观察其宏观形态学变化，也可根据需要保存组织并进行染色，以观察组织学变化。主动脉还可用于分子学研究，以评估蛋白质和基因表达，从而发现感兴趣的靶点及作用机制。该技术优于成像手段，因为后者在技术和成本方面存在固有的局限性。此外，从新鲜分离并切除的主动脉中获取的原代细胞，可使研究人员进一步开展原位（in situ）和体外（in vitro）实验分析。主动脉的分离与切除技术需以牺牲实验动物为代价，但在此情况下，其益处远大于损害，因为这是研究主动脉疾病最通用的技术。

操作完成后，将可见一条完整的主动脉，起自心脏，向下延伸至胸腔和腹腔，且肾动脉仍附着于其上图1A）。由此可对主动脉进行成像 原位 用于量化在腹主动脉瘤研究中具有诊断意义的形态测量学变化（图1B 和 1C）。随后可取出主动脉，进行固定和染色，以观察其组织学变化。主动脉常用的常规染色方法是苏木精-伊红染色（图2A 和 2B）。此外，可通过Verhoeff van Gieson染色对弹力纤维带进行观察，从而对主动脉的结构完整性进行定性量化图 2C 和 二维）。研究者可选择将主动脉迅速冷冻，以用于后续蛋白质和核糖核酸表达分析，而非进行组织学分析。另一种选择是利用主动脉获取原代细胞进行分离。这些细胞可在体外培养（图3A）并用于多种用途 体外 包括活力检测的研究（图3B）以及蛋白质定位（图3C</s...

主动脉的病理变化可导致严重的发病率和死亡率，因此有必要对疾病进展及潜在治疗方法进行研究。本文介绍一种用于分离和切除小鼠主动脉的实验方案，以协助研究人员开展心血管疾病的相关研究。

心血管疾病是一个广义术语，用于描述心脏和/或血管的疾病。主要为身体提供含氧血液的血管是……

本实验的总体目标是无菌地分离并切除小鼠主动脉。首先暴露胸腔和腹腔，实现这一目标。第二步是用冰冷的无菌生理盐水进行灌注。接下来，移除胸腔和腹腔的器官，保留与主动脉相连的心脏。最后一步是切除主动脉周围的血管周围脂肪组织和外膜组织。最终，使用解剖显微镜确认所有周围组织均已清除干净，主动脉即可用于多种实验分析。因此，该技术有助于回答心血管研究领域中的关键问题，例如动脉瘤的形成以及动脉粥样硬化斑块的发生。可以通过观察分子生物学方面的变化（如基因和蛋白质表达）来研究这些问题。在处死小鼠后，通过脚趾夹捏法确认其死亡状态。接下来，用70%乙醇润湿腹部毛发以对皮肤进行消毒。然后将小鼠仰卧位固定在手术板上，四肢伸展。手术开始时，使用镊子定位剑突下方的腹部皮肤并将其分离。接下来，提起皮肤并用剪刀将其剪除。这将暴露腹膜的上部区域和胸腔的下部区域。然后使用镊子和剪刀提起剑突，并沿肋下缘在剑突稍下方进行横向切口。解剖胸腔时，应通过膈肌进入，注意不要损伤心脏或任何主要血管。随后沿肋下缘向头侧延长侧方切口，从而移除肋骨前部结构。可能需要钝性分离以将心脏从胸壁前部移除，从而完成这些切口。现在使用纱布清理胸腔内的多余液体，以便更方便地接触器官。然后使用镊子和剪刀逐叶移除肺部。此时应完全暴露心脏和主动脉，以便通过心脏穿刺采集血液。在进行灌流前立即执行此操作：用10毫升无菌冰浴的1×PBS填充一支10毫升注射器，然后安装一根25号针头。小心地将针头插入左心室。然后在右心房做一切口，以防止在下一步中循环系统内压力过高。接下来，在两到三分钟内，缓慢将注射器中的磷酸盐缓冲液（PBS）注入心脏。在喷出 PBS 时，使用无菌纱布吸收从切口处心房流出的液体。当 PERFUSE eight 全部喷出后，用纱布吸去残留的液体，以获得清晰的胸腔视野。为暴露胃肠道内容物，需穿过腹壁进行冷切，将切口延伸至耻骨上区域。随后，从该处向双侧下肢方向剪开，形成皮瓣，皮瓣可固定或切除。继续操作，移除多个器官，包括肝脏的各叶、胰腺、脾脏、肠道以及下段食管。这样即可暴露腹主动脉。在解剖肾周区域时需格外小心，因为该区域存在从主动脉发出至肾动脉的表浅分支。应精确且谨慎地进行此步骤的解剖操作，以防胃肠道细菌污染其他组织。用一份XPBS冲洗清理后的区域，并用纱布吸去多余液体，此时应可轻易暴露主动脉。随后使用剪刀和镊子将主动脉从脊柱上分离。钝性解剖是合适的方法，强烈建议使用解剖显微镜。主动脉的分离可从尾侧或头侧开始。重要的是有序地进行组织清理与分离操作。在分离血管周围脂肪组织时，应使用精细的显微剪刀将其去除，以避免损伤主动脉壁。这可以最大限度地减少培养主动脉平滑肌细胞时成纤维细胞污染的风险。仔细切除血管周围脂肪组织和外膜非常重要。任何残留的组织都可能造成细胞培养污染，同时也会影响分子检测结果的准确性。通过本方法可获得一段完整的主动脉，该主动脉

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本方案描述了对朗根多夫（Langendorff）方法的改进，包括主动脉插管的深度，以实现从成年小鼠中同时分离心房和心室肌细胞。...

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从小鼠颈动脉管腔中分离内皮细胞用于单细胞多组学实验

本方案提供了一种用于动脉粥样硬化斑块定量分析的综合方法，以促进对动脉粥样硬化机制及进展的深入研究。...

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