Name: 生产和使用慢病毒的有选择性地转导原少突胶质前体细胞在体外髓鞘测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学习利用慢病毒载体选择性转导原代少突胶质前体细胞的方法，用于体外中枢神经系统髓鞘形成研究。该技术可实现目标蛋白过表达，并通过蛋白质印迹和免疫染色评估髓鞘蛋白表达与轴突髓鞘化程度。

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本工作由澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC 奖学金 #454330 支持 JX，项目资助 #628761 支持 SM，APP1058647 支持 JX）、澳大利亚多发性硬化症研究基金会（MSRA #12070 支持 JX）、墨尔本大学研究资助支持计划以及墨尔本研究 CI 奖学金（支持 JX），以及澳大利亚研究生奖学金（支持 HP 和 AF）共同资助。&#160;我们谨此致谢澳大利亚维多利亚州创新、产业与区域发展部的运营基础设施计划。

<ol><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDGAs+interact+selectively+with+neuroligin-2+but+not+other+neuroligins+to+regulate+inhibitory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+exerts+contrasting+effects+on+peripheral+myelination+of+NGF-dependent+and+BDNF-dependent+DRG+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons.</a> J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).</li>
<li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Promotes+Central+Nervous+System+Myelination+via+a+Direct+Effect+upon+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes.</a> Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).</li>
<li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+and+BDNF+induce+a+switch+to+NMDA+receptor-dependent+myelination+by+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes.</a> PLoS Biology. 11 (12), e1001743(2013).</li>
<li>Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleitman%2C+N+%22Tissue+culture+methodes+for+the+study+of+myelination%22">Tissue culture methodes for the study of myelination</a>. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1%2F2+signaling+promotes+oligodendrocyte+myelination+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro.</a> J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).</li>
<li>Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglial+expression+of+TrkB+independently+regulates+myelination+and+progenitor+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+Characterization+and+Expression+of+miR-15a-3p+and+miR-15b-3p+in+Dairy+Cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2014).</li>
<li>Emery, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+gene+regulatory+factor+is+a+critical+transcriptional+regulator+required+for+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination.</a> Cell. 138 (1), 172-185 (2009).</li>
<li>Murai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptor+TLX+stimulates+hippocampal+neurogenesis+and+enhances+learning+and+memory+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).</li>
</ol>

作者声明本研究不存在利益冲突。

轴突的髓鞘化是脊椎动物中枢神经系统和周围神经系统发挥最佳功能的关键过程。髓鞘化轴突的生成与维持是一个复杂且协调的过程，涉及神经元、胶质细胞（来自施万细胞或少突胶质细胞）以及细胞外基质蛋白之间的分子相互作用。体内和体外髓鞘化实验均涉及多种细胞类型，因此该实验方案的重要性和应用价值在于，它能够在混合共培养体系中对特定细胞类型的蛋白质进行操控。使用非特异性的药理学工具来阻断特定蛋白质或信号通路的活性，无法明确揭示这些蛋白质从神经元或胶质细胞角度对髓鞘化过程的具体影响，除非该蛋白质仅由一种细胞类型特异性表达。因此，将体外髓鞘化实验与利用慢病毒特异性转导少突胶质前体细胞（OPCs）的方法相结合，使我们能够探究少突胶质细胞来源的蛋白质对髓鞘化的影响。我们已成功使用2K7慢病毒在少突胶质细胞中特异性过表达特定蛋白质，用于体外髓鞘化实验，以解析少突胶质细胞信号对中枢神经系统（CNS）髓鞘化的影响9。
为获得转导少突胶质前体细胞（OPC）中可重复的实验结果 体外 髓鞘化检测实验中，从克隆、...

轴突的髓鞘化对于中枢和外周神经系统中动作电位的快速高效传导至关重要。在外周神经系统中，由施万细胞（Schwann cells）在中枢神经系统中由少突胶质细胞（oligodendrocytes）这些特化的细胞环绕轴突并形成髓鞘，有效隔离神经纤维，促进跳跃式传导1髓鞘形成过程可以被研究 体外 使用视网膜神经节细胞2，工程化纳米纤维3，或与施万细胞共培养的背根神经节神经元4 或少突胶质细胞5-7。该 体外 髓鞘化检测是一种研究神经系统髓鞘化的成熟模型，可复制髓鞘化过程中发生的多种基本生物学过程 体内5-8该实验涉及将纯化的背根神经节（DRG）神经元与少突胶质前体细胞（OPCs，用于中枢神经系统髓鞘形成）或施万细胞（Schwann cells，用于外周神经系统髓鞘形成）共培养。在特定条件下，这些髓鞘形成细胞会以有序的、经超微结构验证的多层板状绝缘质膜包裹DRG轴突，并表达与体内相同的髓鞘特异性蛋白组合。 体内
研究中枢神经系统髓鞘形成的最常用细胞模型 体外 背根神经节神经元与少突胶质前体细胞的共培养体系，已被成功用于研究神经营养因子等外源性因素对中枢神经系统髓鞘形成的影响 体外5,6外源性因素，如生长因子或小分子药理学抑制剂，已被广泛用于通过背根神经节-少突胶质前体细胞共培养模型研究信号通路在髓鞘形成中的作用7,9然而，在同时包含神经元和少突胶质细胞的混合共培养体系中，生长因子或药理学抑制剂仍有可能对背根神经节（DRG）神经元和少突胶质细胞（OL）均产生作用。该双细胞体系提供了特异性解析仅由DRG或少突胶质细胞表达的蛋白质在髓鞘形成过程中所起作用的能力。为明确证实少突胶质细胞中的信号通路直接调控髓鞘形成，在将少突胶质前体细胞（OPCs）接种至DRG神经元之前，需对其进行慢病毒转导。 体外 髓鞘化检测实验已被证明是一种优雅的方法，可用于过表达野生型和突变型蛋白，以及通过少突胶质细胞敲低组成型表达蛋白的表达。因此，该方法为特异性探究和操控少突胶质细胞内的信号通路以研究髓鞘化提供了途径9,10.
本文报道了我们开发的一种通过慢病毒方法在少突胶质细胞中选择性过表达目标蛋白的技术，用于体外研究髓鞘形成。in vitro。该技术首先构建包含目标基因的表达载体，该基因可以是野生型、组成性活性或显性负性形式，随后将其克隆至pENTR载体（pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP）中。将此载体（含目标基因）、CMV启动子供体（pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV）以及2K7慢病毒载体在酶促反应中组合，生成含有CMV启动子、目标基因、内部核糖体进入位点和GFP的2K7载体（图1）。将此经Gateway克隆获得的2K7构建体与PMD2.G病毒包膜质粒及pBR8.91病毒包装质粒共同转染至HEK293T细胞，以产生慢病毒，随后可用于转导少突胶质前体细胞（OPCs）。一旦被慢病毒感染，OPCs即可高水平表达目标蛋白。然后可将这些OPCs接种于背根神经节（DRG）神经元培养物上，进而研究高水平表达目标蛋白对髓鞘形成的影响。通过蛋白质印迹分析检测共培养体系中髓鞘相关蛋白的表达，并通过免疫细胞化学观察髓鞘化轴突节段的形成情况。

<table><tbody><tr><td>2K7 慢病毒载体&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>由 Suter 博士惠赠&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>5-氟-2&amp;prime;-脱氧尿苷</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>F0503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 羊抗小鼠 IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115545205</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 羊抗兔 IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 羊抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 羊抗兔 IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 - NeuroCul SM1 神经元补充剂</td><td>干细胞技术公司&amp;nbsp;</td><td>5711</td><td></td></tr><tr><td>BDNF（人源）</td><td>Peprotech</td><td>PT450021000</td><td></td></tr><tr><td>生物素（d-生物素）</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>B6916-500ML&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>C0378-100G</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-13020</td><td></td></tr><tr><td>DAKO 荧光封片剂</td><td>DAKO</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含丙酮酸盐，不含谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>D5025-375KU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS，含钙、镁</td><td>Life Technologies</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>启动子和目的基因的入门载体</td><td></td><td></td><td>根据方案 1-2 制备</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>佛司可林&amp;nbsp;</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>F6886-50MG</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖（D-葡萄糖）</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Chem Supply</td><td>GL010-500M</td><td>参见储备溶液</td></tr><tr><td>羊抗小鼠 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005003</td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠 IgM&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005020</td><td></td></tr><tr><td>羊抗大鼠 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112005167</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>I3021-100ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素&amp;nbsp;</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>I6634&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td></td><td></td><td>参见储备溶液</td></tr><tr><td>LB-琼脂</td><td></td><td></td><td>参见储备溶液</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>C-7477</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 - 200 mM (100x) 液体</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus 酶</td><td>Life Technologies</td><td>12538-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM，非必需氨基酸，不含谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>10370088</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 &amp;alpha; &amp;beta;III 微管蛋白&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 &amp;alpha;MBP（单克隆）</td><td>Millipore</td><td>MAB381</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF（小鼠源）</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td></td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>&amp;nbsp;450-03</td><td></td></tr><tr><td>O1 抗体 - 小鼠抗 O1</td><td>Millipore</td><td>MAB344</td><td>若无法获得 O1 杂交瘤细胞，可作为替代</td></tr><tr><td>O1 杂交瘤细胞</td><td></td><td></td><td>用于免疫筛选的含抗 O1 抗体的条件培养基</td></tr><tr><td>O4 抗体 - 小鼠抗 O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>若无法获得 O4 杂交瘤细胞，可作为替代</td></tr><tr><td>O4 杂交瘤细胞</td><td></td><td></td><td>用于免疫筛选的含抗 O4 抗体的条件培养基</td></tr><tr><td>感受态细胞</td><td>Life Technologies</td><td>A10460</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl 感受态细胞</td><td>Life Technologies</td><td>C7373-03</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶悬浮液</td><td>Worthington/Cooper</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>pBR8.91</td><td></td><td></td><td>由 Denham 博士惠赠&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>PDGF-AA（人源）</td><td>Peprotech</td><td>PT10013A500&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 100x 溶液</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pENTRY4IRES2GFP</td><td>Invitrogen</td><td>11818-010&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>西格玛</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）&amp;nbsp;</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸&amp;nbsp;</td><td>西格玛-奥德里奇&amp;nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>孕酮&amp;nbsp;</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片剂（Complete mini）</td><td>罗氏</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td></td><td></td><td>随 Clonase 酶提供</td></tr><tr><td>腐胺</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>兔 &amp;alpha; 神经丝蛋白</td><td>Millipore</td><td>AB1987&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>兔 &amp;alpha;MBP（多克隆）</td><td>Millipore</td><td>AB980</td><td></td></tr><tr><td>Ran2 杂交瘤细胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-119</td><td>用于免疫筛选的含抗 Ran2 抗体的条件培养基</td></tr><tr><td>大鼠抗 CD140A/PDGFRa 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>558774</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>NEB</td><td>R0157</td><td></td></tr><tr><td>SOC 培养基</td><td></td><td></td><td>随感受态细菌提供</td></tr><tr><td>亚硒酸钠&amp;nbsp;</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶缓冲液</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液 pH8</td><td></td><td></td><td>参见储备溶液</td></tr><tr><td>TNE 裂解缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量元素 B</td><td>Cellgro&amp;nbsp;</td><td>99-175-CI</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白（人源脱铁转铁蛋白）</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>T9284&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>鸡蛋清胰蛋白酶抑制剂</td><td>罗氏</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (1x)，含酚红 (0.05%)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>未结合的裂叶山扁豆素 BSL-1</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>尿苷</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

慢病毒的制备与应用：选择性转导原代少突胶质前体细胞 体外 髓鞘化检测

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

髓鞘形成是一个复杂的过程，涉及神经元以及形成髓鞘的胶质细胞，后者在中枢神经系统（CNS）中为少突胶质细胞，在周围神经系统（PNS）中为施万细胞。我们使用一种 体外 髓鞘化检测，一种研究中枢神经系统髓鞘化的既定模型 体外为此，将少突胶质前体细胞（OPCs）添加至纯化的原代啮齿类动物背根神经节（DRG）神经元中，以建立可形成髓鞘的共培养体系。为了特异性地研究少突胶质细胞所表达的特定蛋白质在髓鞘形成过程中发挥的作用，我们开发了一套实验方案：在将OPCs接种到DRG神经元之前，利用慢病毒选择性地转导这些细胞，使其过表达野生型、组成型活性或显性负性蛋白。该方法使我们能够特异性地探究这些少突胶质细胞蛋白在调控髓鞘形成中的功能。该技术方案也可应用于其他细胞类型的研究，从而提供一种可选择性操控特定细胞类型（如少突胶质细胞）所表达蛋白的策略，用于靶向研究信号通路及代偿机制。综上所述，结合 体外 利用慢病毒感染的少突胶质前体细胞进行髓鞘化检测，为分析参与髓鞘形成过程的分子机制提供了一种有效的研究工具。

用于慢病毒生产的带有标签的细胞外信号调节激酶1（Flag-Erk1）构建体，通过限制性酶切对所用构建体进行验证，包括2K7构建体以及病毒生产所需的包装和辅助构建体（图3）。
<img alt="显示DNA片段分离的凝胶电泳结果；标签：pBR8.91、pMDG2、2K7-GFP、2K7-Flag-Erk1。" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：DNA构建体的验证。用于慢病毒生产的全部DNA构建体均从Stbl3细菌中提取纯化，并通过限制性酶切进行验证。如图所示，辅助载体和包装载体使用NcoI和EcoRI进行酶切，并与未切割的质粒进行比较(A)。2K7-GFP使用SpeI和SacII进行酶切(A)。2K...

本文介绍了一套灵活且具有策略性的实验方案，可通过病毒载体操控少突胶质前体细胞，使其过表达目标蛋白，从而特异性地探究这些蛋白在少突胶质细胞中的功能 体外 中枢神经系统髓鞘形成模型

髓鞘形成是一个复杂的过程，涉及神经元以及形成髓鞘的胶质细胞，即中枢神经系统（CNS）中的少突胶质细胞和……

本实验的总体目标是利用病毒操控少突胶质前体细胞（OPCs），使其过表达目的蛋白。为实现中枢神经系统髓鞘化体外研究，首先需构建慢病毒载体，随后进行慢病毒的生产，并确定实验所需的最优病毒感染浓度。随后，将分离并培养的少突胶质前体细胞（OPCs）用慢病毒进行转导。最后一步是将转导后的OPCs接种到从背根神经节（DRG）分离并培养的神经元上。最终，通过蛋白质印迹分析检测髓鞘化共培养体系中髓鞘相关蛋白的表达，并通过免疫染色观察髓鞘化轴突节段的形成情况。与药理学工具等现有方法相比，该技术的主要优势在于，慢病毒方法可使我们选择性地在目标细胞类型（例如本实验中的少突胶质细胞）中过表达野生型或突变型蛋白。实验准备：按照文本方案中所述，克隆所需的2K7慢病毒载体；在转染当天上午，于含25毫升培养基的T175培养瓶中接种3200万个HEK293T细胞。关键步骤：这些细胞在转染前必须处于贴壁状态，因此如有需要应提前接种。在50毫升Falcon管中，按照表1详述的配方，为T175培养瓶的转染配制主混合液：先将DNA加入预热的DMEM中并涡旋混匀，最后加入无菌PEI，以避免过早形成沉淀。轻轻倒置离心管三到四次以充分混匀，然后在室温下孵育约15分钟。更换细胞培养基后，加入转染混合物。将培养基在细胞表面逐滴加入，轻轻混匀，随后将细胞置于培养箱中过夜孵育。次日。可通过荧光显微镜检测 GFP 表达。转染后 48 小时，收集第一批次病毒上清液，并向细胞中加入 25 毫升新鲜培养基。将病毒上清液在4°C条件下以1,140 ×g离心10分钟。将不含细胞碎片沉淀的病毒上清液转移至新管中，并在4°C下保存。转染后72小时的次日，收集最后一批发酵的病毒上清液，离心去除细胞碎片，并与第一批发酵澄清的病毒上清液合并。然后通过超速离心浓缩病毒，在4摄氏度下，以170,000 G离心病毒上清液90分钟。卸载超速离心机后，倒掉上清液，留下沉淀的PEI和病毒，其在30毫升管底部不可见。重复此步骤。将所有病毒上清液分批加入相同的 30 毫升离心管中，通过离心浓缩病毒，以重悬每根超速离心管中的病毒。加入 500 微升 Sato 培养基，并用封口膜封住管口。然后涡旋振荡离心管30秒，并用移液器吸头通过机械方式使沉淀物脱离管壁。重复此涡旋和脱离操作约六次，以确保沉淀物完全重悬于Sato培养基中。现在将所有重悬于Sato培养基中的病毒合并至一个新的微量离心管中。将混合的上清液在最大转速下短暂离心一分钟。为沉淀PEI，随后收集含有病毒的上清液，并使用注射器将溶液通过0.45微米滤器过滤以完成操作。将纯化后的病毒分装至Sedia中，体积分别为2050和100微升，并全部于负80摄氏度保存。本实验方案需准备原代少突胶质细胞前体细胞（OPCs），将细胞接种于10厘米培养皿中，加入10毫升含有以下生长因子的培养基：C-N-T-F-P-D-G-F-N NT 3，细胞需在8%二氧化碳条件下培养24小时。首先进行培养基的吸除，并彻底移除。然后用含有生长因子的相同培养基 10 毫升替换。将表达目标蛋白的慢病毒以所需体积逐滴加入培养基中，感染少突胶质前体细胞（OPCs）。同时，在另一块 OPC 培养板中，将仅表达 GFP 的对照慢病毒加入培养基中，继续培养细胞 48 小时。然后从培养板中收集少突胶质前体细胞（OPCs），用于接种到培养的GRG神经元上。首先用8毫升EBSS将每块培养板冲洗两次。将1毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA与9毫升预热的EBSS混合配制。向每块培养板中加入五毫升稀释后的胰蛋白酶。在37摄氏度孵育最多两分钟。通过加入五毫升含30%胎牛血清的平衡盐溶液（EBSS）来中和胰蛋白酶。然后使用10毫升移液管将少突胶质前体细胞（OPCs）从培养板表面冲洗下来。每次将培养板旋转四分之一圈，以收集所有细胞。将细胞悬液转移至15毫升离心管中。在室温下以180 ×g离心15分钟。随后吸除上清液并重悬。将细胞沉淀重悬于1毫升不含生长因子的温热saddo培养基中，并对细胞进行计数。接下来，通过完全吸除培养板中的培养基，准备培养在22毫米盖玻片上的背根神经节（DRG）神经元。然后将200,000个少突胶质前体细胞（OPCs）以滴加方式轻轻接种到每个盖玻片上。每个盖玻片的接种体积必须少于200 µL。静置细胞，不要移动培养板。10分钟后，向每个孔中加入1毫升含生长因子的温热s omed。现在可将剩余的姐妹OPC重新培养。由于s omed中含有生长因子，这些细胞可后续用于验证目的蛋白的表达。一种带有标签的细胞外信号调节激酶。其中一个构建体用于慢病毒生产，使用限制性内切酶验证包装构建体和辅助构建体，以确定在少突胶质前体细胞（OPCs）上使用的最佳病毒稀释度。IR1型慢病毒在HEK 293T细胞中进行滴定，测试一系列病毒稀释浓度对HEK 293T细胞的影响。目的基因的表达水平随时间延长而升高。随后，将纯化的少突胶质前体细胞（OPCs）进行感染并培养至少两天，以确保外源基因的表达。在 Sister OPCs 中验证了 FLAG 和 GFP 的表达水平。随后将少突胶质前体细胞（OPCs）接种到背根神经节（DRG）神经元上。OPCs随后分化为少突胶质细胞，并通过Western印迹检测发现其开始表达髓鞘蛋白。部分成熟的少突胶质细胞形成髓鞘，通过MBP染色可观察到这一现象；轴突则用神经丝蛋白或βIII微管蛋白进行染色，以确保在分析中考虑了轴突的密度。在接种 OPCs 后，分析髓鞘化水平时，培养至关重要。需要培养姐妹 APCs。这样，如果在共培养中无法验证目的蛋白或目的蛋白上的标签表达情况，可以在姐妹 APCs 中进行验证。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

生产和使用慢病毒的有选择性地转导原少突胶质前体细胞在体外髓鞘测定

我们介绍一种基于小分子的方案，用于将小鼠胚胎干细胞分化为少突胶质前体细胞（OPCs）。该方案可在30天内高效地生成Olig2+NG2+的OPCs。我们还描述了一种生成“可放电”OPCs的方法，这类细胞能够产生动作电位。...

胚胎干细胞向少突胶质细胞前体的分化

本文描述了一种从造血干细胞/祖细胞体外生成成熟人红细胞的 ex vivo 实验方案。此外，我们还介绍了一种高效的慢病毒递送方法，用于在原代红系细胞中敲低转录因子 TAL1。通过表达 GFP...

慢病毒介导的基因敲低过程 离体 人类造血干细胞的红细胞生成

在此方案中，我们描述了慢病毒载体的制备、纯化及滴定方法。我们以原代培养的神经元和星形胶质细胞中慢病毒载体介导的基因递送为例进行了说明。本方法也可适用于其他细胞类型 体外 和 体内.

用于转导中枢神经系统细胞的慢病毒载体的制备

该视频展示了一种将少突胶质前体细胞（OPCs）分化为少突胶质细胞，并在与背根神经节（DRG）神经元共培养体系中诱导髓鞘形成的实验方案。OPCs通过编码调控髓鞘形成的信号蛋白的慢病毒载体进行转导。转导后的OPCs与DRG神经元共培养，以评估其向少突胶质细胞的分化情况以及信号蛋白诱导的髓鞘形成能力。...

少突胶质前体细胞体外转导诱导髓鞘化检测方法

少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞。本方案描述了一种从大鼠大脑皮层分离和培养其前体细胞——少突胶质前体细胞的方法，以及一种快速、可靠的定量评估少突胶质细胞生成的方法 体外...

大鼠少突胶质细胞前体培养物的制备及利用双红外荧光扫描定量少突胶质生成

我们描述了原代小鼠少突胶质细胞的免疫磁珠分离方法，该方法可快速、特异性地分离出细胞用于 体外...

小鼠原代少突胶质细胞的快速特异性免疫磁珠分离

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。...

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

基于体外慢病毒工程技术对神经前体细胞进行改造，并将其共移植到野生型大脑中，结合对“实验”和“对照”衍生细胞的配对形态测量学分析，该方法能够以简单且经济的方式精确模拟体内基因对新皮层神经元形态的调控。...

用于体内神经结构研究的工程化神经前体细胞脑室内移植

由于缺乏足够的工具和方法，神经退行性疾病中神经元与胶质细胞之间的相互作用尚未被充分理解。在此，我们描述了从人多能干细胞获得诱导神经元、少突胶质前体细胞以及少突胶质细胞的优化方案，并举例说明这些方法在理解阿尔茨海默病中细胞类型特异性贡献方面的应用价值。...

由多能干细胞生成人神经元和少突胶质细胞以模拟神经元-少突胶质细胞相互作用

多能干细胞, 神经元, 少突胶质细胞, 细胞分化, 神经发育, 共培养, 神经退行性疾病, 人源细胞模型, 髓鞘形成, 神经胶质生物学

利用低成本的阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI），我们高效地制备了用于在H9人胚胎干细胞（hESCs）中稳定表达shRNA的慢病毒颗粒，并实现了对H9来源的神经前体细胞（NPCs）的高效瞬时转导。...

利用低成本阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）通过慢病毒介导将shRNA递送至人胚胎干细胞和神经前体细胞

学习利用慢病毒载体选择性转导原代少突胶质前体细胞的方法，用于体外中枢神经系统髓鞘形成研究。该技术可实现目标蛋白过表达，并通过蛋白质印迹和免疫染色评估髓鞘蛋白表达与轴突髓鞘化程度。

慢病毒的制备与应用：选择性转导原代少突胶质前体细胞体外髓鞘化检测

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慢病毒的制备与应用：选择性转导原代少突胶质前体细胞 体外 髓鞘化检测

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