Name: 造型粘膜念珠菌在斑马鱼幼虫通过鳔注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 了解利用斑马鱼幼鱼建立粘膜念珠菌病模型的方法。通过向鳔内注射白色念珠菌，结合共聚焦显微镜实时观察病原体与免疫系统的动态相互作用，为真菌免疫学研究提供高分辨率成像平台。

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作者感谢Le Trinh博士和Tobin博士慷慨提供α-连环蛋白:citrine斑马鱼品系，以及Bill Jackman允许我们在其实验室进行拍摄。作者感谢美国国立卫生研究院（资助号：5P20RR016463、8P20GM103423 和 R15AI094406）和美国农业部（项目号：ME0-H-1-00517-13）提供的经费支持。本论文作为缅因州农业与林业实验站第3371号出版物发表。

注意：所有斑马鱼饲养方案和实验均依照机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议 A2012-11-03，在符合美国国立卫生研究院（NIH）指南的前提下进行。
1. 斑马鱼饲养至受精后4天
<ol>
	<li>在受精后3小时内收集AB系斑马鱼或其他任何转基因品系，具体方法如另一视频所示34。</li>
	<li>将120枚胚胎置于含有150 ml E3培养基（5 mM NaCl；0.17 mM KCl；0.33 mM CaCl2；0.33 mM MgCl2；2 mM HEPES；pH 6.8）的15 cm培养皿中，并加入亚甲蓝（终浓度0.3 μg/ml），在33 °C、12小时光照/12小时黑暗光周期条件下培养。</li>
	<li>6小时后更换培养基为E3 + PTU（1-苯基-2-硫脲，终浓度10 μg/ml），并移除死亡胚胎。</li>
	<li>在33 °C继续培养4天，每2天更换一次新鲜的E3 + PTU培养基。</li>
</ol>
2. 注射用微针制备
<ol>
	<li>使用拉针仪将硼硅酸盐毛细管（外径 1.2 mm；内径 0.69 mm）拉制成微针，拉针仪参数设置如下：550 加热；0 拉力；130 速度；110 时间。 
	注意：为获得形状相似的微针（见图1），不同灯丝所需参数可能不同，每次更换灯丝后均需重新调整参数。</li>
	<li>使用 20 μl 微载样枪头，将 3 μl 经 0.4 μm 滤膜过滤的磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl；2.7 mM KCl；10 mM Na2HPO4；1.8 mM KH2PO4；pH 7.4）吸入微针中。</li>
	<li>将微针安装至连接于压力注射系统的显微操作器上的微移液管固定器中。设定注射压力为 30 PSI，脉冲持续时间为 30 毫秒。</li>
	<li>在培养皿中加入蒸馏水，将微针缓慢下放至其长度的 1/5 浸入水中。使用精细镊子在液面下方剪断微针。将微针从水中取出，并多次踩下脚踏开关，直至出现液滴团块（bolus）。</li>
	<li>将微针缓慢下放至滴有一滴 A 型浸油的血细胞计数板上，测量液滴团块的直径。调节脉冲持续时间以获得所需体积（见表1）。</li>
	<li>调节反向压力，使液滴团块在油中保持稳定（若团块体积增大则降低压力，若体积减小则提高反向压力）。记录每根微针对应的脉冲持续时间。</li>
	<li>使用微载样枪头回吸微针中的 PBS，并将微针重新装回注射装置，打开连续脉冲开关以排出残留 PBS。将每根微针单独保存备用。</li>
</ol>
3. Candida 的制备
<ol>
	<li>使用无菌木棒从冷冻保存的菌种（-80 °C 甘油保存液，含 25% 甘油）中划线接种表达密码子优化的 dTomato、GFP、BFP、EOS 或远红荧光蛋白的Candida albicans至酵母浸膏蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂平板（每升含 10 g 酵母提取物、20 g 蛋白胨、20 g 葡萄糖、20 g 琼脂；经高压灭菌后，每皿倒入 25 ml 培养基于培养皿中），于 30 °C 培养过夜。</li>
	<li>使用无菌木棒挑取单个菌落，接种至 5 ml YPD 液体培养基（每升含 10 g 酵母提取物、20 g 蛋白胨、20 g 葡萄糖；经高压灭菌后，无菌分装至 16 x 150 mm 玻璃培养管中，每管 5 ml）中。</li>
	<li>于 30 °C 摇床培养器中以 60 rpm 转速振荡培养过夜。</li>
	<li>取 1 ml C. albicans 培养物，转移至 1.7 ml 无菌离心管中。</li>
	<li>以 5,000 × g 离心数秒，弃上清液，加入 1 ml 无菌 PBS，充分涡旋混匀。重复此洗涤步骤两次。</li>
	<li>用血细胞计数板对菌液进行计数，方法是将 1 ml 菌液用无菌 PBS 按 1:1,000 比例稀释后计数。</li>
</ol>
4. 在斑马鱼的 swimbladder 中注射
<ol>
	<li>将注射用培养皿（含2%琼脂糖）置于33 °C培养箱中预热30分钟。</li>
	<li>在预定时间，使用25 ml移液管从含有待注射斑马鱼的15 cm培养皿中移除100 ml的150 ml E3 + PTU溶液，注意不要吸走任何斑马鱼。</li>
	<li>通过向剩余50 ml培养基中加入2 ml浓度为4 mg/ml的缓冲三卡因甲磺酸盐储备液（TR），使终浓度达到200 μg/ml，以麻醉4 dpf斑马鱼，并静置15分钟。</li>
	<li>在解剖显微镜下，挑选具有充气 swimbladder（鳔）的斑马鱼。此时也可使用落射荧光解剖显微镜筛选表型均一的个体，例如在mpo:GFP品系中观察中性粒细胞的分布情况。</li>
	<li>将C. albicans菌液储备液（来自步骤3.8）用PBS稀释至每毫升含1.5 × 107个菌落形成单位（cfu/ml）。</li>
	<li>使用塑料转移移液管将30条斑马鱼转移至注射用培养皿中，并去除多余培养基。</li>
	<li>使用钓鱼线工具（将直径0.012英寸的钓鱼线用快干胶固定于硼硅酸盐毛细管内），将培养皿垂直持握，使鱼体呈垂直排列，制作三排每排10条鱼的阵列。</li>
	<li>去除多余培养基。</li>
	<li>将含有1.5 × 107 cfu/ml C. albicans的离心管充分涡旋振荡。</li>
	<li>使用新的微量进样器吸头吸取3 μl C. albicans菌液装入一根显微注射针，并将脉冲持续时间设定至适当参数（参见步骤2.9）。</li>
	<li>旋转注射用培养皿，使显微注射针与鱼头之间呈20°角，针尖对准swimbladder（鳔）后部（图3A）。</li>
	<li>将显微注射针插入swimbladder（鳔）内，确保针孔位于腔内，然后踩下脚踏开关一次。</li>
	<li>对每条鱼重复上述操作，随后通过向培养皿中加入E3培养基并倾倒入恢复培养皿（含25 ml E3 + PTU）的方式转移鱼体。</li>
	<li>将另外30条斑马鱼转移至注射用培养皿中。</li>
	<li>使用一根新的、装有充分涡旋振荡后的C. albicans菌液的显微注射针重复注射过程。</li>
	<li>如有必要，最后使用另一套注射用培养皿注射PBS对照组，以避免污染，并将对照组转移至独立的恢复培养皿中（步骤4.10）。</li>
</ol>
5. 筛选具有理想接种物的鱼类
<ol>
	<li>通过将160 mg低熔点琼脂糖加入40 ml E3溶液中，微波加热至溶解，制备40 ml 0.4%低熔点琼脂糖溶液（LMA），然后冷却至37 °C。待冷却后加入400 μl TR（终浓度为200 μg/ml）。</li>
	<li>经过30分钟恢复后，按照所述方法麻醉斑马鱼（步骤4.3，仅使用1 ml TR加入25 ml E3 + PTU中，终浓度为200 μg/ml）。</li>
	<li>将30条斑马鱼（尽量减少携带培养基）转移至称量皿中的2 ml LMA中。</li>
	<li>用移液管吸取单条斑马鱼，并将每条鱼连同1滴LMA接种到96孔成像板中，仅使用中央10 × 6区域的孔。</li>
	<li>重复此操作，直至所有待筛选的斑马鱼均接种至成像板。</li>
	<li>在室温下静置5分钟，使培养基凝固。</li>
	<li>将斑马鱼侧放，确保其与玻璃底面接触。</li>
	<li>使用倒置落射荧光/共聚焦显微镜的20倍物镜及相应滤光片，记录每条斑马鱼鳔内C. albicans酵母细胞的数量。</li>
	<li>选择鳔内含有15–25个酵母细胞（或目标接种量）的斑马鱼，对未选中的斑马鱼实施安乐死（使用含800 μg/ml TR的E3溶液），并将选中的斑马鱼通过向成像板中选定孔加入3滴E3，再用塑料移液管吸取的方式，转移回盛有50 ml E3 + PTU的深型培养皿中。</li>
	<li>在33 °C下孵育所需时间。</li>
</ol>
6. 筛选后鱼类成像
<ol>
	<li>在预定时间，从含有待成像鱼的培养皿中移除 25 ml 的 50 ml E3 + PTU 培养基。</li>
	<li>按照所述方法麻醉鱼（步骤 4.3，仅使用 1 ml TR 加入剩余的 25 ml E3 + PTU 中，终浓度为 200 μg/ml）。</li>
	<li>将鱼转移至 96 孔成像板中，并按适当方式定位（步骤 5.3 - 5.7）。</li>
	<li>使用合适的激光器和发射滤光片，通过扫描共聚焦显微镜进行成像。首先在微分干涉差（DIC）模式下使用 4X 物镜对鱼进行聚焦，然后使用 20X 物镜在扫描模式下以 2 μsec/像素的速度和 1024 x 600 像素的分辨率采集目标区域的图像。以 1 μm 的步长采集 Z 轴层扫图像，并应用 3 帧的卡尔曼滤波模式。</li>
	<li>将鱼放回含有 50 ml E3 + PTU 的培养皿中，或放入单独的孔中（24 孔培养板，每孔 3 ml E3 + PTU），于 33 °C 下孵育。</li>
</ol>
7. 解剖鱼鳔
<ol>
	<li>用高真空润滑脂填充一支10 ml注射器。</li>
	<li>制备2%低熔点琼脂糖（LMA）（步骤5.3，将160 mg低熔点琼脂糖溶于8 ml E3溶液中）。</li>
	<li>在预定时间麻醉斑马鱼（步骤5.2）。</li>
	<li>将10条鱼转移至一个1.7 ml离心管中，加入1 ml E3溶液，并加入200 μl 4 mg/ml三卡因（Tricaine）（终浓度为800 μg/ml），室温孵育15分钟以实施安乐死。</li>
	<li>在载玻片（75 x 25 mm，图2）上以1 cm间距呈正方形滴加4滴真空润滑脂，制备用于成像的玻璃载片。</li>
	<li>在正方形中央滴加2滴2% LMA。</li>
	<li>将一条鱼置于另一块玻璃载片上，在解剖显微镜下观察，确认心脏已停止跳动，并吸除多余水分。</li>
	<li>用精细镊子进行解剖：左手镊子固定头部，右手镊子向下牵拉前肠，从而分离出鱼鳔（图4A）。</li>
	<li>用左手镊子夹住鱼鳔的气管导管，将其与消化道分离，并在LMA凝固前迅速将鱼鳔置于2% LMA中央位置。</li>
	<li>将盖玻片（18 x 18 mm）盖在成像载玻片上，轻轻按压，使其同时接触真空润滑脂和LMA（图2）。</li>
	<li>解剖后10分钟内按步骤6.4所述进行成像。对其他鱼重复步骤7.7–7.11。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

鱼鳔显微注射疾病模型的进展与局限性
本文所展示的模型是对 Gratacap 描述的黏膜念珠菌病浸润模型的扩展 等 （2013）；该方法具有感染时间可控、感染剂量高度可重复等优势，因而提高了实验效率。本文展示了新的方法，可实现对感染动态进行非侵入性、高时空分辨率的详细记录 离体 鱼鳔成像。这些操作步骤将有助于相关研究的开展 C. albicans-黏膜部位固有免疫系统相互作用动态。目前报道的斑马鱼黏膜感染模型数量有限，且均局限于消化道紊乱/感染24,43此处介绍的鱼鳔模型将感染部位扩展至与肺具有一定相似性的器官，且提供了一个相对封闭的感染区域，使病原体被冲刷清除的可能性降低。
掌握这些技术时必须考虑若干关键因素。最重要的一点是需要鱼鳔充气充分。这要求将鱼类在28 °C下培养至5天龄（dpf），或在33 °C下培养至4天龄（dpf）。采用较高温度是为了加速鱼类发育，并使其上皮生理温度更接近哺乳动...

黏膜感染可因上皮屏障受损而导致危及生命的血流感染，使病原体得以进入全身循环环境1,2。此外，即使感染局限于体表，黏膜感染也可能引发显著的免疫病理损伤3-5。共生的单细胞真菌Candida albicans存在于大多数人群的口腔及其他黏膜部位6-9。尽管通常可被先天性和适应性免疫应答所控制，但先天免疫缺陷或医疗干预仍可导致严重的黏膜念珠菌病。对上皮屏障的破坏不仅增加了危及生命的播散性疾病的发病风险，还可引起免疫病理损伤，例如外阴阴道念珠菌病；此外，C. albicans的定植还与肺部免疫稳态相关10,11。目前，播散性念珠菌病已成为重症监护病房中第四常见的血流感染12，其死亡率高达40%，已成为重要的临床问题。随着针对自身免疫性疾病、癌症或器官移植患者的免疫调节治疗日益增多，深入理解该病原体与黏膜免疫系统之间的相互作用显得尤为迫切。
细胞生物学领域的大部分进展涉及 C. albicans黏膜水平的细胞间相互作用来源于 体外13-15 和小鼠模型16-18这两种方法各有优势，但在完整宿主体内对活细胞进行高分辨率成像的能力，限制了对感染过程的时间和空间特征的精确表征。因此，这些研究需要一种 体内 一种可在完整的脊椎动物宿主中可视化病原体、先天免疫细胞与上皮细胞相互作用的模型。
斑马鱼已成为研究人类疾病不可或缺的工具，主要得益于其身体透明且易于进行遗传操作。细胞和器官的发育过程已被高精度成像，从而揭示了多种新型免疫细胞行为，例如T细胞在胸腺发育过程中的行为19，以及细胞内分枝杆菌与吞噬细胞之间的相互作用20-22。近期研究描述了斑马鱼中肠道微生物与宿主之间的相互作用，表明肠道微生物的定植会影响宿主的肠道生理功能以及对其他感染的抵抗力23,24。此外，已有多种病原体经由肠道上皮感染的过程被报道。
与肠道相比，鱼鳔代表了一种更为独立且具有互补性的黏膜模型。该器官是发育中肠管的延伸，位于肝脏和胰腺的前方形成。25,26产生表面活性物质、黏液和抗菌肽27,28 在解剖学和个体发育上，该器官被视为哺乳动物肺的同源器官29,30由于斑马鱼的气道与肠道保持相连，这使得浸入式感染能够自然发生。值得注意的是，目前已知唯一能自然感染鱼类的 假丝酵母 物种是 C. albicans 鱼鳔感染31我们最近描述了一种实验性浸润感染模型，其中 C. albicans 感染鱼鳔，并发现该感染重现了某些典型特征 C. albicans-上皮相互作用 体外32,33. 
本文所述方法通过将白色念珠菌（C. albicans）直接注射至受精后4天（dpf）斑马鱼的鱼鳔中，改进了原有的浸染感染模型。该方法可实现对感染时间的精确控制，并确保接种量高度可重复。同时，该模型支持活体实时成像，并结合斑马鱼系统的多功能性优势。作为该方法应用的示例，我们展示了白色念珠菌（C. albicans）在体内的时空动态生长过程以及中性粒细胞向感染部位的募集情况。由于斑马鱼鱼鳔组织在活体成像中存在技术挑战，本文还提供了一种快速鱼鳔解剖技术，可显著增强荧光信号并提高显微分辨率。这些方法拓展了真菌学、免疫学及水产养殖研究的技术手段，同时描述了一种新的感染途径，未来有望用于模拟其他真菌、细菌或病毒在黏膜表面的感染过程。

<table><tbody><tr><td>1.7 ml 离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>深型培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-726</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-264</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子（Dumont Dumoxel #5）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>木质圆棒</td><td>VWR Scientific</td><td>10805-018</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-722</td><td></td></tr><tr><td>Flaming Brown 微量移液管拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 注射系统</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>背压单元</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>微量移液管固定装置套件</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>脚踏开关</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>磁性底座</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic Base</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ61 顶部配 SZX-ILLB2-100 底座</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX-81 配 FV-1000 激光扫描共聚焦系统</td><td></td></tr><tr><td>20X 显微镜物镜</td><td>Olympus</td><td>UPlanSApo 20x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>滚筒式摇床</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>TC-7</td><td></td></tr><tr><td>微量移液管加样头（Microloader）</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养管（16 x 150 mm）</td><td>VWR Scientific</td><td>60825-435</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4534-500GP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4532-500GP</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH0246-500GP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（Corning）</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4520-500GP</td><td></td></tr><tr><td>儿童彩泥（Play-Doh）</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>VWR Scientific</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（Hausser scientific）</td><td>VWR Scientific</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>A型浸油</td><td>Blue Marble Products</td><td>51935</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 涡旋振荡器</td><td>VWR Scientific</td><td>14216-184</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖（Lonza）</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-870</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>钓鱼线</td><td>Stren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔成像板（Sensoplate）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655892</td><td></td></tr><tr><td>高真空润滑脂（Dow Corning）</td><td>VWR Scientific</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>载玻片（25 x 75 mm）</td><td>VWR Scientific</td><td>48300-025</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（18 x 18 mm），No 1.5</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>15 cm 培养皿（Olympus plastics）</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106</td><td></td></tr><tr><td>甘油（EMD chemicals）</td><td>VWR Scientific</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>24孔培养板（Olympus plastics）</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>称量舟（8.9 cm）</td><td>VWR Scientific</td><td>89106-766</td><td></td></tr></tbody></table>

通过鱼鳔注射在斑马鱼幼虫中建立黏膜念珠菌病模型

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

黏膜病原体的早期防御包括上皮屏障和先天免疫细胞两部分。二者各自的免疫能力及其相互通讯对于抗感染保护至关重要。研究上皮细胞与先天免疫细胞和病原体之间的相互作用，最佳方法是 体内，复杂的生物行为在时间和空间上展开。然而，现有的模型难以实现对黏膜层面与病原体交战过程的便捷时空成像。
本研究建立的模型通过将真菌病原体白色念珠菌（Candida albicans）直接注射到幼年斑马鱼的鱼鳔中，从而引发黏膜感染。由此产生的感染使得能够在黏膜疾病发展的整个过程中，对上皮细胞和先天免疫细胞的行为进行高分辨率成像。该方法的灵活性可用于研究宿主反应，深入解析导致吞噬细胞募集的免疫事件的详细序列，并探究特定细胞类型和分子通路在免疫保护中的作用。此外，通过使用表达荧光蛋白的白色念珠菌（C. albicans），可同时成像病原体在免疫攻击下的动态行为。结合所描述的快速鱼鳔解剖技术，还可进一步提高宿主-病原体相互作用的空间分辨率。
本文所述的黏膜感染模型简单且高度可重复，是研究黏膜念珠菌病的有力工具。该系统也可广泛适用于其他通常通过上皮表面感染的黏膜病原体，如分枝杆菌、细菌或病毒等微生物。

后部鱼鳔显微注射
本文介绍的实验方法描述了将恒定剂量的C. albicans酵母细胞注射到4 dpf斑马鱼的 swimbladder 中。先前采用浸染模型的研究表明，斑马鱼 swimbladder 对C. albicans的免疫反应与哺乳动物黏膜念珠菌病相似32。本文展示了一种经过改进的感染方法，该方法更简便、可重复且快速；可在数小时内完成数百条斑马鱼的注射与筛选。
通过显微注射靶向器官后部区域，可实现对鱼鳔的准确且可重复的感染。与大多数其他针对幼鱼或胚胎斑马鱼的显微注射途径相比，鱼鳔注射更易于掌握。例如， 静脉或后脑室）。注射前的鱼类准备与其他注射部位相似，但需要使鱼鳔充气，因此所用鱼类的年龄较大。约75%的饲养鱼类在 33 °C 在4 dpf时具有膨胀的 swimbladder（数据未显示）。swimbladder 位于表皮层及薄层肌肉下方，用于注射鱼类的微针需为斜面针头。注射鱼类时的角度（图3A注射至鱼鳔后部还能显著提...

在现有的脊椎动物宿主中，病原体与免疫防御在黏膜水平上的体内时空相互作用难以进行成像。本文介绍了一种多功能平台，利用幼年斑马鱼的鱼鳔作为感染部位，用于在活体脊椎动物中研究黏膜念珠菌病。

黏膜病原体的早期防御包括上皮屏障和先天免疫细胞两方面。这两者的免疫功能状态及其……

本实验的总体目标是利用幼年斑马鱼建立黏膜念珠菌病模型。首先将含有活体白色念珠菌的溶液注入微针中，随后在第二步中将定量的酵母细胞注射到幼年斑马鱼的 swim bladder（鳔）中。接下来，对鱼类进行均一接种物的筛选，并在所需时间内进行孵育。最后一步，利用共聚焦显微镜观察病原体与斑马鱼免疫系统之间的动态相互作用。此外，可对鱼鳔进行显微解剖，以获得更高分辨率的共聚焦图像。本文所介绍的方法可解答真菌免疫学及微生物学领域的一些关键问题，例如：导致机体对真菌病原体及黏膜表面念珠菌信号产生免疫应答失败的精确事件序列是什么？在开始实验前，将含有2%aros的注射培养皿置于33°C培养箱中预热。30分钟后，使用25毫升移液器从受精后第四天的斑马鱼培养板中吸取100毫升E3培养基加PTU，注意避免吸入任何斑马鱼，然后加入2毫升浓度为4毫克/毫升的溶液。向培养基中加入三卡甲烷磺酸盐储备液以麻醉动物。15分钟后，使用解剖显微镜识别具有膨胀鳔的鱼类，并用塑料移液管将30条斑马鱼转移至预热的注射培养皿中。去除多余的培养基，然后将培养皿倾斜放置，使用直径为0.012英寸的钓鱼线（用超级胶水固定于硼硅酸盐毛细管中）制作三排，每排10条垂直排列的鱼。随后，充分涡旋一支 freshly prepared 白色念珠菌（Candida albicans）悬液，其浓度为每毫升1.5 × 10⁷ CFU。然后将三微升酵母溶液加载到EC夹持的微针上。将脉冲持续时间设置为适当参数。接着旋转注射培养皿，使微针与鱼头部之间呈20度角，对准鱼鳔后部。现在将微针推入鱼鳔内，确保针孔位于管腔中，并按压液滴。一旦完成注射，可通过观察确认哪些鱼已成功注射，因为注入的液体会推动原有的气泡，使鱼鳔后部充满培养基。在注射液中共同加入酚红可进一步帮助观察注射是否成功。注射完全部30条鱼后，向培养皿中加满E3培养基，然后将鱼转移至恢复皿中。将10条动物转移至含有1毫升E3培养基的1.7毫升离心管中，并加入200微升三卡因（trica）处死鱼类。随后，针对每条动物，在载玻片上用真空脂挤出四滴，排列成边长为1厘米的正方形，在正方形中央加入两滴新配制的2%低熔点琼脂糖。接着，将一条鱼置于另一载玻片上，在解剖显微镜下观察，确认其心脏已停止跳动，并去除多余水分。现在使用一对精细镊子固定头部位置，用另一对镊子向下牵拉前肠。通过气 duct 抓取鱼鳔，将其与消化道分离，并在琼脂凝固前将其置于已准备好的载玻片中央。最后，轻轻盖上盖玻片，轻压使其接触真空脂和琼脂糖，并在取出后10分钟内对鱼鳔进行成像。每尾鱼注射四纳升白色海藻假丝酵母（sea albicans），浓度为每毫升1.0至1.5 × 10⁷个CFU，可获得最一致的数据，每尾鱼体内酵母细胞数量范围为10至50个。若将接种量控制在每尾鱼15至25个酵母细胞，则表型和反应更为集中一致。中性粒细胞在小鼠和人类抵抗念珠菌病中发挥关键作用，将活的白色念珠菌注入斑马鱼 swim bladder 后，会迅速且持续地招募中性粒细胞。而当注射经加热灭活的酵母细胞时，则不会发生这一现象。酵母细胞注射后菌丝迅速形成，且菌丝生长在注射后的前24小时内持续进行，此后该数量开始减少。能够以非侵入方式追踪单条鱼类，使得此类纵向研究成为可能，并凸显了疾病进展及宿主反应中个体间的差异。在小鼠成像中仍难以实现的实验方案，在本模型中观察免疫细胞或上皮细胞与白色念珠菌（C. albicans）的相互作用则相对容易。然而，正如刚刚所展示的，分离鱼鳔可显著提高成像质量。当观察荧光在全身广泛表达的转基因鱼系时，这一方法尤其有用；例如在来自α-钙黏蛋白（alpha Catine）柠檬荧光蛋白（citine）鱼系的分离鱼鳔图像中，周围组织存在非特异性荧光信号，此时该方法的优势尤为明显。通过此操作步骤，还可采用其他方法，如形态学技术或化学抑制处理，以回答诸如特定免疫细胞或信号通路在黏膜念珠菌病中的作用是什么之类的问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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了解利用斑马鱼幼鱼建立粘膜念珠菌病模型的方法。通过向鳔内注射白色念珠菌，结合共聚焦显微镜实时观察病原体与免疫系统的动态相互作用，为真菌免疫学研究提供高分辨率成像平台。

通过鱼鳔注射在斑马鱼幼虫中建立黏膜念珠菌病模型

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