通过鱼鳔注射在斑马鱼幼虫中建立黏膜念珠菌病模型

本实验的总体目标是利用幼年斑马鱼建立黏膜念珠菌病模型。首先将含有活体白色念珠菌的溶液注入微针中，随后在第二步中将定量的酵母细胞注射到幼年斑马鱼的 swim bladder（鳔）中。

接下来，对鱼类进行均一接种物的筛选，并在所需时间内进行孵育。最后一步，利用共聚焦显微镜观察病原体与斑马鱼免疫系统之间的动态相互作用。此外，可对鱼鳔进行显微解剖，以获得更高分辨率的共聚焦图像。

本文所介绍的方法可解答真菌免疫学及微生物学领域的一些关键问题，例如：导致机体对真菌病原体及黏膜表面念珠菌信号产生免疫应答失败的精确事件序列是什么？在开始实验前，将含有2%aros的注射培养皿置于33°C培养箱中预热。30分钟后，使用25毫升移液器从受精后第四天的斑马鱼培养板中吸取100毫升E3培养基加PTU，注意避免吸入任何斑马鱼，然后加入2毫升浓度为4毫克/毫升的溶液。

向培养基中加入三卡甲烷磺酸盐储备液以麻醉动物。15分钟后，使用解剖显微镜识别具有膨胀鳔的鱼类，并用塑料移液管将30条斑马鱼转移至预热的注射培养皿中。去除多余的培养基，然后将培养皿倾斜放置，使用直径为0.012英寸的钓鱼线（用超级胶水固定于硼硅酸盐毛细管中）制作三排，每排10条垂直排列的鱼。随后，充分涡旋一支 freshly prepared 白色念珠菌（Candida albicans）悬液，其浓度为每毫升1.5 × 10⁷ CFU。

然后将三微升酵母溶液加载到EC夹持的微针上。将脉冲持续时间设置为适当参数。接着旋转注射培养皿，使微针与鱼头部之间呈20度角，对准鱼鳔后部。

现在将微针推入鱼鳔内，确保针孔位于管腔中，并按压液滴。一旦完成注射，可通过观察确认哪些鱼已成功注射，因为注入的液体会推动原有的气泡，使鱼鳔后部充满培养基。在注射液中共同加入酚红可进一步帮助观察注射是否成功。注射完全部30条鱼后，向培养皿中加满E3培养基，然后将鱼转移至恢复皿中。

将10条动物转移至含有1毫升E3培养基的1.7毫升离心管中，并加入200微升三卡因（trica）处死鱼类。随后，针对每条动物，在载玻片上用真空脂挤出四滴，排列成边长为1厘米的正方形，在正方形中央加入两滴新配制的2%低熔点琼脂糖。接着，将一条鱼置于另一载玻片上，在解剖显微镜下观察，确认其心脏已停止跳动，并去除多余水分。

现在使用一对精细镊子固定头部位置，用另一对镊子向下牵拉前肠。通过气 duct 抓取鱼鳔，将其与消化道分离，并在琼脂凝固前将其置于已准备好的载玻片中央。最后，轻轻盖上盖玻片，轻压使其接触真空脂和琼脂糖，并在取出后10分钟内对鱼鳔进行成像。

每尾鱼注射四纳升白色海藻假丝酵母（sea albicans），浓度为每毫升1.0至1.5 × 10⁷个CFU，可获得最一致的数据，每尾鱼体内酵母细胞数量范围为10至50个。若将接种量控制在每尾鱼15至25个酵母细胞，则表型和反应更为集中一致。

中性粒细胞在小鼠和人类抵抗念珠菌病中发挥关键作用，将活的白色念珠菌注入斑马鱼 swim bladder 后，会迅速且持续地招募中性粒细胞。而当注射经加热灭活的酵母细胞时，则不会发生这一现象。酵母细胞注射后菌丝迅速形成，且菌丝生长在注射后的前24小时内持续进行，此后该数量开始减少。能够以非侵入方式追踪单条鱼类，使得此类纵向研究成为可能，并凸显了疾病进展及宿主反应中个体间的差异。

在小鼠成像中仍难以实现的实验方案，在本模型中观察免疫细胞或上皮细胞与白色念珠菌（C. albicans）的相互作用则相对容易。然而，正如刚刚所展示的，分离鱼鳔可显著提高成像质量。当观察荧光在全身广泛表达的转基因鱼系时，这一方法尤其有用；例如在来自α-钙黏蛋白（alpha Catine）柠檬荧光蛋白（citine）鱼系的分离鱼鳔图像中，周围组织存在非特异性荧光信号，此时该方法的优势尤为明显。

通过此操作步骤，还可采用其他方法，如形态学技术或化学抑制处理，以回答诸如特定免疫细胞或信号通路在黏膜念珠菌病中的作用是什么之类的问题。