造型粘膜念珠菌在斑马鱼幼虫通过鳔注射
November 27th, 2014
在现有的脊椎动物宿主中，病原体和免疫防御在粘膜水平的体内时空相互作用不容易成像。这里介绍的方法描述了一个多功能平台，用于使用幼年斑马鱼的鱼鳔作为感染部位来研究活体脊椎动物的粘膜念珠菌病。
该程序的总体目标是使用幼年斑马鱼模拟粘膜念珠菌病。这是通过首先将含有活的白色念珠菌的溶液加载到微针中来实现的。在第二步中，将一定体积的酵母细胞注射到幼年斑马鱼的鱼鳔中。
接下来，筛选鱼的均匀接种物并孵育所需的时间。在最后一步中，使用共聚焦显微镜来跟踪病原体与斑马鱼免疫系统的动态相互作用。此外，可以对鱼鳔进行显微解剖以获得更高分辨率的共聚焦图像。
我们在这里介绍的方法回答了真菌免疫学和微生物学的关键问题，例如导致对真菌病原体和粘膜表面念珠菌信标的免疫反应失败的确切事件顺序是什么。在开始该程序之前，在 2 摄氏度的培养箱中加热含有 33%aros 的注射皿。30 分钟后，使用 25 毫升移液器从第 4 天的板中取出 100 毫升 E 三种培养基加 PTU，斑马鱼受精后，注意不要吸出任何鱼，并每毫升添加 2 毫升 4 毫克。
Trica 甲烷磺酸盐原液到培养基中麻醉动物。15 分钟后，使用解剖显微镜识别鱼鳔充气的鱼，并使用塑料移液管将 30 条斑马鱼转移到预热的注射皿上。去除多余的介质，然后以一定角度握住培养皿，并使用直径为 0.012 英寸的钓鱼线强力胶合到硼硅酸盐毛细管中，制作三行 10 条垂直排列的鱼，每条鱼以 1.5 倍的浓度 10 倍彻底涡旋一管新鲜制备的白色海细胞，每毫升 10 至第七个 CFU。
然后将 3 微升酵母溶液加载到 EC 夹住的微针中。将脉冲持续时间设置为适当的设置。然后旋转注射皿，使微针和鱼头之间达到 20 度角，瞄准鱼鳔的后部。
现在将微针推入鱼鳔，确保针孔在管腔中，然后按压水坑。一旦验证哪些鱼被注射了相对容易，因为团块取代了气泡，鱼鳔的后部随后充满了介质，将酚红与团块一起注射可以进一步促进成功注射的可视化。注射所有 30 条鱼后，用 E 3 培养基淹没培养皿，然后将鱼倒入恢复皿中。
将 10 只动物转移到含有 1 毫升 E 3 培养基的 1.7 毫升离心管中，并用 200 微升 trica 对鱼实施安乐死。接下来，对于每只动物，将四滴真空润滑脂滴成一个正方形，相距 1 厘米，放在微型载玻片上，并在正方形中间加入两滴新鲜制备的 2% 低熔化度。接下来，将一条鱼放在解剖显微镜下的单独载玻片上，验证动物的心脏是否已停止跳动并去除多余的水。
现在用一对细镊子将头部固定在固定位置，用另一把细镊子拉下前肠。通过气动管道拿起鱼鳔，将其与消化道分开，并在 agro 凝固之前将其放在准备好的微型载玻片之一的中心。最后，将盖玻片轻轻向下推，直到它接触到真空润滑脂和琼脂糖，并在收获后 10 分钟内对鱼鳔进行成像。
注射 4 纳升海白色念珠菌，剂量为 1 到 1.5 倍，是第七种的 10 倍。每毫升 CFU 可提供最一致的数据，从而得出每条鱼 10 至 50 个酵母细胞的范围。将接种物缩小到 15 到 25 个酵母细胞会产生更紧密的表型和反应。
中性粒细胞在小鼠和人类对念珠菌病的抵抗力中起关键作用，活的白色念珠菌感染斑马鱼鱼鳔导致中性粒细胞的快速和持续募集。当注射热杀灭酵母细胞时，不会发生这种情况。注射酵母细胞后细丝迅速发育，丝状生长在注射后的前 24 小时内持续，之后这个数字开始降低非侵入性跟踪个体鱼的能力，使这些纵向研究成为可能，并突出疾病进展和宿主反应的个体间差异。
一种在小鼠成像中仍然不切实际的实验方案，免疫细胞或上皮细胞与白色念珠菌的相互作用在这里介绍的模型中相对容易。然而，如前所述，解剖鱼鳔可显著提高成像质量。这在可视化荧光普遍表达的转基因鱼系时特别有用，并且在周围组织中存在外来荧光，如从 alpha Catine 黄水晶鱼线解剖鱼鳔的图像中观察到的那样。
遵循此过程。其他方法，如变形技术或化学抑制治疗，可用于回答诸如特定免疫细胞或信号通路在粘膜念珠菌病中的作用等问题。
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概述
本研究提出了一种使用幼年斑马鱼建模粘膜白色念珠菌病的方法。鱼鳔作为感染部位，允许对病原体-免疫相互作用进行实时成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 传染病学
背景
- 在活体脊椎动物中研究粘膜白色念珠菌病具有挑战性。
- 幼年斑马鱼提供了一个用于成像的透明模型。
- 了解病原体在粘膜水平上的相互作用对于开发治疗方法至关重要。
- 共聚焦显微镜允许对免疫反应进行详细观察。
研究目的
- 开发一个在活体斑马鱼中研究粘膜白色念珠菌病的平台。
- 可视化病原体与免疫系统之间的动态相互作用。
- 增强对真菌感染免疫反应的理解。
使用的方法
- 将含有活的白色念珠菌的溶液装入微针中。
- 用微针将酵母细胞注射到幼年斑马鱼的鱼鳔中。
- 筛选鱼以获得均匀的接种物并孵育它们。
- 使用共聚焦显微镜观察病原体-免疫相互作用。
主要结果
- 在斑马鱼中成功建模粘膜白色念珠菌病。
- 对病原体的免疫反应进行实时成像。
- 通过鱼鳔的显微解剖获得更高分辨率的图像。
- 对感染的时空动力学有了洞察。
结论
- 斑马鱼模型有效用于研究粘膜白色念珠菌病。
- 共聚焦显微镜为病原体相互作用提供了宝贵的洞察。
- 该方法可应用于其他粘膜感染以进行进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish via swimbladder injection enables high-resolution, in vivo analysis of host-pathogen interactions at mucosal surfaces. This approach provides predictive confidence for early-stage target validation and mechanistic de-risking in anti-infective discovery pipelines. The model's reproducibility and imaging capabilities support translational continuity from discovery through preclinical research for mucosal pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell and epithelial barrier function in response to mucosal infection.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing the sequence of immune events and cell recruitment.
- Facilitates functional validation of candidate targets and pathways involved in mucosal defense.
- Provides a platform for hypothesis-driven testing of immune modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, reproducible infection model for quantitative assessment of host-pathogen dynamics.
- Enables high-content imaging readouts for screening immune or pathogen-modulating compounds.
- Supports assay scalability and platform reuse for diverse mucosal pathogens beyond Candida albicans.
- Allows for robust evaluation of compound effects on immune cell recruitment and pathogen behavior.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mucosal infection models for translational biomarker discovery.
- Enables longitudinal, non-invasive tracking of disease progression and host response heterogeneity.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insight into protective immunity.
- Supports preclinical validation of immune-modulating interventions in a vertebrate system.
Pipeline & Workflow Integration
This zebrafish swimbladder infection model bridges early discovery and preclinical research by enabling real-time, quantitative analysis of mucosal host-pathogen interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell roles and pathway contributions to mucosal defense.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of immune cell recruitment, pathogen proliferation, and spatio-temporal dynamics.
- Translational Research: Offers continuity for biomarker alignment and disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Adaptable for studying other mucosal pathogens and immune-modulating strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mucosal infection research.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible in vivo imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early mechanistic insight.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microinjection, and confocal imaging.
- Needs access to high-resolution microscopy and image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of inoculum size and imaging protocols.
- Adaptable to various transgenic lines and pathogen types with protocol optimization.
- Imaging quality may be limited by tissue fluorescence and requires careful dissection for optimal results.
