造型粘膜念珠菌在斑马鱼幼虫通过鳔注射

该程序的总体目标是使用幼年斑马鱼模拟粘膜念珠菌病。这是通过首先将含有活的白色念珠菌的溶液加载到微针中来实现的。在第二步中，将一定体积的酵母细胞注射到幼年斑马鱼的鱼鳔中。

接下来，筛选鱼的均匀接种物并孵育所需的时间。在最后一步中，使用共聚焦显微镜来跟踪病原体与斑马鱼免疫系统的动态相互作用。此外，可以对鱼鳔进行显微解剖以获得更高分辨率的共聚焦图像。

我们在这里介绍的方法回答了真菌免疫学和微生物学的关键问题，例如导致对真菌病原体和粘膜表面念珠菌信标的免疫反应失败的确切事件顺序是什么。在开始该程序之前，在 2 摄氏度的培养箱中加热含有 33%aros 的注射皿。30 分钟后，使用 25 毫升移液器从第 4 天的板中取出 100 毫升 E 三种培养基加 PTU，斑马鱼受精后，注意不要吸出任何鱼，并每毫升添加 2 毫升 4 毫克。

Trica 甲烷磺酸盐原液到培养基中麻醉动物。15 分钟后，使用解剖显微镜识别鱼鳔充气的鱼，并使用塑料移液管将 30 条斑马鱼转移到预热的注射皿上。去除多余的介质，然后以一定角度握住培养皿，并使用直径为 0.012 英寸的钓鱼线强力胶合到硼硅酸盐毛细管中，制作三行 10 条垂直排列的鱼，每条鱼以 1.5 倍的浓度 10 倍彻底涡旋一管新鲜制备的白色海细胞，每毫升 10 至第七个 CFU。

然后将 3 微升酵母溶液加载到 EC 夹住的微针中。将脉冲持续时间设置为适当的设置。然后旋转注射皿，使微针和鱼头之间达到 20 度角，瞄准鱼鳔的后部。

现在将微针推入鱼鳔，确保针孔在管腔中，然后按压水坑。一旦验证哪些鱼被注射了相对容易，因为团块取代了气泡，鱼鳔的后部随后充满了介质，将酚红与团块一起注射可以进一步促进成功注射的可视化。注射所有 30 条鱼后，用 E 3 培养基淹没培养皿，然后将鱼倒入恢复皿中。

将 10 只动物转移到含有 1 毫升 E 3 培养基的 1.7 毫升离心管中，并用 200 微升 trica 对鱼实施安乐死。接下来，对于每只动物，将四滴真空润滑脂滴成一个正方形，相距 1 厘米，放在微型载玻片上，并在正方形中间加入两滴新鲜制备的 2% 低熔化度。接下来，将一条鱼放在解剖显微镜下的单独载玻片上，验证动物的心脏是否已停止跳动并去除多余的水。

现在用一对细镊子将头部固定在固定位置，用另一把细镊子拉下前肠。通过气动管道拿起鱼鳔，将其与消化道分开，并在 agro 凝固之前将其放在准备好的微型载玻片之一的中心。最后，将盖玻片轻轻向下推，直到它接触到真空润滑脂和琼脂糖，并在收获后 10 分钟内对鱼鳔进行成像。

注射 4 纳升海白色念珠菌，剂量为 1 到 1.5 倍，是第七种的 10 倍。每毫升 CFU 可提供最一致的数据，从而得出每条鱼 10 至 50 个酵母细胞的范围。将接种物缩小到 15 到 25 个酵母细胞会产生更紧密的表型和反应。

中性粒细胞在小鼠和人类对念珠菌病的抵抗力中起关键作用，活的白色念珠菌感染斑马鱼鱼鳔导致中性粒细胞的快速和持续募集。当注射热杀灭酵母细胞时，不会发生这种情况。注射酵母细胞后细丝迅速发育，丝状生长在注射后的前 24 小时内持续，之后这个数字开始降低非侵入性跟踪个体鱼的能力，使这些纵向研究成为可能，并突出疾病进展和宿主反应的个体间差异。

一种在小鼠成像中仍然不切实际的实验方案，免疫细胞或上皮细胞与白色念珠菌的相互作用在这里介绍的模型中相对容易。然而，如前所述，解剖鱼鳔可显著提高成像质量。这在可视化荧光普遍表达的转基因鱼系时特别有用，并且在周围组织中存在外来荧光，如从 alpha Catine 黄水晶鱼线解剖鱼鳔的图像中观察到的那样。

遵循此过程。其他方法，如变形技术或化学抑制治疗，可用于回答诸如特定免疫细胞或信号通路在粘膜念珠菌病中的作用等问题。