一种利用灰度分析对小鼠脱发进行定量分析的新技术

本实验的总体目标是通过光吸收法对毛发密度进行定量分析。首先在凝胶成像仪上拍摄动物图像，随后在图像上定义感兴趣区域，并测定该区域内光的吸收程度。

然后将光吸收值与摄影标准进行比较。最终，可通过计算经相同处理的动物之间的平均光吸收值，来显示干预措施对毛发生长的影响。该技术的主要优点在于其无偏性、可量化性和可重复性。

这一点极为重要，因为它使您能够使用标准品以及Inova等统计技术来确定结果的统计学显著性。对于本实验方案，应使用带有内置光源的凝胶成像系统进行反射摄影。这可确保光照均匀性良好，而透射照明则会产生不适合分析的剪影效应。

首先准备凝胶成像仪，调节焦距和视野。使用一些印刷文字进行调整，小鼠图像可以略微失焦，因为这实际上可行。为了减少感兴趣小区域中的量子误差，需验证拍摄区域内光源的均匀性，以实现感兴趣区域内的优异光学平均效果。

接下来，准备动物。选择一种起效迅速、作用时间短的麻醉剂，给予适量麻醉剂量，以确保动物在拍摄过程中保持静止。然后将动物垂直放置于成像仪上，并尽可能使其与成像平面平行。

拍摄背侧照片时，将动物置于俯卧位，四肢伸展。拍摄腹侧照片时，将动物置于仰卧位。确保动物身体无侧向旋转。

可以在图像之间提取吸光度值，但这并非该仪器的设计用途。因此，添加灰度标准有助于我们在整合数据时对吸光度值进行归一化处理。现在将灰度标准放置在拍摄区域内。

然后关闭暗室，并减少可能进入相机视野的环境光照。将光圈调整至合适的曝光值，使目标区域既不曝光过度也不曝光不足。随后拍摄照片。

如果选择的光圈值（F值）导致图像过饱和，则灰度值将固定在该值，此时B值完全无用。随后将光圈值（F.Stop）调整一级，保持感兴趣区域和标准物处于线性曝光范围内，并完成第二次拍摄。将动物置于加热台上，并在恢复期间持续监测其状态。

仰卧位。然后将动物放回笼中，最终送回动物房以完成完全恢复。使用凝胶成像软件定量光吸收时，在动物全身背侧视图图像上标记感兴趣区域。

使用矩形图像、椭圆形图像或手绘工具，尽可能向侧面延伸，勾勒出从上肢到下肢的区域。为获得完整的动物腹面视图，请保持在动物背部边缘范围内。使用两个矩形。

一个用于覆盖经过修剪的盆腔区域，另一个用于覆盖未经修剪的胸部区域。根据需要，也可标记较小的兴趣区域，例如给药部位。第二步，在灰度吸收标准物上标记出兴趣区域。

然后记录每个标记的兴趣区域的吸光度，以便在照片之间进行比较。使用曝光量与吸光度之间的对数-对数关系，将吸光度水平相对于背景标准进行归一化。为此，绘制曝光量对数与吸光度对数之间的曲线。

根据灰度吸收标准获得的数值，随后对每张照片标准的差异进行校正，方法如下：首先，选择用于读取感兴趣区域（ROI）的光圈值（F-stop）和用于参考的光圈值（F-stop），并计算所有照片在读取光圈值下标准区域的平均吸收值。该平均值即为参考标准值（RSV）。

接下来，计算每张照片中读数与参考F-Stop设置之间的吸光度差异，并对标准品及每个定义的ROI进行相同的计算。然后，利用某一F-Stop的数据，使用所示公式计算每个ROI的校正吸光度。随后，应用标准统计方法分析数据，对模拟斑秃ADA的C3 HHEJ移植小鼠在不同曝光条件下使用所述方法进行分析。

非重叠 ROI 中的变异如预期所示呈现高度相关性。类似的比较在三周时间内均产生了同样高度的相关性。对小鼠进行成像以量化其预期的毛发脱落情况。

在此时间段内，80%的成像小鼠出现了脱发。相比之下，正常的C57黑六小鼠在相同时间段内未出现任何脱发。在第二项研究中，使用所述技术对化疗诱导的脱发进行了定量分析。

小鼠经环磷酰胺处理三周，两个月后与对照组相比表现出显著的脱发。掌握方法后，每张图像的分析可在五分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何使用标准凝胶成像系统对啮齿类动物的毛发生长量进行定量分析。