亚麻花香浸改造（亚麻）生成的转基因后代具有高转化率

以下实验的目标是使用农杆菌介导的植物转化花浸法转化 flex。这是通过将柔性植物培养到适当的开花阶段并在荧光芽中选择初级来实现的。接下来，将花浸入由携带适当质粒的农杆菌细胞组成的渗透培养基中。

然后正常维护处理过的植物，直到它们结实。种子发芽并直接发芽。从它们的叶子 DNA 中进行 PCR，以识别和选择阳性转化体以生长至成熟。

结果表明，通过在亚麻上使用农杆菌和花浸渍，然后直接进行 PCR 检测，阳性转化体的转化和选择既容易又不足。与许多现有方法相比，这种技术有几个优点。通过农杆菌进行花浸渍简单、廉价、高效，最重要的是，比目前可用的亚麻转化方法具有更高的转化率。

演示该程序的是我实验室的博士生 nsma baki，在花浸前六周。开始种植植物。用土壤准备 5 英寸的花盆，这样亚麻籽就要深四分之一英寸。

每个花盆里埋四个。确保种子上的土壤被牢固地压实。然后定期给花盆浇水，并在 14 小时的昼夜周期内种植植物。

维护将温度保持在 23 到 27 摄氏度之间。根据需要定期检查初级荧光截断叶，以便在芽刚刚形成时寻找这些芽。in 荧光已准备好进行转化。

在这个阶段进行转化对于这个协议来说非常关键。对于主要处理，将 main 分支用于其他处理和未浸渍的对照。使用开花较少的侧枝。

请务必在花沾花前为树枝和花朵贴上日期和处理类型标签。在这种情况下，准备携带目标质粒 BRI 9 0 9 的农杆菌细胞。文本实验步骤中详细介绍了从克隆开始的这些准备步骤。

花浸前两天，解冻储存在零下 80 摄氏度的 50% 甘油中的转化农杆菌，将这些细胞在 5 至 20 毫升小瓶中培养至固定相，并含有适当的抗生素。此步骤通常在一夜之间完成。固定相的 OD 在 0.5 到 1 之间是可以接受的。

通过将 5 毫升先前生长的细胞倒入 500 毫升 LB 中，接种 1 至 100 稀释液，并培养过夜。28 到 30 摄氏度以 150 RPM 的速度摇晃。当培养物的 OD 介于 0.5 和 1 之间（理想情况下为 0.8）时，在室温下以 5， 000 G 离心 5 分钟收集细胞。

然后将细胞重新悬浮在由 500 毫升高压灭菌水和 5% 蔗糖组成的渗透培养基中。当细胞完全重悬后，向混合物中加入 0.05%silhouette 77 并混合。然后将混合物倒入盘子中，例如 8 英寸 x 8 英寸的 Pyrex 玻璃盘。

在以后的浸渍轮次中，将剪影 77 浓度降低到 0.03%使用最好的花期和剪影。77 浓度都是成功产生正变压器的非常关键的因素。现在进行花瓣浸泡。

首先，将植物侧放。然后将可见的芽浸入渗透介质中一到两分钟。浸泡后，将植物侧向放置过夜，并用塑料覆盖以保持植物湿润。

第二天，将植物恢复到正常状态。10 到 14 天后，芽应该长得更大。然后在同一根树枝上重复花瓣浸泡，降低剪影的浓度。

77、使用分支标签保持精度。稍后，当种子成熟并准备好收集时评估植物。从每朵花中取出一粒种子，开始检测阳性转化体。

种子应如前所述生长。在每个 5 英寸的花盆中种植 3 到 6 颗种子。种子将在播种后 4 到 6 天内发芽。

发芽后大约 14 到 14 天在 10 小时的光照下生长时，会长出真叶，可用于测试植物。使用直接 PCR，从每棵幼苗中选择 5 到 10 毫克的叶子到称重皿中。检查重量后，将叶子放入离心管中。

向每管中加入 180 微升 50 毫摩尔氢氧化钠。然后将试管在 95 摄氏度下孵育 10 分钟。热孵育后，用 pH 值为 8.0 的 20 微升 1 磨牙盐酸盐中和每个反应。

TD NA 引物或插入引物应用于从转化植物中生成特异性复制子。然后从每种提取物中使用 1 微升作为直接 PCR 反应的模板。评估 PCR 结果后，培育出成熟阳性的幼苗。

如果未获得阳性转化体，则从浸渍植物的相同花中挑选新种子并重复筛选。在某些情况下，并非花的所有种子都会被转化。T one 花是从单个 T zero 植物的主芽和侧芽中收集的。

几个引物对用于直接 PCR。这些引物的位置用蓝色箭头表示。在直接 PCR 中，12 株 T 中的 8 株检测呈阳性。

前两块凝胶显示了从 TDNA 和目标基因之间的区域制备扩增子的引物。总体而言，从主枝和侧枝收集的花的转化没有显着差异，如 m 和 S，该凝胶显示仅使用来自 TD NA 区域内的引物。尝试此程序时，请务必记住在准备渗透介质时戴上手套，并将植物调暗为固体 77 有毒并可能伤害您的皮肤。

看完这个视频后，你应该对如何使用农杆菌和花浸渍将亚麻或任何其他具有类似分枝解剖结构的植物转化为亚麻有了很好的了解。这种分支解剖结构允许在治疗过程中进行简单的花朵追踪，从而更容易选择和测试正向变压器。