高通量荧光测定法评估巨噬细胞吞噬作用与肌动蛋白聚合
2014年11月27日
本文介绍了一种利用荧光测定法定量分析贴壁巨噬细胞系吞噬荧光颗粒的实验方案。该方法可实现对颗粒内化及伴随发生的肌动蛋白聚合的高通量定量分析。
以下实验的总体目标是定量分析在添加激动剂或拮抗剂后，吞噬过程或肌动蛋白聚合所发生的变化。该目标通过向吞噬细胞中加入荧光标记的颗粒，并给予足够时间使其完成吞噬作用来实现。第二步是用台盼蓝处理细胞以淬灭未被内化颗粒的荧光，随后洗涤细胞并用多聚甲醛固定，从而终止吞噬过程。
接下来是染色与定量分析。为了便于荧光检测细胞和颗粒，对经DPI或肌动蛋白处理的细胞进行检测，结果通过荧光定量分析中绿色和红色荧光相对于蓝色荧光的比值，展示了处理对吞噬作用及肌动蛋白聚合的影响。与现有方法相比，荧光定量技术的主要优势在于，它是一种高通量、成本效益高的吞噬作用评估方法。
该方法可实现对样品的最小化操作，并快速定量每细胞的荧光强度。此方法有助于回答免疫学和细胞生物学领域中的关键问题，例如病原体清除的效率如何、速度如何，吞噬过程中肌动蛋白聚合的变化情况，以及激动剂或拮抗剂如何调控吞噬作用或肌动蛋白聚合。
开始实验时，将小鼠 J774 细胞系的巨噬细胞接种于 96 孔板（透明或黑色底板）中，在 37 摄氏度条件下孵育 1 至 2 小时，使细胞贴壁。随后，在 50 µL PBS 或添加补剂的培养基中加入所需浓度为两倍的激动剂、拮抗剂或溶剂对照，并孵育至预定时间。在此步骤中，务必在整个处理、洗涤和孵育过程中始终避免荧光颗粒和标记物接触光照。
为防止光漂白，在使用悬浮颗粒（如荧光标记的葡聚糖珠）时，需将储存液涡旋震荡一分钟。接着，向荧光颗粒中加入等量的调理试剂，并剧烈涡旋震荡另一分钟。随后，将混合物在37摄氏度下孵育一小时；孵育结束后，将颗粒以离心力离心五分钟。
在500 × g条件下离心。移除含有过量调理试剂的上清液S。随后，用100 µL PBS洗涤颗粒。涡旋振荡样品以重悬沉淀，然后在500 × g下离心5分钟。重复上述步骤两次，以确保充分优化并去除未结合的抗体。
为了制备电离颗粒的工作溶液，将颗粒重悬于 5 毫升培养基中。然后避光保存，以备后续使用。现在将颗粒的工作溶液置于无菌试剂储槽中。
向先前制备的细胞中加入50微升调理过的颗粒，使其终浓度为15纳克/毫升，并在标准细胞培养条件下进行吞噬作用。对于连续吞噬法，让荧光颗粒沉降到孔板底部并与细胞接触，此过程需30分钟至1小时。若进行时间进程实验，应在不同时间点加入细菌，并在同一时间终止整块孔板的所有反应。
为了提高贴壁细胞的处理速度，移除链霉素，并加入50 µL用PBS稀释的台盼蓝，以淬灭三抗孵育后未被内化的细菌的荧光。用PBS洗涤平板两次，以去除残留的三抗。接着，用50 µL的4%多聚甲醛固定细胞，在室温下孵育15分钟。
然后用 PBS 洗涤培养板。吸去所有液体后，每孔加入 50 µL DPI。染色 5 分钟后，用 PBS 洗涤两次。随后，每孔加入 50 µL PBS，并在戊二醛固定后记录吞噬作用。
每次用 PBS 洗涤，每孔 100 微升，共洗涤两次。然后向细胞中加入 50 微升含 0.1% Triton X-100 的 PBS，用于透化，室温孵育 3 至 5 分钟。接着用 PBS 洗去 0.1% Triton X，洗涤两次。
随后用1% BSA封闭细胞20分钟，以避免标记物的非特异性结合。现在通过将100微升甲醇储存液加入5毫升PBS中，配制Rod结构域染色的工作液。封闭后，立即移除BSA溶液。
向每个孔中加入50微升裂解缓冲液和工作液，在室温下避光孵育20分钟。为了定量吞噬作用，将培养板放入荧光酶标仪中，使用激发波长为488纳米、发射波长为518纳米的滤光片记录绿色荧光，使用激发波长为355纳米、发射波长为460纳米的滤光片记录蓝色荧光。为了使用荧光酶标仪定量肌动蛋白聚合，通过激发波长为584纳米、发射波长为620纳米的滤光片记录红色荧光，以及蓝色荧光。
激发波长为355纳米的激发滤光片和发射波长为460纳米的发射滤光片。接下来，根据颗粒标记或由于高板间变异性的吞噬作用与肌动蛋白定量，将绿色或红色荧光的总相对荧光单位（RFU）除以蓝色荧光读数。为减少板间差异的影响，应使用相对指数以更准确地展示观察到的趋势，并促进更可靠的统计分析。
该图像展示了加入抑制剂后肌动蛋白聚合的变化。此处为伪足的形成，以及细胞膜皱褶发生的变化。在此图像中，细胞被允许以20个珠子对1个细胞的比例内吞FITC标记的X珠子，持续60分钟。
然后用三蒸水洗涤细胞，并用多聚甲醛在 PBS 中固定，丙酮进行通透化处理，随后使用罗丹明标记的鬼笔环肽对 F-肌动蛋白进行染色。通过该方法检测发现，吞噬调理素包被与未氧化颗粒的持续吞噬能力相当。其中，J774 细胞正在内吞葡聚糖珠。有趣的是，吞噬作用后的肌动蛋白聚合在后期时间点增长逐渐减缓，而内吞未调理素颗粒后的肌动蛋白聚合则未见增加。两种使用葡聚糖颗粒的吞噬方法均未引起细胞活力的变化。一旦掌握，该技术可在操作得当的情况下，每次处理多块培养板，并在 1 至 2 小时内完成。
观看本视频后，您应能充分理解如何利用荧光定量分析作为一种高效、经济且高通量的方法来分析吞噬作用及其他细胞过程。
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概述
本文介绍了一种利用荧光测定法对巨噬细胞系吞噬荧光颗粒的过程进行定量分析的实验方案。该方法可实现对颗粒内化及其相关肌动蛋白聚合的高通量定量检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 吞噬作用是免疫反应中的关键过程。
- 理解肌动蛋白聚合对于研究细胞运动性和吞噬作用至关重要。
- 荧光测定技术相较于传统方法具有优势。
- 高通量方法对于大规模研究是必要的。
研究目的
- 定量分析吞噬作用和肌动蛋白聚合的变化。
- 评估不同激动剂和拮抗剂对这些过程的影响。
- 建立一种经济高效且可靠的定量方法。
使用的方法
- 将荧光标记的颗粒加入巨噬细胞中。
- 让吞噬作用持续进行指定时间。
- 使用台盼蓝淬灭未被内化的颗粒。
- 固定细胞并进行染色，以定量荧光强度。
主要结果
- 荧光测定法可有效量化吞噬作用。
- 通过荧光比值评估肌动蛋白聚合。
- 结果表明不同处理对吞噬作用的影响。
- 该方法具有高通量且成本效益高。
结论
- 该实验方案有助于加深对吞噬作用的理解。
- 荧光分析法是细胞生物学研究中的重要工具。
- 该方法可应用于涉及巨噬细胞的多种研究。
常见问题
行业重要性概述
这种高通量荧光定量技术能够快速、低成本地量化巨噬细胞的吞噬作用和肌动蛋白聚合，适用于在靶点调控效应预测可靠性至关重要的早期发现工作流程。该方法通过提供适用于酶标仪分析的定量荧光读数，有助于筛选影响病原体清除机制的激动剂和拮抗剂。其与96孔板格式的兼容性以及最少的样品操作步骤，使其成为在先导化合物优化前降低免疫学与炎症靶点风险的可扩展工具。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化激动剂或拮抗剂处理后吞噬活性和肌动蛋白动态的变化，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：在小鼠巨噬细胞模型（例如 J774A.1）中支持功能性靶点验证，操作简便且可快速获得结果。
- 预测价值：生成剂量依赖性的荧光比值（绿色/红色：蓝色），用于免疫调节化合物的作用机制去风险化分析。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：使用荧光标记的调理颗粒和锥虫蓝淬灭法，产生标准化、可重复的吞噬作用和肌动蛋白聚合信号。
- 可扩展性：兼容96孔板格式和多通道移液，每块板可在45分钟内完成化合物文库的筛选。
- 定量输出：提供相对荧光单位（RFU）比值，适用于初筛实验中的统计分析和苗头化合物筛选。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：模拟巨噬细胞介导的吞噬作用，这是感染性疾病、炎症及治疗性清除中的关键机制。
- 转化连续性：将早期靶点结合（如受体调节）与吞噬作用和细胞骨架重塑等功能性细胞反应关联起来。
- 临床前应用价值：可评估化合物对肌动蛋白聚合的影响，该过程与体内细胞运动性和吞噬效率密切相关。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导物发现的研究连续体，在进入临床前药效学模型之前，需对免疫调节活性进行功能验证。
- 发现生物学：检测激动剂或拮抗剂是否调节吞噬作用和肌动蛋白聚合，从而揭示免疫细胞功能的作用机制。
- 筛选：提供高通量、定量的荧光数据，可快速评估化合物在多种条件下的效应。
- 分析：生成标准化的荧光比值（例如，绿色：蓝色或红色：蓝色），即使存在微孔板间的差异，仍可实现孔间比较和趋势可视化。
- 转化研究：将分子扰动与组织环境中巨噬细胞功能相关的细胞表型相联系。
- 企业级应用：建立可重复使用的荧光检测平台，适用于除吞噬作用外的多种荧光探针和细胞过程。
运营与企业影响
- 科学价值：通过台盼蓝淬灭法将内化颗粒信号与表面结合的荧光分离，从而降低机制上的不确定性。
- 操作价值：通过颗粒调理、洗涤、固定和染色的标准化操作流程，实现实验室间的标准化。
- 战略价值：以极低的试剂成本提供免疫调节候选物的早期功能数据，从而优化“进行/不进行”决策。
- 项目组合影响：基于在吞噬流和细胞骨架动态中验证的作用效果，支持对靶点进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、荧光显微镜和基于微孔板的荧光测定技术的专业知识。
- 依赖于配备适当滤光片组的荧光微孔板读板仪（例如，绿色荧光使用488/518 nm，蓝色荧光使用355/460 nm，红色荧光使用584/620 nm）。
- 需要对调理化方案和颗粒制备进行标准化，以确保批次间的一致性。
- 在操作荧光探针时必须考虑光漂白的防护。
- 仅限于相对定量；绝对颗粒计数需通过珠标准品校准。
