一个程序，植入脊柱商会纵在体内鼠标脊髓成像

在这段视频中，我们描述了植入一种慢性的光学成像室在活老鼠的脊髓背侧的过程。室，外科手术，慢性成像的审查和论证。

该程序的总体目标是在小鼠的背侧脊髓上植入一个成像室，以实现纵向光学成像，而无需重复手术癫痫发作。这是通过首先暴露三个胸椎并去除脊柱上方的软组织来实现的。第二步是使用腔室的侧片夹住暴露的椎骨，并进行背椎板切除术。

接下来，将腔室的顶板牢固地固定在暴露的脊髓上，并使用硅橡胶和盖玻片进行密封。最后一步是使用粘合剂密封植入物周围的皮肤，让动物恢复。最终，多光子荧光显微镜用于对脊髓中的细胞行为和组织结构进行成像，并具有随时间变化的亚细胞分辨率。

与现有方法（例如脊髓的重复手术开放）相比，我们的新方法的主要优势在于能够在很长一段时间内分布几乎任意数量的成像时间点，而不会出现与重复手术相关的并发症，例如潜在的感染、手术创伤或动物应激。当我们考虑透明斑马鱼脊髓损伤后纵向成像的成功时，我们第一次想到了这种方法。然后，我们决定将这种范式扩展到哺乳动物模型。

通过剃除使用 isof fluorine 麻醉的小鼠的胸弓区域来开始此过程。然后去除修剪过的头发。接下来，将生理盐水、酮洛芬和地塞米松的混合物皮下注射给小鼠。

使用棉签。用碘和 70% 乙醇交替洗涤 3 次，并在两次洗涤之间等待 1 分钟。之后，皮下将 100 微升 0.125% 布比卡因注射到剃光贴片的中心，以减轻切口部位的疼痛。

然后将鼠标转移到自定义 stereo 攻击。插入直肠温度计并等待大约 10 分钟，让布比卡因在显微镜下生效。用手术刀刀片在感兴趣的椎骨上方创建一个 5 毫米的切口。

之后，通过钝性解剖增加皮肤开口的大小。接下来，轻轻解开皮肤和底层肌肉之间的结缔筋膜。使用牵开器将皮肤向后固定以获得更大的工作区域，并注意不要增加胸部的任何重量并阻碍呼吸。

然后用一对镊子抓住喙部，即大部分椎骨，这些椎骨将通过上覆肌肉暴露出来。将背突两侧的组织从三个椎骨上切开。随后，从背层板上去除所有覆盖的组织。

之后，小心地切掉附着在脊柱两侧外侧边缘椎骨上的肌腱。从椎柱的外侧边缘轻轻去除尽可能多的组织，以提供干净的夹紧表面。然后轻轻清创任何残留软组织的椎骨。

使用骨头刮刀和棉签，用手术剪刀修剪掉任何不协调的组织。接下来，调整牵开器以阻止椎柱周围的组织。将植入物侧杆与皮肤一起连接到分娩柱上的插脚上，然后将它们放入柱架中。

接下来，夹住三个椎骨。通过施加足够的压力来牢固地固定侧边杆。然后使用镊子帮助确保水平夹紧三个椎骨。

在进行椎板切除术之前，确保侧杆既水平又平行。之后，使用棉签仔细清洁并擦干夹住的椎骨的背表面。在此过程中，将 Vana 剪刀的尖端插入内侧夹住的椎骨的硬膜外腔，然后轻轻挤压手柄。

如果骨头是干燥的，它应该沿着背板开裂。在对侧重复此过程以释放椎板，同时抓住松散的椎板 用镊子轻轻地通过背突，小心地切掉椎板喙端和纤细端的任何结缔组织。然后用 0.9% 生理盐水彻底洗去脊髓上的任何血液，或用棉签吸收人工脑脊髓吸收多余的液体。

之后，修剪骨骼的外侧边缘并进入植入物的侧边。随后使用棉签和生理盐水控制出血。如果骨膜的一部分已经脱落并覆盖在脊髓上，请使用棉签和 29 至 30 号针头轻轻去除组织。

小心不要伤害脊髓，也不要将松散的骨膜与紧紧包裹的 dator 混淆。在最后。用牙科、丙烯酸和氰基丙烯酸酯密封骨骼的剩余裸露边缘。

请特别小心，防止胶水沾到裸露的脊髓上。现在，小心地将顶板放在动物身上，使四个槽与侧杆上的四个孔对齐，开口覆盖在暴露的脊髓上。小心地使用珠宝螺丝刀从第一个螺丝开始，用另一对镊子稳定螺丝刀的轴。

在这个阶段不要拧紧螺丝，而是插入螺丝，使前几个螺纹啮合。对其他三个螺钉重复此过程。将所有四个螺钉就位后，以相同的小增量交替拧紧每个螺钉，直到所有螺钉都牢固固定。

接下来，使用 Quick Sill 品牌硅胶弹性体填充脊髓和玻璃窗之间的空间，并将其涂抹在裸露的脊髓上。在使用之前，请务必去除混合头上任何含有气泡的硅胶。然后快速将 5 毫米的盖玻片放入顶板的插件中。

施加足够的压力以逐渐挤压液体弹性体以包围脊髓，但不会导致脊髓受压。然后，用牙科、丙烯酸和氰基丙烯酸酯覆盖渗出的弹性体的边缘，并使用粘合剂将弹性体尽可能粘附到周围的骨骼上，以防止弹性体在脊髓表面移动。接下来，取下牵开器并将皮肤向上拉到植入物的边缘。

使用氰基丙烯酸酯将皮肤粘附到植入物的边缘。之后，将螺钉插入顶板的翼部。随后使用牙科丙烯酸密封顶板螺槽中的间隙，然后将动物放回笼子中进行恢复。

在成像之前，再次麻醉鼠标并将植入物的裸露螺钉连接到螺纹柱上以实现稳定。该图显示慢性脊髓腔在数周内保持光学透明。这些是术后几分钟到三周不等的脊髓白光图像。

血管标志在所有时间点都是可识别的。手术后一天几乎没有变化。早在三天后，窗口的一部分就出现了致密的纤维状过度生长，并导致成像区域部分混淆。

也存在轻度新生血管形成，但在白光或 2 次 PEF 成像中不会掩盖原始脉管系统。慢性脊髓腔允许重复多光子成像，而无需重复手术 所示。以下是在脊髓背侧 fii 的 DRG 轴突子集中表达 YFP 的转基因小鼠的图像。

脉管系统通过血管内染料注射进行标记，以红色显示。小胶质细胞的活动也可以在大腿 1 个 YFP CX 3 CR 1 个 GFP 双转基因小鼠中随时间跟踪，而轴突和小胶质细胞仍然可见。对比度和分辨率会随着时间的推移而略有下降。

一旦掌握。如果开发后正确执行，这项技术可以在大约一小时内完成。这项技术为我们探索脊髓损伤后轴突枯死的时间和空间异质性铺平了道路。

还有老鼠。