Name: 在诱导小鼠心肌梗死的微创手术过程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学习在小鼠中通过微创手术诱导心肌梗死的方法，使用立体显微镜下插管和左冠状动脉结扎技术。该模型具有高重现性和高存活率，适用于心血管研究。

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本工作得到了亚琛工业大学医学院临床跨学科研究中心（IZKF Aachen）（资助E.A.L.青年研究组）的支持。我们衷心感谢Rusu博士和Ashley Christina Vourakis对稿件的严格审阅，以及Roya Soltan女士在免疫组织化学染色方面提供的专业帮助。

注意：本文所述实验均根据德国法律及欧洲动物护理指南进行。实验动物在德国亚琛大学医院实验动物科学研究所动物实验中心繁育，由 Prof. Dr. R. Tolba 和 Dr. A. Teubner（动物福利官员）负责监督。
1. 动物护理
<ol>
	<li>将小鼠饲养在专用的护理单元中，确保其能够正常获取食物，并接受专业的兽医监控和治疗。若动物从外部转移或购买而来，在进行实验操作前，请确保经过为期一周的适应性饲养。</li>
</ol>
2. 插管
<ol>
	<li>使用100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪经腹腔注射麻醉8-10周龄雄性C57Bl/6野生型小鼠（体重25-27 g），通过脚趾夹捏反射监测麻醉深度。手术过程中在眼睛上涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。</li>
	<li>按照所在机构的动物护理指南，在开始手术前皮下注射0.1 mg/kg体重的丁丙诺啡以进行术前镇痛管理。</li>
	<li>使用无菌材料和器械，确保手术过程中维持无菌条件，避免感染。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠仰卧位固定于加热的手术台上。用小剃刀去除颈部腹侧区域及胸部左侧一半的毛发，并在切口前用70%乙醇消毒。
	<ol>
		<li>使用手术剪在颈部正中做一长约0.5 cm的小切口。在皮肤下方，用无菌弯头镊穿过两块脂肪组织，在体视显微镜下透过覆盖肌肉的透明组织观察气管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在体视显微镜观察下，经口腔将插管套管插入气管（图1A）。通过透明组织辨识金属套管，并在手术过程中随时确认其位置和放置情况（图1B）。</li>
	<li>将套管连接至小型动物呼吸机，并根据制造商的指导调整通气参数（潮气量为100-150 µl，呼吸频率为每分钟100-150次）。</li>
</ol>
3. 心肌梗死诱导
<ol>
	<li>在剑突与左侧腋窝连线的中点处做一个小于0.5 cm的皮肤切口。用镊子将肌层与下方肋骨分离。</li>
	<li>使用小剪刀在肋骨之间做一个小切口，直至打开胸腔17对于慢性梗死，在第5处进行切口th 肋间隙（图1C）以及/或者用于缺血/再灌注模型，在第4个th 肋间隙图1D）：为更简便的操作，从下方数第二个编号th 以及 3th 肋间隙，分别）。</li>
	<li>将拉钩置入切口以打开胸腔，暴露心脏。</li>
	<li>小心去除心包膜，以防止过度的纤维化过程。</li>
	<li>将左前降支冠状动脉（LAD）视为一条位置较深的浅红色血管。若无法观察到LAD，可考虑采用一些参考点以提高可重复性。
	<ol>
		<li>对于慢性梗死模型，以图中所示静脉为参照，在心脏腹侧中部（心耳与心尖之间）放置结扎线 图1C用0/7丝线结扎动脉的两个分支，以获得透壁性前壁和后壁梗死。灰色表示结扎位置，必要时可重复操作。图1C).</li>
		<li>对于缺血/再灌注模型，将结扎线置于耳下，穿过LAD主干上方图1D）。结扎线置于硅胶管上方，以保护血管的完整性。灰色区域表示梗死区，应出现在整个心脏中图1D）。在缺血期间，将肋间缝线置于肋骨上，并使用湿敷料润湿以防止组织干燥。缺血结束后，移除硅胶管，用小剪刀剪断缝线以观察再灌注情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>除手术开始时使用的麻醉剂和镇痛剂（步骤 2.1 和 2.2）外，手术期间使用 0.5% 异氟烷以确保动物的适当舒适，或遵循所在机构的动物护理指南。</li>
</ol>
4. 缝合与恢复
<ol>
	<li>通过注入温热的等渗盐溶液，排除胸腔内的残余空气。</li>
	<li>使用3根0/6缝线关闭胸腔（如图2A和2B所示）。将内侧缝线以90°角放置，以确保肋骨完全密闭，如图2所示（图2A、B）。</li>
	<li>用2根缝线关闭肌肉层（图2C），并用3-4根0/6缝线关闭皮肤（图2D）。这些缝线应分别进行，以便为后续超声心动图测量提供合适窗口。</li>
	<li>将气管插管从呼吸机上断开，允许动物自主呼吸。为便于后续识别，请使用本机构的局部标记系统对小鼠进行标记（请咨询所在机构的动物福利负责人）。</li>
	<li>将小鼠置于红色灯下左侧卧位，直至其苏醒。在恢复足够意识之前，不得让动物无人看管。接受手术的动物在完全恢复前，不得与其他动物同笼饲养。</li>
	<li>根据所在机构的动物护理指南，在术后3天内皮下注射布托啡诺（buprenorphine）进行镇痛治疗，剂量为0.1 mg/kg体重。</li>
</ol>
5. 心肌梗死的分析
<ol>
	<li>定期通过超声心动图监测心脏功能（图 3A）：包括射血分数、缩短分数、心输出量及心脏尺寸。</li>
	<li>采用腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪对动物进行麻醉。手术前通过检查反射是否消失来确认麻醉效果充分。</li>
	<li>打开胸腔并取出心脏，将其置于无菌 PBS 溶液中，充分冲洗残留血液。</li>
	<li>如需采血，可避免损伤梗死区域，直接从心脏采集；或在取出心脏后，从胸腔内收集血液。</li>
	<li>冲洗后，将心脏置于饱和 KCl 溶液中（经无菌过滤的 PBS 配制 3M KCl）使其停搏于舒张期。如需进行组织学分析，则将心脏固定于 10% 福尔马林中，并继续执行步骤 5.7。</li>
	<li>如需评估心肌细胞活性，可采用伊文思蓝/氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法。重新在原位结扎冠状动脉后，通过主动脉插管灌注 200 µl 1% 伊文思蓝溶液，并将心脏置于塑料袋中于 -20 °C 冷冻，无需冲洗。
	<ol>
		<li>2 小时后，使用锋利的手术刀进行 5 个横向切片，并按照试剂说明书所述，在 37 °C 的 TTC 溶液中孵育 10–15 分钟。切片在 10% 福尔马林中固定 10 分钟，随后置于载玻片之间以供进一步分析。</li>
		<li>将心脏组织包埋于石蜡中，将心脏尖端朝上放置，以便进行横向切片。连续切片厚度为 5 µm。收集前 20 张切片，丢弃接下来的 300 µm 组织。持续切片直至达到二尖瓣水平（图 3A，B）。沿整个心脏每隔 400 µm 收集连续切片，可用于定性和定量染色分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用 Gomori 一步染色法测定梗死面积6-8。</li>
	<li>在连续切片上通过常规免疫组织化学染色分析血管生成、胶原含量或炎症细胞募集情况。</li>
</ol>

<ol><li>Liehn, E. A., Postea, O., Curaj, A., Marx, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+after+myocardial+infarction%2C+between+fantasy+and+reality%3A+the+role+of+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Repair after myocardial infarction, between fantasy and reality: the role of chemokines.</a> J Am Coll Cardiol. 58 (23), 2357-2362 (2011).</li>
<li>Liehn, E. A., Radu, E., Schuh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+contribution+in+stem+cell+engraftment+into+the+infarcted+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Chemokine contribution in stem cell engraftment into the infarcted myocardium.</a> Curr Stem Cell Res Ther. 8 (4), 278-283 (2013).</li>
<li>Alexander, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+transplantation+of+different+cell+types+sequentially+improves+heart+function+after+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Repetitive transplantation of different cell types sequentially improves heart function after infarction.</a> J Cell Mol Med. 16 (7), 1640-1647 (2012).</li>
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<li>Liehn, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+monocyte+chemotactic+protein-1%2Fchemokine+CC+motif+ligand-2+competitor+limiting+neointima+formation+and+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A new monocyte chemotactic protein-1/chemokine CC motif ligand-2 competitor limiting neointima formation and myocardial ischemia/reperfusion injury in mice.</a> J Am Coll Cardiol. 56 (22), 1847-1857 (2010).</li>
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<li>Projahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+intramyocardial+release+of+engineered+chemokines+by+biodegradable+hydrogels+as+a+treatment+approach+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Controlled intramyocardial release of engineered chemokines by biodegradable hydrogels as a treatment approach of myocardial infarction.</a> J Cell Mol Med. 18 (5), 790-800 (2014).</li>
<li>Schuh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+the+mechanism+of+cell-based+therapy+after+chronic+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Discoveries%22%5BJournal%5D)">Novel insights into the mechanism of cell-based therapy after chronic myocardial infarction.</a> Discoveries. 1 (2), e9(2014).</li>
<li>Schuh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+SDF-1+alpha+on+Endogenous+Mobilized+and+Transplanted+Stem+Cells+in+Regeneration+after+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Effect of SDF-1 alpha on Endogenous Mobilized and Transplanted Stem Cells in Regeneration after Myocardial Infarction.</a> Curr Pharm Des. 20 (12), 1964-1970 (2013).</li>
<li>Zaragoza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal models of cardiovascular diseases.</a> J Biomed Biotechnol. 2011, 497841(2011).</li>
<li>Kanzler, I., Liehn, E. A., Koenen, R. R., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+therapeutic+approaches+to+reduce+acute+atherosclerotic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory therapeutic approaches to reduce acute atherosclerotic complications.</a> Curr Pharm Biotechnol. 13 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines%3A+inflammatory+mediators+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis.</a> Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).</li>
<li>Kolk, M. V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAD-Ligation%3A+A+Murine+Model+of+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction.</a> J. Vis. Exp. (32), 1438(2009).</li>
<li>Ryu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+bone+marrow+mononuclear+cells+using+injectable+fibrin+matrix+enhances+neovascularization+in+infarcted+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Implantation of bone marrow mononuclear cells using injectable fibrin matrix enhances neovascularization in infarcted myocardium.</a> Biomaterials. 26 (3), 319-326 (2005).</li>
<li>Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, J., Giraud, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure+in+Rat%3A+Double+Thoracotomy+for+Myocardial+Infarction+and+Epicardial+Implantation+of+Cells+and+Biomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix.</a> J. Vis. Exp. (91), e51390(2014).</li>
<li>Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Murine+Model+of+Myocardial+Ischemia-reperfusion+Injury+through+Ligation+of+the+Left+Anterior+Descending+Artery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery.</a> J. Vis. Exp. (86), e51329(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在操作过程中，有一些关键步骤需要注意：插管、打开胸腔以及左前降支冠状动脉（LAD）结扎。第一个关键步骤是在实验开始前对动物进行插管。许多研究小组采用垂直支撑固定小鼠，并使用光源辅助将套管直接插入气管。该方法在判断套管是否正确进入气管方面存在不确定性，初学者最容易在此步骤失败。通过做一个小切口，可以在整个操作过程中控制套管的位置，从而降低操作失败率。此外，该方法避免了气管切开术，减少了并发症，并缩短了手术时间。
下一个关键步骤是打开胸腔。正中胸骨切开术是一种高风险操作，会延迟动物的恢复。涉及切断2-3根肋骨的左侧横向切口15，会导致恢复不良和死亡率升高。我们在模型中采用肋间小而局限的切口，以尽量减少创伤。动物术后恢复非常迅速，且未出现功能缺陷或愈合异常。以下位肋间间隙作为参考定位点。基于此，无论是慢性结扎模型还是缺血/再灌注模型，对结扎部位进行准确且差异化的入路均不会带来严重问题。
结扎操作本身是最关键的步骤。左前降支冠状动脉难以直接观察，通常需要在无法直视的情况下进行结扎。因此，需借助一些解剖学定位标志，以帮助手术者准确完成结扎。对于慢性梗死模型，结扎位置应位于心脏腹侧中部，在耳状突与心尖之间，且位于大前静脉末端的上方（图2B）。可通过观察心肌缺血区域是否出现灰白色来判断结扎效果。如果梗死区域位于前壁且未累及后壁，可在第一根缝线的左侧再加一针缝线。左前降支主干通常在耳状突下方清晰可见18，因此该部位的识别一般不会造成严重困难。然而，耳状突区域出血风险较高，操作时需格外小心。
该操作受限于合适设备的可用性。用于小型动物的呼吸机和适当的麻醉系统价格昂贵，且需要连接到房间的气体供应和通风系统。此外，在操作后的第一周内必须对动物进行密切监护，以检测可能出现的临床症状。为了在实验过程中评估心脏功能，需要使用高分辨率超声、复杂的朗根多夫（Langendorff）灌流系统或小型心室内导管测量技术，这些方法成本较高，且需要额外的专业技术。
考虑到心肌梗死，目前尚无其他方法能够在体外重现其事件的复杂性。in vitro。根据研究关注点的不同，采用Langendorff系统对离体心脏进行ex vivo灌注，可提供有关心脏收缩力、心功能以及心肌活力在不同刺激或药物作用下的反应信息。然而，该方法排除了血液成分和免疫系统的全部干扰，因此不适用于心肌梗死后重塑与修复过程的长期研究。
在完成心肌梗死手术后，可进行其他所有功能分析，如心室内压测量、超声检查（小动物超声系统）或离体心脏朗根多夫灌注。此外，还可开展所有生物学和分子学分析，以鉴定细胞、蛋白质、mRNA、微小RNA（microRNA）、基因或其他可作为治疗靶点的生物标志物，从而为心肌梗死开发新的治疗策略。

心肌梗死是工业化国家死亡的主要原因之一。尽管诊断和治疗方法取得了无可争议的进步，心血管疾病仍然是导致死亡的主要原因。鉴于预期寿命的提高以及与生活方式相关的风险，预计未来心血管疾病的发病率将持续上升。因此，迫切需要建立并验证治疗心血管疾病的新方法。人类研究的信息存在其局限性，这些研究通常不足以从分子水平上解释和理解相关机制，因而无法为这些重大健康问题提供解决方案。
此外，由于心血管疾病机制在实验室中具有复杂性且难以复制，基础研究一直受到限制。因此，为了增进对心血管疾病病理生理学的认识，验证动物模型至关重要1,2。然而，要识别心肌梗死后修复过程中涉及的所有分子事件级联反应，必须在不同时间点进行分析，这导致需要开展大量动物实验。
心肌梗死实验通常采用动物模型进行。与大型动物模型相比，使用小型动物诱导心肌梗死3-11是研究细胞和分子事件最合适且最有效的模型。此外，尚无其他物种能像小鼠12一样提供如此丰富的转基因或基因敲除品系。这些小鼠模型在其他疾病研究中也极为有用，包括心血管疾病（如动脉粥样硬化、支架内再狭窄）13,14。此外，小鼠妊娠周期短、子代数量多，使其成为研究心肌梗死分子机制最具吸引力的实验体系12。
然而，小鼠心脏的尺寸要求在显微手术过程中具备极高的操作精度。培养具备相应资质和熟练技能的手术人员是一个耗时且劳动密集的过程。因此，本文详细介绍了一种显微手术操作流程，并提供了实用技巧，旨在指导即使资质一般的合作者（如学生或技术人员）也能成功建立小鼠复杂的心肌梗死模型。
最初，通过短导管进行插管，无需使用气管切开术。胸部切口位于肋间区域，以避免损伤肋骨和/或周围组织。此子步骤对于确保快速恢复和愈合至关重要15。结扎方法根据慢性缺血和缺血/再灌注模型的不同而有所区别，可在保持较显著梗死面积的同时实现较高的存活率。我们的经验表明，与冷冻损伤相比，使用丝线缝合可确保更高的可重复性16。
综上所述，本文所述方法适用于小型动物的慢性缺血及缺血/再灌注模型。本操作中提供的技巧旨在使即使资质较低或一般的人员也能在小型动物模型中成功应用该方法。

<table><tbody><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ/X9</td><td></td></tr><tr><td>小鼠呼吸机</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730043</td><td>型号 Minient 845</td></tr><tr><td>双通道麻醉系统（台式版本）</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>自包含式异氟烷麻醉装置，适用于实验台使用，紧凑设计，占地尺寸为 8&quot; x 11&quot;。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>插管套管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>732737</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST, Germany</td><td>9119700</td><td>标准尖头弯镊，0.17 mm x 0.1 mm</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>FST, Germany</td><td>9146011</td><td>直剪</td></tr><tr><td>Vannas 剪</td><td>Aesculap, Germany</td><td>OC 498 R</td><td></td></tr><tr><td>牵开器</td><td>FST, Germany</td><td>1820010</td><td>2.5 mm 宽</td></tr><tr><td>牵开器</td><td>FST, Germany</td><td>1820011</td><td>5 mm 宽</td></tr><tr><td>金属手柄</td><td>FST, Germany</td><td>1820005</td><td>&amp;nbsp;10 cm</td></tr><tr><td>金属手柄</td><td>FST, Germany</td><td>1820006</td><td>&amp;nbsp;14 cm</td></tr><tr><td>氯胺酮 10%</td><td>CEVA, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪 2%</td><td>Medistar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthene 眼鼻膏</td><td>Bayer, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>IFK Isofluor, Germany</td><td>定制&amp;nbsp;产品</td><td>直径 500 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>切片厚度 100 &amp;micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯导管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PROLENE 缝线 6/0&amp;nbsp;</td><td>ETHICON</td><td>8707H</td><td>聚丙烯单丝不可吸收缝线，针型 CC1，13 mm，3/8 圆弧</td></tr><tr><td>7/0 丝线</td><td>Seraflex</td><td>IC 1005171Z</td><td></td></tr><tr><td>超声成像系统&amp;nbsp;</td><td>Vevo, Canada</td><td>770 Vevo</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠心肌梗死诱导的微创手术操作

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

尽管近几十年来支架研发领域取得了显著进展，心肌梗死仍然是西方国家死亡的主要原因。为了阐明其潜在机制并开发新的治疗策略，必须拥有可靠的动物模型。由于我们需要在体内条件下深入了解心血管疾病的病理机制以应对心肌梗死，动物模型的有效性成为关键因素。然而，在此过程中动物保护也极为重要。因此，我们建立了一种小鼠心肌梗死的微创且简便的模型，该模型具有高重复性和高动物存活率。该模型符合动物实验的3R原则（替代、优化和减少），并确保为心血管疾病治疗策略的进一步发展提供所需的科学信息。

心肌梗死手术过程持续25至30分钟，死亡率为10%。术后，小鼠在接下来的15分钟内从麻醉中恢复。未观察到手术小鼠出现身体功能障碍。然而，如果在炎症阶段修复过程受到干扰，则在慢性心肌梗死后一周内发生心脏破裂的风险更高。由于心脏在泵血过程中其尺寸可能发生显著变化，因此所有采集的心脏必须在相同的位置停止，例如在舒张期。这可以通过用饱和KCl溶液灌注心脏来实现。细胞外K+浓度升高会阻断离子泵，降低心肌细胞的膜静息电位，从而导致心脏活动在舒张期停止。
在超声分析中可以观察到梗死区域（图3A，下层面）。与正常心肌相比，缺血区域表现为变薄且运动减弱（图3A，上层面）。根据所采用的模型不同，梗死面积也会有所差异。慢性梗死模型可诱导心尖部出现圆形、透壁性梗死（图3B），而缺血/再灌注模型则导致贯穿全心的薄层、中壁梗死（图3C）。测定梗死面积的方法有多种。如果目的是分析对心肌存活能力的直接影响，建议在再灌注后至少2小时进行伊文思蓝-氯化三苯基四氮唑（Evans-Blue/TTC）染色18，以便观察心肌中的任何变化。染色后可立即对切片进行分析（图3B，中层面），或将其置于载玻片之间，用甲醛保存2-3天后再分析（图3C，中层面）。蓝色区域代表未受缺血影响的健康心肌；红色区域代表缺血区内仍具活性的心肌（风险区心肌）；白色区域代表坏死组织。通常，梗死面积以占风险区面积的百分比来表示。
通过Gomori一步染色法进行免疫组织化学染色，可轻松测量重塑过程后形成的成熟瘢痕。从每个水平的第一张切片开始，直至二尖瓣水平，确定梗死区域（蓝色染色）和健康心室区域（红色染色）（图3B 和 C，右侧面板）。为避免因结扎左前降支（LAD）位置不同而造成的差异，需综合考虑所有切片的梗死范围，并以左心室总体积的百分比表示。在慢性梗死模型中，梗死体积通常可达15–20%，而在缺血/再灌注模型中则为10–15%。此外，慢性梗死模型会引起明显的心室扩张，而缺血/再灌注模型则无此现象（图3B 和 C，右侧面板）。
可采用常规染色方法，例如：使用CD31染色显示血管生成（红色，图4A），或使用平滑肌肌动蛋白染色鉴定肌成纤维细胞（绿色，图4B）。由于梗死区域缺乏心肌细胞，不会产生自发荧光，因此也可应用双重荧光染色来识别梗死区域中的不同靶分子（图4C）。
<img alt="小鼠心脏手术示意图；显示LAD研究中切口和梗死的示意图。" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：正中切口及气管插管导管的插入(A)。通过组织透明性在体视显微镜下观察金属导管(B)。图中指出气管软骨环（蓝色箭头）和导管（黑色箭头）。用于慢性梗死模型的肋间切口及左前降支冠状动脉（LAD）结扎(C)。结扎位置位于心脏中部（介于耳廓与心尖之间，下层面板中为黑色），以静脉末端为参考（蓝色示意图，下层面板）。应结扎动脉的两个分支（下层面板中为红色）。灰色区域表示梗死区，出现在心脏下半部分（右下层面板）。缺血/再灌注模型的结扎位于耳廓下方，将LAD主干（下层面板中为红色）结扎于硅胶管之上（右侧）(D)。灰色区域表示梗死区，分布于整个心脏（右下层面板）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于医学研究的肋骨、肌肉、皮肤缝合示意图 A、B 及图像 C。" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2： 在慢性（A）和缺血/再灌注模型（B，左图）中，若内侧缝合线呈90°角放置，则肋骨缝合可封闭胸腔切口。体内成像显示肋骨缝合（C，左图）、肌肉缝合（C，中图）和皮肤缝合（C，右图）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="正常与梗死心脏的超声图像；慢性梗死、缺血/再灌注、TTC、Gomori染色结果示意图。" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3： 超声心动图图像。正常（A，上图）和梗死区域（A，下图）的图像分别在长轴（纵向，左图）或短轴（横向，右图）切面获取。由慢性结扎诱导的梗死（B）以及由1小时缺血后继以再灌注诱导的梗死（C）。伊文思蓝/TTC染色可用于识别灌注（蓝色）与非灌注区域，以及存活（红色）与坏死（白色）心肌组织（B、C，中图）。Gomori一步法染色可识别梗死区域（蓝色），并将其与正常区域（红色）区分开来（B、C，右图）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示CD31和肌动蛋白与DAPI共染色的免疫荧光显微图像。" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4：可在梗死区域进行多种染色，例如CD31染色以显示新生血管形成（A，红色，单箭头），或平滑肌肌动蛋白染色标记肌成纤维细胞（B，绿色，单箭头），以及双标染色（C，CD31-红色/平滑肌肌动蛋白-绿色），并用DAPI复染细胞核（蓝色）。肌成纤维细胞可与小或大动脉中的平滑肌细胞明确区分，后者始终伴有内皮层（C，箭头）。双箭头指示红细胞的自发荧光。比例尺：50 µm。

本文描述了一种在小鼠中建立心肌梗死的高可重复性模型，该模型仅需最少的侵入性操作。该模型易于实施，具有高重复性和高存活率。因此，该模型将减少实验所需的动物数量，符合3R原则（替代、优化和减少）的要求。

尽管在最近几年支架研发领域取得了显著进展，心肌梗死仍然是西方国家死亡的主要原因，...

本实验的总体目标是通过微创操作在小鼠中诱导出高度可重复的心肌梗死模型。该目标通过在体视显微镜下进行气管插管，以在操作过程中精确控制插管导管的位置来实现。第二步是在左侧肋间做一个微小的侧向切口，以打开胸腔并促进快速愈合。随后根据适当的下游操作放置左冠状动脉前降支的结扎线。最终，可通过标准的免疫组织形态计量学分析来评估梗死区域的大小和形状。该技术相较于现有方法的主要优点在于其微创性、高度可重复性以及操作简便，使得即使经验极少的研究人员也能在小型动物模型中应用此方法。通常，初学者会遇到困难，因为小鼠心脏体积较小，需要极高的操作精度。进行显微手术时，首先将一只8至10周龄的雄性C57BL/6野生型小鼠麻醉后仰卧置于加热的手术台上。通过脚趾夹捏确认适当的镇静程度后，将眼膏涂抹于动物眼部，并使用小剃刀去除颈部腹侧区域及左侧胸廓的毛发，用70%乙醇和碘伏对皮肤进行消毒。然后在颈部正中做一长约0.5厘米的正中切口。切开皮肤后，将一对无菌弯镊穿过两侧脂肪体，以帮助透过覆盖的肌肉清晰观察气管。使用体视显微镜，将插管套管经口插入气管。应透过透明组织观察套管位置。确认器械位置正确后，将套管连接至小型动物呼吸机，并调整通气参数，潮气量设定在 100 至 150 µL 之间，呼吸频率设定在每分钟 100 至 150 次吸气，以诱导心肌梗死。接着，在剑突与左侧锁骨中线之间的皮肤上做一个长度小于0.5厘米的切口。然后用镊子将肌层与下方的肋骨分离，以建立慢性梗死模型。若建立缺血再灌注模型，则在第五肋间进行切口。若为其他情况，则在第四肋间进行切口。接下来，将拉钩置入切口以打开胸腔，暴露心脏。然后小心去除心包膜，以防止过度的纤维化过程，并观察位于深部的浅红色血管——左前降支冠状动脉。对于慢性梗死模型，以左前降支冠状动脉为参照，在心尖与房室沟之间的心脏腹侧中段位置放置结扎线。然后，为了获得透壁性前壁和后壁梗死，使用0-7丝线结扎动脉的两个分支。对于缺血-再灌注模型，将结扎线置于乳头肌下方，并穿过硅胶管和左冠状动脉前降支主干。在缺血期间，在肋骨上放置临时缝线，并用湿敷料润湿缝线，以避免组织干燥。缺血后，移除硅胶管，并用小剪刀剪断缝线以观察再灌注情况。诱导梗死完成后，用温热的等渗盐溶液填充胸腔，以排除残留空气。随后用3-0号6针缝线关闭胸腔，将内侧缝线以90度角定位，确保肋骨完全封闭。用两针缝合肌肉层，然后根据需要使用三到四针缝合皮肤。随后将插管导管从呼吸机上断开，使小鼠恢复自主呼吸，并标记小鼠以供后续识别，将动物置于红灯下直至苏醒。为分析心肌梗死数据，需通过超声心动图定期监测射血分数、缩短分数、心输出量及心脏尺寸。实验结束时，打开胸腔并切除心脏。将组织置于无菌 PBS 中进行充分洗涤。待血液完全去除后，用饱和氯化钾溶液使心脏停搏于舒张期，并将组织在 10% 甲醛中固定过夜。将心脏组织的薄片包埋于石蜡中，使心脏尖端朝下固定在包埋块底部，以便对组织进行横切。随后连续收集20张5微米厚的切片，弃去接下来的300微米组织。之后每隔300微米收集一次25微米厚的切片，直至达到二尖瓣水平。然后使用Mori的一步染色法测定组织的梗死面积，进行TTC染色。重新结扎血管，使用主动脉插管以200微升1%伊文思蓝溶液灌注心脏，并将心脏置于塑料袋中于-20摄氏度下冷冻，无需冲洗。两小时后，使用锋利的解剖刀从组织上切取五个横截面，并将切片孵育10至15分钟。根据制造商说明，将样本置于37摄氏度的TTC溶液中。在10%福尔马林中再次固定10分钟后，将切片转移至玻璃显微镜载玻片上，用于组织学分析。根据所使用的模型不同，梗死面积会有所差异。慢性梗死模型会诱导心尖部位出现圆形的透壁性梗死，而缺血-再灌注模型则会在整个心脏的中壁层诱导出较薄的梗死区域。为了分析梗死对心脏存活性的直接影响，可采用伊文思蓝-TTC染色法：未受缺血影响的健康心肌染成蓝色，缺血区域内有存活力但处于风险中的心肌染成红色，坏死组织则呈现白色。通常，梗死面积以风险区面积的百分比来表示。通过一步染色法可测量重塑过程后形成的成熟瘢痕，其中在获取的每个心脏组织水平中，位于二尖瓣前方的第一个切片上，梗死的心室区域呈蓝色染色，健康的心室区域呈红色染色，分别进行分析。所有切片的梗死面积随后表示为左心室总体积的百分比。也可以进行常规染色操作，例如在这些图像中所示。分别使用 CD31 和平滑肌肌动蛋白染色以显示梗死组织中血管生成和肌成纤维细胞的存在。利用双重荧光染色来鉴定梗死区域内的不同靶分子，因为在无心肌细胞的情况下未观察到自发荧光。一旦掌握，若操作得当，该技术可在25至30分钟内完成。为确保实验具有高度可重复性，必须进行充分的疼痛管理。在此操作之后，还可开展其他功能分析，例如心室内压测量、超声检测或离体心脏-肺联合功能分析。灌流结束。

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在诱导小鼠心肌梗死的微创手术过程

在小鼠急性缺血/再灌注损伤和慢性重塑的研究中，涉及多种基因操作和/或心肌内注射基因、蛋白质、细胞和/或生物材料，这些操作随时间维度叠加进行。本视频展示了缺血/再灌注、永久性冠状动脉结扎以及心肌内注射研究的显微外科操作步骤。...

冠状动脉结扎与心肌内注射在小鼠心肌梗死模型中的应用

在小鼠中诱导实验性心肌梗死的手术操作首先在第三和第四肋骨之间进行左侧开胸，以暴露心脏前表面和左肺。随后结扎左冠状动脉，关闭胸腔，小鼠可自行恢复。...

小鼠冠状动脉结扎术的改良技术

在本视频中，我们介绍了一种通过永久性结扎左前降支冠状动脉来建立心肌梗死小鼠模型的手术方法。...

建立小鼠心肌梗死模型：小鼠左前降支冠状动脉永久性结扎手术操作流程

关键词：心肌梗死，小鼠模型，左前降支冠状动脉，永久性结扎，开胸手术，心肌缺血，动物模型，心血管疾病

我们介绍一种外科手术方法，用于诱导实验性缺血/再灌注（I/R）损伤，以模拟小鼠模型中的心肌梗死（MI），该方法可更清晰地定位左前降支动脉（LAD）上的结扎位置，从而提高小鼠MI实验的可重复性。...

通过左前降支动脉结扎建立心肌缺血-再灌注损伤的小鼠模型

我们提供了一种在小鼠模型中进行左前降支动脉（LAD）结扎的可靠方法。该方法相较于其他方法侵入性较小，涉及气管插管、左侧开胸入路以及胸腔穿刺。该方法可用于构建急性与慢性心肌梗死（MI）的动物模型。...

小鼠左前降支冠状动脉结扎：一种改进且简化的心肌梗死模型

本文介绍了一种外科手术方法，用于实现小鼠左前降支冠状动脉的永久性结扎。该模型对于研究心肌梗死的病理生理学及其伴随的生物学过程具有重要意义。...

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本文介绍了一种采用微创方法在大鼠中高效实施心肌缺血及随后慢性再灌注的技术。此外，通过超声心动图和离体工作心脏方法评估大鼠左心室血流动力学功能。...

一种诱导大鼠心肌梗死的半微创方法及利用离体工作心脏系统评估心脏功能

在充分麻醉的条件下，通过肋间切口将小鼠心脏外置，并使用大多数实验室 readily available...

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本文介绍一种简单且可重复的方法，通过显微操作对小鼠左前降支冠状动脉进行精确结扎，从而诱导心肌梗死或心肌缺血-再灌注损伤。...

小鼠心肌梗死与心肌缺血-再灌注损伤的诱导

在小鼠心肌梗死部位周围进行超声引导下的细胞递送是一种安全、有效且便捷的细胞移植方法。...

超声引导下诱导多能干细胞来源的心肌细胞在心肌梗死小鼠中的移植

本文介绍了一种在小鼠中永久性结扎左冠状动脉的外科手术方法。该模型可用于研究心肌梗死后的心脏病理生理学变化及相关炎症反应。...

左冠状动脉结扎：一种小鼠心肌梗死的外科模型

学习在小鼠中通过微创手术诱导心肌梗死的方法，使用立体显微镜下插管和左冠状动脉结扎技术。该模型具有高重现性和高存活率，适用于心血管研究。

小鼠心肌梗死诱导的微创手术操作

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