研究自然动情周期雌性大鼠条件性恐惧消退的实验方案

本实验的总体目标是研究性腺激素对雌性个体在埃斯拉周期低激素和高激素状态下恐惧消退行为的影响，以及外源性给予雌二醇时其发挥的作用。首先，通过监测成年雌性大鼠的埃斯拉周期，确定其在实验前处于哪个周期阶段。随后，将处于动情期的动物分组并安置于指定的实验舱内，进行适应性饲养和恐惧条件反射训练。

第二天，当动物处于动情期时，对雌性动物注射雌二醇或溶剂对照物，并进行恐惧消退训练。最后，在第三天，将动物重新放回相同的实验箱中，以测试其对前一天消退训练的记忆回忆。最终，通过阴道拭子检测 EST 激酶以确定动情周期阶段，使研究人员能够操控性腺激素的自然波动，从而研究其对恐惧消退记忆的影响。

本方案可用于帮助回答性别差异领域的关键问题，例如，雄性和雌性在恐惧消退过程上是否存在差异？如果存在差异，其背后的激素和神经生物学机制是什么？本方案的主要优势在于，通过分享相关研究方法，有助于推动对雌性在恐惧消退中作用的研究。

刚接触这些方法的研究人员常常难以稳定地监测眼动周期，因为该操作耗时较长，且高度依赖于正确的技术操作。这些研究的意义在于可能为恐惧和焦虑相关疾病的性别特异性治疗方案提供依据。这一点可能尤为重要，因为女性患此类精神疾病的可能性是男性的两倍。

Lisa man，实验室的博士后，同时也负责护理工作。实验室的一名研究助理将演示采集样本以监测动情周期的操作步骤。首先配制0.9%的生理盐水溶液，将棉签浸入液体中，然后用纸巾吸去尖端多余的溶液。将大鼠的尾巴向上抬起，注意不要造成动物不适，再进行采样。

将棉签轻轻插入阴道，不要过深，轻轻旋转棉签以采集阴道壁上的脱落细胞，然后迅速取出。取出时避免携带过多液体，将棉签头部轻柔地在预先标记好的显微镜载玻片上滚动，确保样本转移至载玻片上。需至少采集两个完整周期的样本，并将连续数日的样本转移至同一张载玻片，以便更准确地追踪和识别每日的雌激素水平变化。

玻片干燥后，将其在固定液中浸入10次，然后在染色液中浸入10次，最后在复染液中浸入5次。用清水轻轻冲洗。

在开始条件化实验之前，先将载玻片在空气中完全晾干，然后在显微镜下观察。实验前连续三天，每天在光照开启的条件下，让雌性动物在条件化实验箱中适应环境20至30分钟。将其预先暴露的箱子指定为该研究中的实验箱。每次实验间期及不同动物使用后，需彻底清洁实验箱，以去除可能影响行为及EST应激周期的气味。

一旦确认动物处于EST额外周期的动情期，即开始进行习惯化条件训练阶段。在首次条件刺激（声音）呈现前，通过测量动物在刺激期间保持静止不动的时间（秒），获取条件刺激前的僵直反应基线值。在规定的时间间隔内，将动物静止不动的秒数除以实验持续时间，计算出僵直百分比得分。

为了在动情周期的ME期进行消退训练，需根据阴道涂片结果确定大鼠处于雌激素（ESTRO）期的最后一天时进行条件化。将动物放入条件化箱中，进行一次仅呈现条件刺激（CS）的适应性试验。给予30秒的条件刺激（CS）声音。

在每次试验之间平均等待三分钟后，重复进行四次仅呈现条件刺激（CS）的试验，使条件化前共完成五次此类试验。将足底电击网格地板连接至电刺激发生器。在适应阶段结束后，立即使用0.5至0.6毫安的电刺激作为非条件刺激（US），并以4千赫兹、80分贝的音调作为条件刺激（CS）。

开始恐惧条件反射的配对CS-US试验，先呈现第32次CS音调，随后给予持续0.5秒的US电击，两次试验之间间隔约三分钟。在条件反射训练阶段结束前，以相同方式重复该配对试验六次。随后将动物放回其饲养笼并送回动物饲养设施，留待次日（第二天）继续实验。

在对所有接受实验第一天方案的动物进行拭子取样并确定其ME动情周期阶段后，准备足量的雌二醇溶液（溶于芝麻油或0.9%生理盐水），使每只动物均能按15微克/千克的剂量接受皮下激素注射。轻轻捏起颈部肩胛骨之间的松弛皮肤，将注射器插入皮肤褶皱形成的三角区域。动物注射后30分钟，将其放入条件化实验箱，开始消退训练，给予20次单独的条件刺激（CS）。

每次试验包括一个持续 32 分之一秒、频率为 4 千赫兹、强度为 80 分贝的声音刺激，各次试验之间间隔约三分钟，在 24 小时后的第三天进行。第三天，在将动物放入指定的条件化实验箱后，对已完成第一和第二天实验的动物进行取样。通过执行三次仅呈现条件刺激（Cs）的试验开始消退记忆测试，各次试验之间间隔约三分钟。完成记忆测试后，将动物放回其饲养笼中，并根据本文所述实验方案分析数据。

在消退训练中表现良好且保留了消退记忆的动物，在消退回忆阶段的行为测试最后一天表现出较低的恐惧水平。如图所示，雄性和雌性大鼠在条件性恐惧表达上无显著差异。但在各个阶段，当将动物按高雌激素和低雌激素动情周期阶段分组分别分析时，性别差异变得明显。

该图表显示了雌激素周期相位对恐惧消退记忆的影响：在动情周期中低雌激素的动情后期（EST extra cycle 的 metes 相）接受消退训练的雌性大鼠，在第三天的消退记忆回忆表现不如在动情前期（PROEs）接受训练的大鼠。然而，若在消退学习巩固前对处于动情后期的雌性大鼠皮下注射每千克体重 15 微克（15 µg/kg）剂量的雌二醇，则恐惧消退记忆的巩固似乎得到增强，表现为消退回忆期间的僵直时间显著减少。

因此，这些数据表明性腺激素能够调节恐惧消退记忆，同时也介导了条件性恐惧消退行为中的性别差异。还可结合本方法同时开展导管植入手术和免疫组织化学等其他实验操作，以回答诸如：雌二醇在大脑的哪些区域发挥作用以调节恐惧、消退、记忆巩固？以及雌二醇如何改变这些脑区内神经元的活动？观看本视频后，您应能清楚地了解如何研究自然动情周期雌性大鼠以及雌二醇在恐惧消退中的影响。