Name: 原代鼠脑微血管内皮细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学习从成年小鼠大脑中分离原代脑微血管内皮细胞的方法，通过机械匀浆、酶消化和密度梯度离心获得高纯度细胞培养物。该技术适用于血脑屏障功能研究及中枢神经系统疾病机制探索。

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本研究由明斯特大学跨学科临床研究中心（IZKF）（SEED 03/12，SB）、德国研究基金会（DFG）“运动中的细胞”卓越集群（EXC 1003 – CiM）、明斯特大学（资助 SB 和 SGM）以及Else Kröner-Fresenius基金会（2012_A88 资助 SB 和 SGM）提供资助。感谢Heike Blum提供出色的插图。

所有动物实验均经当地主管部门（“德国北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局；第87部门，动物健康与动物保护；德国雷克林豪森”）批准，并依照德国动物保护法进行。
1. 小鼠实验的一般注意事项
<ol>
	<li>所有实验均应按照各机构动物护理和使用委员会的指南，使用小鼠进行。</li>
	<li>将小鼠饲养在无病原体环境中，并使其可自由获取食物和饮水。</li>
	<li>实验组应使用年龄和性别相匹配的小鼠，因为生物学特性可能随年龄和性别而变化。</li>
	<li>应尽可能减少、优化或替代动物实验。</li>
</ol>
2. Percoll 梯度的制备
<ol>
	<li>将19 ml 1x PBS与1 ml 10x PBS、1 ml FCS和10 ml Percoll混合。</li>
	<li>在玻璃管中进行无菌过滤（滤膜孔径：0.2 µm）。过滤后，将溶液储存在4 °C。</li>
</ol>
3. 内皮细胞培养基的制备与细胞培养板的包被
<ol>
	<li>内皮细胞培养基：
	<ol>
		<li>配制500 ml培养基：将400 ml DMEM培养基（约80%）与100 ml PDS（约20%）、0.25 ml bFgF（20 µg/ml；约0.05%）、0.5 ml肝素（100 µl/ml；约0.1%）以及0.5 ml嘌呤霉素（4 mg/ml；约0.1%）混合。仅在培养最初2天使用的细胞培养基中添加嘌呤霉素。</li>
		<li>在玻璃容器中进行无菌过滤（滤膜孔径：0.2 µm）。过滤后将溶液储存于4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞培养板的包被：
	<ol>
		<li>每1 ml包被液的配制：取500 µl ddH2O、400 µl IV型胶原蛋白（0.4 mg/ml）和100 µl纤连蛋白（0.1 mg/ml）混合成溶液。</li>
		<li>用包被液完全覆盖细胞培养板每个孔的表面，4 °C过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 小鼠脑微血管内皮细胞（MBMEC）的分离
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法处死10只成年小鼠（8–12周龄，C57BL/6），随后分离小鼠脑组织，并置于5 ml PBS中保存（注意：操作需无菌！）。</li>
	<li>使用镊子去除脑干、小脑和丘脑。将脑组织在无菌吸水纸上轻轻滚动以剥离脑膜。收集去脑膜后的前脑组织。</li>
	<li>将脑组织转移至装有13.5 ml DMEM的50 ml Falcon管中。</li>
	<li>先用25 ml移液管，再用10 ml移液管将组织切碎，直至培养基变为乳白色。</li>
	<li>随后在37 °C、180 rpm的摇床上，用含0.6 ml胶原酶CLS2（10 mg/ml溶于DMEM）和0.2 ml DNA酶（1 mg/ml溶于PBS）的混合液，在杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中消化组织1小时。</li>
	<li>向组织悬液中加入10 ml DMEM，于4 °C下以1,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液（注意：沉淀容易丢失！）</li>
	<li>为去除髓鞘，用25 ml移液管将沉淀在25 ml BSA-DMEM（20% w/v）中重悬（约吹打25次），然后于4 °C下以1,000 × g离心20分钟。</li>
	<li>使用大口径断裂的玻璃巴斯德移液管弃去上层乳白色的髓鞘层，再用普通巴斯德移液管弃去BSA层。</li>
	<li>将沉淀用9 ml DMEM重悬，加入1 ml胶原酶/分散酶（终浓度为1 mg/ml）和0.1 ml DNA酶，在37 °C、180 rpm的摇床上消化1小时（注意：重悬时勿使用移液管吹打，以免细胞丢失）。</li>
	<li>在消化过程中，将Percoll溶液用超速离心机在4 °C下以3,000 × g离心1小时（开启加速度，不使用刹车），以制备密度梯度。</li>
	<li>向消化后的细胞悬液中加入10 ml DMEM，于4 °C下以1,000 × g离心10分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于2 ml DMEM中。</li>
	<li>小心将重悬的细胞加至Percoll梯度液顶部，于4 °C下以700 × g离心10分钟（无加速度、无刹车）。注意：细胞可见为界面处的一团云雾状物。</li>
	<li>用无菌长针头吸取约12 ml含细胞的界面层，转移至含5 ml DMEM的新50 ml Falcon管中。</li>
	<li>再次于4 °C下以1,000 × g离心细胞10分钟。之后将沉淀重悬于内皮细胞培养基中（每1 cm2培养皿表面积使用约0.2 ml培养基）。</li>
	<li>从已包被的细胞培养板中移除包被液（参见步骤3.2），并用无菌PBS连续洗涤两次，每次洗涤一孔。</li>
	<li>将细胞培养物置于37 °C、5% CO2的无菌培养箱中培养。每两至三天更换一次培养基。当细胞融合度达到90%时进行传代。</li>
</ol>

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<li>Urich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Scientific reports. 3, (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

血脑屏障功能障碍是多种有害中枢神经系统疾病的标志性特征， 例如 多发性硬化症中，血脑屏障的破坏极大地促进了自身反应性免疫细胞侵入中枢神经系统，导致少突胶质细胞的接触与破坏。在缺血性脑卒中中，血脑屏障的破坏及其继发的脑水肿形成是影响继发性梗死扩展及患者总体生存的关键因素6此外，局灶性缺血病灶可通过改变远端区域的血脑屏障，诱导脑部发生广泛的功能改变。然而，其潜在的分子机制在很大程度上尚不清楚。5相比之下，功能性脑微血管内皮细胞（BMECs）中外排转运体的高密度和多样性会降低有益药物的浓度，例如用于脑部恶性肿瘤的化疗药物或用于感染性疾病的抗生素。因此，需要更深入地理解生理和病理生理条件下血脑屏障的功能，以开发能够特异性地将屏障功能调控至理想方向的药理学制剂。21可靠 体外 血脑屏障模型是研究血脑屏障调控机制不可或缺的工具。
已建立并使用了多种永生化脑微血管内皮细胞系 体外 血脑屏障模型22这些细胞系相较于原代脑微血管内皮细胞（BMECs）具有一定的优势，因其生长速度更快，并可在连续多代培养中保持部分血脑屏障（BBB）特性。然而，内皮细胞系无法完全替代原代细胞，因为其重要特性已发生改变，从而影响了实验结果向原代细胞的可外推性。 体内 例如，小鼠脑微血管内皮细胞系 bEnd.5 仅表达低水平且呈不连续分布的紧密连接蛋白，导致较高的细胞旁通透性23BEnd.3 是另一种常用的小鼠脑微血管内皮细胞系，表现出致密且连续分布的紧密连接、较高的跨内皮电阻、多种外排转运蛋白以及较低的旁细胞通透性。然而，与原代脑微血管内皮细胞（BMECs）相比，bEND.3 细胞层在某些跨细胞和旁细胞底物渗透方面缺乏真正的区分能力。24.
在原代细胞培养的制备过程中，污染细胞可能显著干扰实验结果的可靠性。在本方案中，使用吡喃霉素作为内皮细胞的选择性试剂以获得高纯度的细胞。然而，必须定期进行细胞培养的质量控制，以确保实验的可靠性。质量控制的方法有多种，除观察内皮细胞典型的形态学特征外（见图1A），还可检测跨内皮电阻，或评估内皮细胞标志物（如CD31，见图1B）或血管性血友病因子（vWF）的表达情况。
从小鼠大脑中分离得到的脑微血管内皮细胞数量相对较少，为了建立可用于多个实验的合适细胞培养体系，必须合并多只小鼠的大脑样本。根据我们的经验，进行一次实验至少需要使用10只小鼠，这可能受限于相应动物设施的资源条件。为避免偏差或混杂因素，应仅合并具有相同遗传背景和环境背景的小鼠样本。相比之下，牛和猪的脑微血管内皮细胞制备物可从单个大脑中获得大量细胞。然而，除了小鼠在繁育和饲养方面较为简便外，目前可获得的转基因小鼠品系种类广泛且持续增加，使得原代小鼠脑微血管内皮细胞成为研究血脑屏障功能的理想模型。
关于血脑屏障（BBB）功能及其潜在分子机制的一些关键发现来源于二维组织培养系统的研究。近年来，三维培养系统已被开发出来25，其中内皮细胞被置于胶原基质中，使其能够形成管腔和管状网络。这些新型细胞培养系统可更准确地在体外模拟完整生物体内血管过程的实际情况。in vivo三维细胞培养系统中若进一步引入神经血管单元（NVU）的其他细胞类型，如周细胞和星形胶质细胞，则有望彻底改变血脑屏障功能的in vitro研究方式；目前已有初步模型被成功构建26。
以下是一些故障排除的建议。首先，无菌操作对于内皮细胞培养的质量至关重要。其次，吡喃霉素仅应在培养最初两天的细胞培养基中添加，长时间使用可能导致 MBMEC 细胞死亡增加以及屏障功能质量降低。第三，本方案中使用的酶应严格按照制造商的说明进行使用和保存，否则可能影响其正常功能。此外，若内皮细胞贴壁不良，可对细胞培养板的包被条件进行调整，可改变纤连蛋白和胶原蛋白的浓度，或在包被液中添加其他基质蛋白。最后，动物饲养设施中动物的年龄、性别、采样季节以及环境条件均为可能影响 MBMEC 分离质量及实验间可比性的重要因素，应确保不同独立实验之间的条件具有一致性。
所述方案应被视为一种用于分离小鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）的基础神经免疫学方法。分离得到的细胞可用于多种应用，以进一步深入了解血脑屏障（BBB）功能，例如迁移实验、基因和蛋白质表达研究、电生理评估或通透性实验。如上所述，BMECs的三维细胞培养系统可能为研究在神经血管单元（NVU）背景下调控血脑屏障的复杂机制提供新的机会。因此，原代内皮细胞的分离在未来仍将是血脑屏障研究领域中一项不可或缺的技术。

脑微血管内皮细胞（BMEC）形成单层结构，是高度特化的血脑屏障（BBB）的重要组成部分。BMEC通过连接蛋白相互连接，并附着于基底膜上。它们与周细胞、平滑肌细胞、星形胶质细胞终足以及循环血细胞共同构成所谓的神经血管单元（NVU）1。与过去认为血液与中枢神经系统（CNS）之间存在不可渗透屏障的观点不同，NVU是一个动态、高度特异且受调控的界面，可控制液体、分子和细胞在脑血管与中枢神经系统之间的转运2。NVU的功能障碍或调节异常可能引发和/或促进多种神经血管性、感染性、炎症性或退行性中枢神经系统疾病，例如缺血性卒中、HIV脑病、多发性硬化症、阿尔茨海默病或帕金森病3-6。
脑微血管内皮细胞（BMEC）单层由紧密连接（TJ）和黏附连接（AJ）构成的连接复合体紧密封闭7。血脑屏障（BBB）具有高电阻力和低旁细胞通透性，主要依赖于TJ蛋白8。TJ是由claudin和occludin家族的跨膜蛋白形成的复合物，这些蛋白通过接头分子（如ZO1-3等zonula occludens蛋白）与内皮细胞的细胞骨架相连4。黏附连接主要由整合膜蛋白血管内皮（VE）-cadherin组装而成，后者通过连环蛋白（catenins）与细胞骨架相连8。
血脑屏障（BBB）的紧密封闭阻止了血液与脑脊液（CSF）之间底物和细胞的自由交换。例外情况是分子量 &#60;400 Da 的亲脂性小分子，这类分子可通过脂质介导的扩散穿过血脑屏障9。较大分子和/或亲水性分子（如葡萄糖、氨基酸、肽、蛋白质以及许多药物）的通过则受限于高度调控的跨细胞转运系统10，这些转运系统可分为五大类：载体介导转运、离子转运、主动外排转运、受体介导转运和小窝蛋白介导转运4。这些转运系统有助于维持中枢神经系统（CNS）的稳态，而稳态是精确信号产生、转导与整合所必需的。此外，脑微血管内皮细胞（BMECs）能够通过表达多种外切酶主动调控特定分子的通过。这些酶定位于细胞表面，可修饰特定的内源性和外源性底物，从而阻碍或允许其通过血脑屏障11。
尽管中枢神经系统长期以来被认为是一个免疫豁免器官，但近期的研究发现表明，中枢神经系统存在一种动态且受到严密调控的免疫监视系统。脑微血管内皮细胞（BMECs）在调控免疫细胞跨内皮迁移过程中起着关键作用。其表面表达的选凝素可选择性诱导淋巴细胞松散地黏附于内皮细胞。分泌的趋化因子与白细胞表面特异性受体结合后，可诱导白细胞整合素（如LFA-1（淋巴细胞功能相关抗原-1）和VLA-4（极迟抗原-4））的表达或构象改变。这些整合素通过与其内皮细胞上的相应受体结合，介导白细胞的牢固黏附。 例如 VCAM-1（血管细胞黏附分子），ICAM-1（细胞间黏附分子），介导细胞经由或穿过血脑屏障（BBB）的脑微血管内皮细胞（BMECs）迁移至脑实质12-14这些及其他发现强调了内皮细胞自身在调控免疫细胞迁移中的主动作用。
此外，作为神经血管单元（NVU）组成部分的脑微血管内皮细胞（BMECs）参与调控与局部神经元代谢需求相关的脑血流量。星形胶质细胞刺激下，内皮细胞可产生一氧化氮等血管活性物质，从而引起血管平滑肌细胞的舒张15。
在发育中以及成年大脑中，血管生成与神经发生表现出平行的模式形成和发展过程，并共享许多调控特性1,4。内皮细胞在这些过程中起着关键作用16,17。
总之，脑微血管内皮细胞（BMECs）提供了确保中枢神经系统（CNS）正常发育和功能的关键特性。血脑屏障（BBB）功能障碍与多种严重的神经系统疾病相关。然而，在脑血管界面中，目前仅发现了极少数可用于特异性且高效治疗的靶点18。长期以来，简化的体外（in vitro）模型已被用于研究复杂生理系统功能与调控机制。本文所述的分离方法以及对小鼠BMECs的体外（in vitro）研究，鉴于目前存在大量特异性的基因敲除小鼠品系，可能有助于进一步理解生理及病理生理条件下血脑屏障的功能与调控机制，从而开辟新的治疗途径。

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>碱性成纤维细胞生长因子</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>牛血清白蛋白</td></tr><tr><td>Collagenase CLS2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>高相对蛋白酶活性</td></tr><tr><td>Collagenase-dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>来自 &lt;em&gt;V. alginolyticus&lt;/em&gt; 的胶原酶，来自 &lt;em&gt;B. polymyxa&lt;/em&gt; 的中性蛋白酶</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0543</td><td>来自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤基底膜</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td>使用前在37 &amp;deg;C水浴中预热</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>牛胰脱氧核糖核酸酶I</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>胎牛血清（亦称牛胎血清）</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>抗凝剂</td></tr><tr><td>PDS</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-850</td><td>血浆来源血清</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>使用前升至室温</td></tr><tr><td>Pyrumycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td>仅应在培养的前两天使用</td></tr></tbody></table>

分离原代小鼠脑微血管内皮细胞

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

血脑屏障在超微结构上由单层脑微血管内皮细胞（BMEC）构成，这些细胞通过紧密连接和黏附连接组成的连接复合体相互连接。与其他细胞类型（如星形胶质细胞或周细胞）共同构成神经血管单元（NVU），该单元特异性调控外周血与中枢神经系统（CNS）之间的液体、分子和细胞交换。通过这一复杂而动态的系统，BMEC 参与维持 CNS 内环境稳态的多种生理过程。血脑屏障功能障碍被认为是多种严重中枢神经系统疾病发病机制中的关键环节。然而，由于其潜在机制尚未完全阐明，目前尚缺乏特异且靶向的治疗手段。
动物与 体外 模型已被广泛用于深入理解复杂的生理和病理生理过程。通过简化和还原，可将研究集中在特定对象上，并排除多种混杂因素的影响。然而，模型系统的可比性和可推广性也随之降低，在评估时需予以考虑。最常见的动物模型以小鼠为基础，主要原因之一是其方法学上的应用可能性在持续增加。 体外 对分离的小鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）的研究可能有助于在生理和病理生理条件下深入分析其特性及血脑屏障的特性。对血脑屏障复杂机制的进一步认识，有望为开发新的治疗策略提供基础。
本方案描述了一种通过一系列物理和化学纯化步骤分离原代小鼠微血管内皮细胞的方法。同时讨论了MBMEC在纯度、培养方面的特殊注意事项，以及质量控制、潜在应用和局限性。

分离后立即出现，小鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）及污染细胞会形成悬浮于细胞培养基中的团块（图1A，第0天）。由于小鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）表达高水平的外排转运蛋白（如P-糖蛋白），对毒素具有相对抗性，因此嘌呤霉素处理可实现对这类细胞的筛选。污染细胞则对嘌呤霉素介导的细胞毒性更为敏感。19在嘌呤霉素筛选过程中，污染细胞会发生凋亡或坏死性细胞死亡，而MBMECs则开始贴附于包被有IV型胶原蛋白/纤连蛋白的细胞培养板上。图1A，第1天和第2天）。至第5天，MBMECs增殖至约80–90%的密度，呈典型的梭形形态。在汇合时，细胞形成单层紧密排列、纵向对齐且无重叠的接触抑制性细胞层（图1A，第5天）。通过吡喃霉素筛选，内皮细胞标志物CD31（PECAM1）显示，MBMEC的纯度可达99%。 图1B）。MBMECs 通过紧密连接蛋白相互连接，形成紧密封闭的单层细胞。培养 7 - 8 天后，内皮细胞层的电阻值趋于稳定（达到典型的 20 - 30 Ω × cm）2）和电容（图1C). 此时可进行细胞迁移实验等功能分析3,20,21 以及通透性测试， 例如 使用伊文思蓝或葡聚糖进行标记。
<img alt="5天内的细胞分化过程；CD31和DAPI的荧光染色；阻抗生长曲线。" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 小鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）的形态学与功能特性。（A） 培养的BMECs在5天内的代表性时间进程，通过透射光显微镜观察。比例尺适用于所有图像。（B） 第5天对内皮细胞标志物CD31进行免疫荧光染色。CD31（绿色）和DAPI（蓝色）。（C） 细胞预先培养5天后，转移至自动化系统以分析其生物物理特性（电阻和电容）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

脑微血管内皮细胞（BMEC）通过特定的连接蛋白相互连接，形成高度调控的屏障，将血液与中枢神经系统（CNS）分隔开来，即所谓的血脑屏障（BBB）。本方案所述的原代小鼠脑微血管内皮细胞的分离，可实现对BBB进行深入的体外研究。

血脑屏障在超微结构上由一层脑微血管内皮细胞（BMEC）构成，这些细胞通过连接复合物相互连接……

本实验的总体目标是获取原代小鼠脑微血管内皮细胞（MBX）。首先分离并匀浆成年小鼠去脑膜的前脑组织，以实现该目标。第二步，通过酶消化法进一步处理组织匀浆物。最后一步中，通过密度梯度离心法分离内皮细胞，并将其接种进行细胞培养。最终，可通过免疫荧光染色检测分离细胞中CD31的表达，以确认脑微血管内皮细胞培养物的纯度。该方法相较于现有技术（如使用永生化脑内皮细胞系）的主要优势在于，利用原代细胞获得的结果更能真实反映体内实际情况，具有更好的可转化性。该方法有助于解答血脑屏障研究领域中的关键问题，例如，哪些通路参与了免疫细胞的迁移过程。该技术的应用意义延伸至中枢神经系统神经血管性、感染性、炎症性或变性疾病的治疗，因为血脑屏障功能障碍在这些疾病的发病机制中起着至关重要的作用。该实验步骤将由本实验室的研究生 Lisa Eeping 演示。从十只八至十二周龄的 C57BL/6 小鼠中分离脑组织后，将组织置于五毫升无菌 PBS 中保存。接着，使用镊子去除脑干、小脑和丘脑，然后将每只脑组织在无菌吸水纸上小心滚动。为去除脑膜，将脑组织收集至50毫升离心管中，加入13.5毫升DM em培养基，先用25毫升移液管，再用10毫升移液管将组织切碎，直至培养基变为乳白色。将组织在胶原酶和DNA酶中于37°C、180 RPM的摇床上消化。一小时后，向组织悬液中加入10毫升DM em培养基，并在4°C、1000 G离心10分钟。弃去上清液，注意不要扰动松散的沉淀，然后用25毫升移液管在25毫升BSA-DMEM中将沉淀吹打约25次。再次离心收集细胞后，使用直径较大的破损玻璃移液管去除乳白色的上层髓鞘层。然后用普通的PE吸管或移液管去除BSA层。将沉淀重悬于9 mL DM em中，然后向细胞中加入1 mL胶原酶消化液和0.1 mL DNase。在37°C、180 rpm条件下于摇床上消化该溶液。在消化过程中，于超速离心机中设置Percoll密度梯度。一小时后，向消化后的细胞悬液中加入 10 毫升 DMEM 以终止反应，随后离心沉淀细胞，并将沉淀重悬于 2 毫升 DMEM 中。将细胞悬液小心地加至 Percoll 梯度液上方，通过离心分离细胞。分离后，细胞可能以浑浊界面的形式可见。将无菌针头以 30 度角轻轻插入界面处，收集约 12 毫升溶液。为了尽可能获取更多细胞并减少污染，通常不应看到界面层。应吸取少量界面层液体。此外，无菌针头的尖端应仔细并持续地移动至界面层的各个部分，将细胞转移至一个新的50毫升Falcon管中，管内含有5毫升DM em培养基，然后再次离心细胞，重悬后按每平方厘米细胞培养板表面积加入0.2毫升内皮细胞培养基悬浮细胞。接下来，从包被的细胞培养板中移除包被液，并用无菌 PBS 连续洗涤每个孔两次。最后，将细胞培养物置于无菌培养箱中，以 37 摄氏度、5% 二氧化碳的条件在内皮细胞培养基中进行培养。在分离后的每两到三天立即更换培养基。小鼠骨髓内皮细胞（BM E）和污染细胞会形成聚集体，可在细胞培养液中观察到漂浮。使用嘌呤霉素（mycin）处理培养基后，由于污染细胞对嘌呤霉素介导的细胞毒性更为敏感，从而实现了小鼠BMAX的筛选。未受影响的骨髓内皮细胞（BM E）逐渐贴附于包被有胶原蛋白和纤连蛋白的细胞培养板上。至第5天，BM E增殖至约80%～90%的融合度，形成一层紧密排列、纵向排列、无重叠且接触抑制的单层细胞，呈现典型的梭形形态。通过嘌呤霉素筛选，可获得纯度高达99%的小鼠BMAX，该纯度经内皮细胞标志物CD31确认。BM E形成的单层细胞结构紧密，通过紧密连接蛋白相互连接。经过七到八天的培养后，这些细胞层会形成稳定的电阻力，达到每平方厘米20至30欧姆，并在此时具有良好的电容性。一旦掌握该技术，即可开展细胞迁移实验或使用伊文思蓝或葡聚糖进行通透性检测等功能分析实验。按照本方案操作，该技术可在四到五小时内完成。还可采用其他方法，如迁移分析、通透性实验或电生理学测量，以回答特定的研究问题，例如，在特定实验条件下免疫细胞的迁移行为如何改变？或者铁通道如何参与血脑屏障的调控？观看本视频后，您应能够充分理解如何通过机械匀浆、酶消化以及密度梯度离心法分离尿液和脑微血管内皮细胞。

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