原代鼠脑微血管内皮细胞的分离

该程序的总体目标是获得原代小鼠、脑微血管内皮细胞或 MBX。这是通过首先分离然后均质化成年小鼠的无脑膜前脑来实现的。在第二步中，组织匀浆通过酶消化进一步加工。

然后在最后一步中，通过密度、梯度、离心分离内皮细胞，并接种用于细胞培养。最终，分离细胞的 CD 31 表达免疫荧光染色可用于确认 MB mech 培养物的纯度。现有方法的这种技术的主要优势，如使用永生化大脑、内皮细胞系，是用原代细胞获得的结果提供了更好的体内可转移性。

这种方法可以帮助回答血脑屏障搜索领域的关键问题，例如，免疫细胞思维涉及哪些通路。该技术的含义延伸到中枢神经系统的神经血管、感染、炎症或退行性疾病的治疗。由于血脑屏障功能障碍与此类疾病的病原体密切相关。

该程序将由我们实验室的研究生 Lisa Eeping 演示。从十只 8 至 12 周龄的 C 57 BL 中分离出大脑后，六只小鼠将组织储存在 5 毫升无菌 PBS 中。接下来，用镊子去除脑干、小脑和丘脑，然后在无菌吸墨纸上小心地滚动每个大脑。

为了去除脑膜，将大脑汇集在 50 毫升猎鹰管中并加入 13.5 毫升 DM em，然后先用 25 毫升移液管切碎组织，然后用 10 毫升移液管切碎，直到培养基变成乳白色。在 37 摄氏度下在轨道振荡器上以 180 RPM 的速度消化胶原酶和 DNA 中的组织。一小时后，向组织悬液中加入 10 毫升 DM em，并在 1000 Gs 和 4 摄氏度下离心细胞 10 分钟。

弃去上清液，注意不要打扰松散的沉淀，然后使用 25 毫升移液器在 25 毫升 B-S-A-D-M-E-M 中将沉淀约 25 次三重。再次离心细胞后，使用大直径的碎玻璃移液器去除乳白色的上髓鞘层。然后用普通 PE 或移液管去除 BSA 层。

沉淀重悬于 9 毫升 DM em 中，然后向细胞中加入 1 毫升胶原酶椎间盘间隙和 0.1 毫升 DNA。在 37 摄氏度下在轨道摇床上以 180 RPM 的速度消化溶液。在消化过程中，在超速离心机中设置 perca 密度梯度。

一小时后，向消化的细胞悬液中加入 10 毫升 DM E em 以停止反应，然后旋转细胞并重新悬浮沉淀 在 2 毫升 DM E em 中，小心地将细胞悬液添加到每次调用梯度的顶部，然后通过离心分离细胞。分离后，细胞可能显示为混浊界面。小心地沿着无菌针头以 30 度角浸入界面，并收集大约 12 毫升的溶液。

界面通常不可见，以获得尽可能多的细胞和尽可能少的污染。应吸出少量接口。除此之外，应小心地连续地将无菌针的尖端移动到界面的每个部分，将细胞转移到含有 5 毫升 DM em 的新 50 毫升 Falcon 中，然后在再次旋转细胞后，重新研磨，将上颚悬浮在细胞培养板的每 1 平方厘米表面 0.2 毫升内皮细胞培养基中。

接下来，从包被的细胞培养板中取出包被溶液，并用无菌 PBS 连续两个洗涤步骤冲洗每个孔。最后，将细胞培养物维持在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的内皮细胞培养基中，置于无菌培养箱中。隔离后每两到三天更换一次培养基。

小鼠 BM、e 和污染细胞形成砾岩，可以观察到这些砾岩漂浮在细胞培养物中。用霉菌素进行培养基处理导致小鼠 BMAX 的选择，因为污染细胞更容易受到 pur 霉素介导的细胞毒性的影响，并且未受影响的 BM E 开始附着在四个纤连蛋白包被的细胞培养板上，直到第 5 天，BME 增殖至约 80% 至 90% 的密度，形成单层紧密堆积， 纵向排列和非重叠的接触抑制细胞，其特征是经 puram Mycin 选择具有典型的纺锤形外观，内皮细胞标志物 CD 31 证实，达到高达 99% 小鼠 BMAX 的高纯度。BM E 形成紧密密封的单层，由紧密连接蛋白相互连接。

经过 7 到 8 天的培养，这些细胞层在 20 到 30 欧姆之间建立了稳定的电阻值 x 平方厘米和充足的电容，此时，一旦掌握，就可以进行功能测定，例如细胞迁移实验或用埃文思蓝或葡聚糖进行通透性测试。该技术可以在手术后 4 到 5 小时内完成。可以进行其他方法，如迁移测定、通透性实验或电生理学测量，以解决这个有远见的问题，例如，在某些实验条件下，免疫细胞运输是如何改变的？

或者铁通道如何参与血脑屏障调节？看完这个视频，你应该对如何通过机械匀浆、酶促、消化、密度梯度离心分离尿液、脑微血管内皮细胞有了很好的了解。