FIM成像和FIMtrack：两个新的工具允许高吞吐量和成本效益分析步态

以下方法的总体目标是可视化和量化果蝇 Melan Gaster 幼虫的运动，从而在自由移动条件下实现高通量筛选。这是通过在 FIM 设置上创建跟踪表面并使用受挫全内反射进行间接照明来实现的。然后将不同基因型的幼虫放置在表面，并记录响应热梯度的爬行行为。

然后，FIM Track 对视频进行分析。获得的软件和数据用于生成描述幼虫、运动模式差异的图表。结果表明，精确、高通量、灵活且易于使用的幼虫定量。

运动可以基于 FIM 成像技术和相关的 FIM 跟踪程序来完成。这种成像技术的主要优点是现有方法（如使用入射光或透射光）的动物是可见的，从而产生极好的前景背景对比度，没有令人不安的伪影，尽管这种方法可以提供对 oph 熔岩生物学的见解。它还可以应用于研究苍蝇的行走行为和其他单一生物的运动，例如海洋优雅、全体，甚至植物的根系生长。

这种方法的可视化演示对于让其他人相信复杂的技术易于使用至关重要。第一步是为基于 FITR 的成像方法或 fim 创建一个潮湿的爬行表面。为此，在去离子超纯水中煮 0.8% 食品级螺旋钻。

将热螺旋钻倒在亚克力玻璃板上。煮沸后不要搅动螺旋钻并不断倾倒。为避免在此温度下产生气泡，应制作 2 毫米厚的板。

使用剩余的螺旋溶液填充标准的 6 厘米培养皿。这些将用于在实验之前对幼虫进行分类、清洁和适应。接下来，从螺旋钻板的周边修剪约两厘米，以获得用于记录的普通方形表面。

冷却后，直接将螺旋钻板转移到 FIM 设置中。通过将螺旋钻轻轻推过亚克力玻璃板的边缘，螺旋钻应滑到适当的位置。您现在已准备好进行成像准备，以在爬行表面中包括一个厌恶的螺旋屏障。

在去离子超纯水中用三摩尔 NACL 煮沸 2.5% 食品级螺旋钻。接下来，在先前浇筑的爬行表面上切一个围绕视野的 2 厘米宽的缺口。准备好后，用比跟踪表面高 0.1 至 0.3 厘米的盐螺旋钻填充缺口。

接下来，准备热梯度装置。该装置是一块铝板，上面覆盖着绝缘表面，并在两端灌注了来自泵的水。为了实现温度控制，请在使用前一小时打开热梯度装置，并将其放置在设置上方，使其达到所需温度。

这段时间可以用于进一步的准备。准备好后，将带有盐屏障的爬行表面螺旋钻转移到设置中。将散热器板放在螺旋钻上，并将板和爬行表面之间的间距调整为 2 毫米。

通过将水回路的温度调整到 1 摄氏度到 45 摄氏度，建立从 34 摄氏度到 18 摄氏度的线性梯度，这适用于该设备。让爬行表面在梯度中平衡 20 分钟。在继续之前，用 TER 测试温度梯度以准备果蝇，从 25 摄氏度的培养箱中取出它们，然后将少许水滴入培养瓶中，以驱动星形幼虫的晚期第三运动。

接下来，在录制前 2 到 5 分钟，使用小画笔从小瓶壁上收集最大的幼虫，将足够用于一个视频的幼虫转移到较早准备好的培养皿中。建立温度梯度后，设置记录软件。指定每个视频的帧数。

定义保存路径并设置为在 20 秒内进行即时录制。将幼虫放在爬行表面上开始对幼虫之一进行成像并调整照明强度以获得良好的对比度后。准备好后，轻轻抬起散热器板，将幼虫置于 34 摄氏度，距离盐屏障 2 厘米处。

再次放下散热器板并在黑暗中开始录制，以免打扰动物。记录后，将幼虫清除干净并滋润表面。为避免扩散 NACL，工作时请勿触摸盐螺旋钻，同时必须始终保持表面湿润，避免过度潮湿，这可能被视为幼虫周围的光晕或水滴。

在记录和干扰跟踪中，让螺旋钻表面平衡一到两分钟，然后再继续。在此期间，保存收集的图像并收集新的动物。要准备下一个视频，请使用每 5 个视频使用 TER 控制温度梯度，并根据需要调整温度设备。

要开始跟踪运动，请使用预览选项调整跟踪参数。根据相机和视野调整每像素毫米数。接下来，根据相机设置调整每秒帧数，使用预览窗口中给出的反馈来调整亮度阈值，以便正确检测所有动物。

接下来，调整幼虫区域大小阈值，单只动物用黄色圆圈突出显示，碰撞的幼虫用红色突出显示，每只动物的区域用蓝色给出。在跟踪会话结束后，使用右下角的按钮开始跟踪，图像目录中存储了包含幼虫轨迹的图像和包含计算的运动和姿势特征的 CSV 文件。最后，使用 FIM 结果查看器模块查看和手动调整跟踪结果。

定义相对于热梯度的爬行方向，以根据此刺激评估数据。在此处显示的幼虫表示中，头点和尾点标记在这些点之间。可以使用半径设置任意数量的奇数脊椎点。

此外，还计算了质心和主体弯曲角度。此处显示的是来自不同相机的 FI 成像和跟踪结果。左侧的图像捕捉到了三只幼虫在 10 厘米 x 10 厘米的跟踪平台上爬行。

单个幼虫的质量轨迹和面积如右图所示。红色箭头表示应用后剪切图像的时间点。热刺激在这里显示为通过 F 轨道计算的不同颜色轨迹。

这些星形幼虫中第三、第二和第一的高分辨率应用图像是用微距镜头获得的。其他生物，如海洋，也可以很容易地成像。掌握后，每个跟踪设置每小时可以分析大约 100 个实验室。

在尝试此过程时，请务必记住始终在遵循此过程的相同条件下进行录制。其他方法，如光遗传学刺激或神经活动的体内检测，可以包括在设置中。观看此视频后，您应该对有效分析运动有多么容易。