Name: 小鼠胚胎感觉轴突预测整个安装成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习小鼠胚胎感觉轴突全装成像技术，通过固定、染色、脱水及透明化处理，利用tau lacZ报告基因系统评估伤害感受器轴突生长表型，为神经发育与疼痛机制研究提供可靠方法。

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作者谨此感谢 Louis Reichardd 博士提供的 TrkAtaulacZ 小鼠，以及 Annette Markus 博士富有见地的讨论和建议。本研究得到了 Burke 基金会的启动资金，Whitehall 基金会研究资助（2010-08-61），Wings for Life 基金会研究资助（WFL-US-028/14），Christopher &amp; Dana Reeve 基金会资助（ZB1-1102-1），以及美国国立眼科研究所资助（1R01EY022409 和 3R01EY022409-01S1）对 JZ 的支持。KJO 是 Goldsmith 研究员。

注意：所有操作均符合《美国国立卫生研究院实验动物使用与护理指南》。动物实验方案已由中国台湾康奈尔医学院 IACUC 批准。
1. 组织制备
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法处死妊娠时间明确的雌性小鼠15。从妊娠时间明确的雌性小鼠中分离出胚胎期 E16–E18 的胚胎，并将每个胚胎单独置于6孔板的孔中，孔内预先加入冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
	<li>用冷的 PBS 清洗胚胎。</li>
	<li>取胚胎羊膜的一小部分，放入预先配制好的蛋白酶 K 溶液中，用于后续基因型鉴定。或者，若羊膜已丢失，可取胚胎尾尖的一小部分，放入蛋白酶 K 溶液中。</li>
	<li>使用昆虫针在胚胎全身皮肤上穿刺打孔（每侧至少100个孔）。</li>
	<li>吸除 PBS，缓慢向孔中加入新鲜的 2% 多聚甲醛（PFA），pH 7.4。</li>
	<li>在 4 °C 下轻轻振荡固定 2 小时。</li>
	<li>用 PBS 清洗胚胎两次，随后将胚胎置于 PBS 中，4 °C 保存，待染色时使用。</li>
</ol>
2. 基因分型
<ol>
	<li>根据制造商说明书，将羊膜或胚胎尾部浸入蛋白酶K混合液中。</li>
	<li>在56 °C下孵育10分钟。</li>
	<li>使用市售的DNA纯化试剂盒提取DNA。</li>
	<li>取总共200 µl纯化基因组DNA溶液中的0.5 µl，加入0.5 µl的各基因特异性正向与反向引物（10 µM）、2 µl dNTP混合液（dATP、dCTP、dGTP和dTTP均为2.5 mM）、0.2 µl Taq DNA聚合酶（5 U/µl）和2 µl PCR缓冲液（10×），用H2O补足至总体积20 µl。 
	注：引物序列如下（表1）： 
	TrkA：TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG，TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG；PCR扩增片段长度：400个碱基对（bp）。 
	Bax：In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG，Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG，NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG；PCR扩增片段长度：野生型为304 bp，Bax基因敲除型为507 bp。 
	TauLacZ：lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA，lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G；PCR扩增片段长度：360 bp。</li>
	<li>对TrkA进行PCR扩增，程序如下：步骤1：95 °C下1分钟；步骤2：95 °C下10秒；步骤3：68 °C下20秒；步骤4：72 °C下30秒；重复步骤2至4共40个循环。
	<ol>
		<li>对LacZ和Bax进行PCR扩增，程序如下：步骤1：95 °C下1分钟；步骤2：95 °C下10秒；步骤3：54 °C下1分钟；步骤4：72 °C下1分钟；重复步骤2至4共35个循环。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将PCR样品在1×Tris-乙酸-EDTA缓冲液中，以100 V电压在2%琼脂糖凝胶上电泳20分钟，并设置DNA分子量标记条带以测定扩增片段长度。</li>
	<li>分析胚胎中是否存在野生型TrkA、TrkA-tauLacZ以及Bax基因敲除等位基因。实验胚胎的基因型为TrkAtaulacZ/WT : Bax -/-和TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/-，具体取决于实验设计。缺乏tauLacZ报告基因的胚胎将不显示轴突染色，因此可作为阴性对照用于校准染色过程。</li>
</ol>
3. 胚胎染色
<ol>
	<li>使用商业化的 lacZ 染色试剂盒，并根据下文 第 3.2 - 3.8 节 所述进行部分修改。此处使用 Millipore 试剂盒。</li>
	<li>将胚胎浸入缓冲液 A 中，于室温下轻轻振荡，至少孵育 1 小时。</li>
	<li>将胚胎直接浸入缓冲液 B 中，于室温下轻轻振荡，至少孵育 15 分钟。</li>
	<li>当胚胎处于缓冲液 A/B 中时，将组织基础溶液预热至 37 °C。每枚胚胎使用 5 ml 组织基础溶液。</li>
	<li>当胚胎处于缓冲液 A/B 中时，用 100% 二甲基亚砜（DMSO）配制新鲜的 5-溴-&#8203;4-&#8203;氯-&#8203;3-&#8203;吲哚基-α-D-半乳糖吡喃糖苷（X-gal），使其浓度为 40 mg/ml。</li>
	<li>将 X-gal 按 1 mg/ml 的终浓度稀释至预热的组织基础溶液中，并将 5 ml X-gal/组织基础溶液混合液加入玻璃闪烁瓶中。</li>
	<li>将胚胎转移至含有 X-gal/组织基础溶液混合液的玻璃闪烁瓶中，用 Parafilm 封口膜密封瓶盖，在 37 °C 下过夜孵育，并观察蓝色染色的出现情况。</li>
	<li>用新鲜的 4% 多聚甲醛（PFA，pH 7.4）对胚胎进行后固定处理，在 4 °C 下轻轻振荡 4 小时。</li>
	<li>用冷 PBS 缓冲液清洗胚胎两次。</li>
</ol>
4. 组织脱水与透明
<ol>
	<li>将胚胎置于50%甲醇/50% PBS混合液中，在室温下于玻璃小瓶中振荡30分钟。</li>
	<li>继续在75%甲醇/25% PBS中于室温下振荡30分钟，进行脱水处理。</li>
	<li>继续在90%甲醇/10% PBS中于室温下振荡30分钟，进一步脱水。</li>
	<li>继续在100%甲醇中于室温下振荡30分钟（两次），完成脱水。</li>
	<li>在胚胎脱水的同时，配制体积比为1:1的苯甲醇与苯甲酸苄酯混合液。 
	注意：苯甲醇和苯甲酸苄酯具有毒性。</li>
	<li>将胚胎浸入100%甲醇与100% BABB按体积比1:1配制的混合液中，孵育15分钟。仅可使用玻璃器皿，因为BABB会溶解塑料。</li>
	<li>将胚胎浸入100% BABB中，直至组织完全透明，以便观察透明化胚胎中的X-gal染色结果。 
	注意：应尽快成像，因为X-gal染色会随时间逐渐褪色。</li>
</ol>
5. 全组织成像
<ol>
	<li>使用金属镊子将浸没在100% BABB中的胚胎固定在适合摄影的角度。采用透射光和反射光光源组合进行照明。</li>
	<li>使用配备数字相机的体视显微镜采集图像。沿Z轴方向，每隔0.5 mm选取一个焦平面，连续获取五个焦平面的多张明场曝光图像。曝光时间和光圈值可根据照明条件和相机参数进行调整，并需针对每个实验装置优化设置。</li>
	<li>使用标准图像处理软件对叠加图像进行处理，并生成拼接图。</li>
</ol>

<ol><li>Verze, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+innervation+in+hereditary+sensory+and+autonomic+neuropathy+type+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV.</a> Neurology. 55, 126-128 (2000).</li>
<li>Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+sensory+abnormalities+in+children+and+adolescents+with+complex+regional+pain+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes.</a> Pain. 131, 153-161 (2007).</li>
<li>Uceyler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fibers+in+Fabry+disease%3A+baseline+and+follow-up+data+under+enzyme+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy.</a> J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).</li>
<li>Reichardt, L. F., Mobley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+the+distance%2C+or+not%2C+with+neurotrophin+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Going the distance, or not, with neurotrophin signals.</a> Cell. 118, 141-143 (2004).</li>
<li>White, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+onset+of+NGF+and+TrkA+survival+dependence+in+developing+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia.</a> J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).</li>
<li>Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurotrophin+and+Trk+receptor+functions+in+developing+sensory+ganglia%3A+direct+NT-3+activation+of+TrkB+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo.</a> Neuron. 21, 325-334 (1998).</li>
<li>Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+and+akt+mediate+distinct+aspects+of+sensory+axon+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth.</a> Neuron. 35, 65-76 (2002).</li>
<li>Kuruvilla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurotrophin+signaling+cascade+coordinates+sympathetic+neuron+development+through+differential+control+of+TrkA+trafficking+and+retrograde+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling.</a> Cell. 118, 243-255 (2004).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+kinase+signaling+functions+in+sensory+neuron+differentiation+and+axon+growth+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo.</a> Nature. 10, 598-607 (2007).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+develops+in+the+absence+of+normal+projection+neurons+or+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons.</a> Neuron. 21, 1273-1282 (1998).</li>
<li>Moqrich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressing+TrkC+from+the+TrkA+locus+causes+a+subset+of+dorsal+root+ganglia+neurons+to+switch+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate.</a> Nature. 7, 812-818 (2004).</li>
<li>Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax-deficient+mice+with+lymphoid+hyperplasia+and+male+germ+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death.</a> Science. 270 (5233), 96-99 (1995).</li>
<li>Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+support+the+development+of+diverse+sensory+axon+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies.</a> J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).</li>
<li>Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sensory+neurons+in+the+absence+of+NGF%2FTrkA+signaling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo.</a> Neuron. 25, 345-357 (2000).</li>
<li>Donovan, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-RAF+kinase+drives+developmental+axon+growth+and+promotes+axon+regeneration+in+the+injured+mature+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS.</a> The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).</li>
<li>Mercer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+endogenous+oncogenic+V600EB-raf+induces+proliferation+and+developmental+defects+in+mice+and+transformation+of+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts.</a> Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).</li>
<li>Tronche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+glucocorticoid+receptor+gene+in+the+nervous+system+results+in+reduced+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety.</a> Nature genetics. 23, 99-103 (1999).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI-labeling+of+DRG+neurons+to+study+axonal+branching+in+a+whole+mount+preparation+of+mouse+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

上述胚胎X-gal染色步骤 TrkAtaulacZ 小鼠胚胎能够在完整固定的标本中实现长距离轴突投射的快速且详细的可视化。由于 Bax null背景的小鼠可用于探究可能参与轴突生长和神经元存活的信号机制。与感兴趣的转基因或基因敲除小鼠进行杂交，可对轴突表型进行全面评估，并可为未来更深入地研究轴突生长信号通路提供有用的指导。. 一个主要挑战是 体内 轴突生长研究中，制备组织切片并评估生长轴突的复杂表型所需的时间，是可能受到任何单一基因操作多方面影响的关键因素。 TrkAtaulacZ/taulacZ Bax-/- 该品系可用于全面评估目的基因对周围伤害性感受器轴突发育的全部影响。
该技术仅限于可视化在早期发育阶段正常表达 TrkA 的伤害性感受器轴突轨迹。除了外周伤害性感受器外，还可能可视化交感神经和基底前脑胆碱能投射；然而，这需要对染色技术进行特定的优化。<...

精确神经网络的建立是一个复杂的发育过程，对神经系统功能至关重要。该过程的紊乱会导致神经元功能障碍，这已证实与人类神经系统疾病相关1-3。为研究哺乳动物中轴突生长及靶向支配的潜在分子机制，我们开发了一种实验方案，通过结合两种基因修饰小鼠品系，可视化表达 TrkA 的感觉神经元的轴突投射路径。
TrkA 是神经生长因子 NGF 的受体，也是伤害性感觉神经元的功能标志物4TrkA 在发育早期的伤害感受性神经元中高表达，介导 NGF 依赖性的神经元存活、轴突生长、分支形成及靶组织支配5-9在 TrkAtaulacZ 小鼠，野生型 TrkA 基因被替换为一个 taulacZ 表达盒10，从而可通过β-半乳糖苷酶（X-gal）染色观察到假定TrkA阳性神经元的轴突形态11. 使用杂合子 TrkAtaulacZ/WT 通过该细胞系，我们可以研究可能调控或干扰感觉传入纤维投射发育的相关因素。 体内.
此外，TrkAtaulacZ/taulacZ 纯合小鼠中不存在 TrkA 表达，因此可用于在缺乏 NGF/TrkA 信号传导的情况下评估促进轴突生长的机制。由于伤害感受神经元不仅依赖 NGF/TrkA 信号通路进行轴突生长，还依赖其维持存活，我们采用另一种缺失促凋亡基因 Bax 的小鼠品系，以抑制胚胎期背根神经节（DRG）神经元的凋亡，从而挽救在缺乏 TrkA 信号时通常发生的细胞死亡。Bax-/- 背景12 因此使得能够对特异性影响轴突生长的信号通路进行分子层面的解析7-9,13-15。在 TrkA-/- : Bax-/- 小鼠中，DRG 神经元得以存活，但皮肤中的感觉传入神经支配则完全消失14,15。我们可选择性地激活特定信号通路，以确定其各自在轴突投射发育过程中的作用。该方法的优势在于，允许评估当不同遗传修饰引入 TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/- 或 TrkAtaulacZ/WT : Bax-/- 背景时，轴突生长表型发生的变化。

<table><tbody><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Tech</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>组织清洗液 A</td><td>Millipore</td><td>BG-6-B</td><td></td></tr><tr><td>组织清洗液 B</td><td>Millipore</td><td>BG-7-B</td><td></td></tr><tr><td>组织染色基础溶液</td><td>Millipore</td><td>BG-8-C</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>玻璃闪烁小瓶</td><td>Kimble Chase</td><td>74500-20</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Labline</td><td>Model 120</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>FST</td><td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>引物</td><td>IDT</td><td>定制 DNA 引物</td><td></td></tr><tr><td>Takara dNTP 混合物</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA 缓冲液</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA Taq 酶</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td></td></tr><tr><td>苯甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸苄酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M205A</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Leica</td><td>DFC310FX</td><td></td></tr><tr><td>环形光源</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>MEB110</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop 4.0</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎感觉轴突投射的全组织成像

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

在胚胎中可视化全长神经元投射对于理解哺乳动物神经网络的发育过程至关重要。本文描述了一种标记全长神经元投影的方法 原位 利用多种基因操作小鼠品系，研究背根神经节（DRG）轴突投射的一个亚群，以评估其表型特征。TrkA阳性神经元为伤害感受神经元，专门负责传递痛觉信号。我们采用一种 TrkAtaulacZ 小鼠品系以标记完整小鼠胚胎中所有TrkA阳性外周轴突的投射路径。我们进一步培育该 TrkAtaulacZ 线接入 Bax 空白背景，该背景基本消除了神经元凋亡，从而能够在排除遗传操作对神经元存活潜在影响的前提下，独立评估与生长相关的问题。随后，将感兴趣的经遗传修饰的小鼠与 TrkAtaulacZ/Bax 空行，随后即可使用本文所述技术进行研究。本演示文稿包含小鼠繁育方案、解剖时的基因分型、组织制备、染色与透明化处理的详细信息，以实现对整体装片中完整轴突投射路径的可视化观察。

TrkAWT/taulacZ : Bax-/- 和 TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/- 胚胎的基因型可通过标准PCR基因分型明确确定（图1）。X-gal染色可在常规染色的胚胎中显示详细的外周轴突分支结构（图2、图3a），经组织透明化处理后则可观察整个胚胎内的轴突分布（图3b、图4）。
我们已培育出 TrkAWT/taulacZ Bax-/- 携带组成型激酶激活型B-RAF（V600E）突变（LSL-kaBraf）的小鼠品系16在神经元特异性巢蛋白启动子的调控下17，以获得 LSL-kaBraf : TrkAtaulacZ/taulacZ Bax-/- 小鼠。在这些完全缺乏 TrkA 信号传导的胚胎中，伤害性感受器外周投射的形态仍然几乎正常地发育...

本文介绍了一种优化的实验方案，用于对胎鼠进行基因分型、染色及样本制备，以实现对整个动物体内周围伤害性感受器轴突投射的成像，从而有效评估遗传工程小鼠发育过程中感觉轴突生长的表型特征。

在胚胎中可视化全长神经元投射对于理解哺乳动物神经网络的发育过程至关重要。本文中……

以下实验的总体目标是有效评估发育中胎鼠的感觉轴突生长表型。首先需正确地繁殖并进行基因分型，获得tau-lacZ报告小鼠，以便后续作为第二步开展染色分析。随后对小鼠胚胎进行固定和染色处理，从而在整体动物水平上可视化观察感觉轴突的投射情况。接下来，对胚胎进行脱水和透明处理，以完全观察深层的轴突投射，否则这些结构将无法看到。结果表明，这些方法是快速评估胚胎伤害性感受轴突生长表型的有效手段。利用 track a Tau Lae 报告系统，该方法可通过将研究者感兴趣的基因导入 track a tlac Z 背景中，帮助回答感觉轴突生长领域的关键科学问题，并筛选感觉轴突生长表型的任何变化。我们的技术在治疗方面具有潜在意义，科学家可利用该技术检验已知的先天性突变是否可能导致感觉轴突生长的表型。首先，按照文本方案中所述，通过颈椎脱位法对已定时妊娠的雌性小鼠实施安乐死，随后从定时妊娠的雌鼠中分离出胚胎期 E16 至 E18 的胚胎，并将每个胚胎单独放入六孔板的孔中，孔内盛有冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。用冷 PBS 清洗胚胎后，取胚胎的一小部分羊膜组织，放入 DNA 纯化试剂盒中预先配制的蛋白酶 K 溶液中，用于后续基因分型分析。或者，如果羊膜已丢失，可切取胚胎尾部尖端的一小部分，并将其置于蛋白酶K溶液中。接着，使用昆虫针在胚胎周围皮肤上穿刺，每侧约打100个孔。移除PBS，轻轻振荡两小时后，在4°C条件下缓慢向孔中加入新鲜的2%多聚甲醛（PFA）溶液，pH值为7.4。用 PBS 清洗胚胎两次，并在 4 摄氏度的 PBS 中保存，直至进行染色以用于基因分型。根据制造商说明书，将羊膜或胚胎尾部浸入蛋白酶 K 混合液中。在 56 摄氏度下孵育 10 分钟。使用市售的DNA纯化试剂盒提取DNA后，取总量为200微升的纯化基因组DNA溶液中的0.5微升，按照文本方案中的描述配制PCR反应体系，随后按其中详细说明的程序运行PCR。PCR完成后，将PCR产物在含有乙酸-EDTA缓冲液的2%琼脂糖凝胶中以100伏电压电泳20分钟。加入DNA分子量标记物以评估片段长度，并按照常规实验方案对凝胶进行染色。分析胚胎中是否存在野生型、a型轨迹、a型轨迹tau lae以及回交空等位基因。对胚胎进行染色时，使用市售的lax e染色试剂盒，并采用此处描述的改进方法。首先，将胚胎浸入缓冲液A中，在室温下轻轻振荡，孵育至少一小时。随后，直接将胚胎浸入缓冲液B中，在室温下轻轻振荡，孵育至少15分钟。接下来，将40毫克/毫升的xal储备液稀释至预热的组织基溶液中，终浓度为1毫克/毫升。向玻璃闪烁瓶中加入五毫升所得混合物。将胚胎转移至含有xal组织基混合物的玻璃闪烁瓶中。用perfil密封瓶盖，并在37摄氏度下孵育过夜。检查是否存在蓝色染色。然后用新鲜的4% PFA（pH 7.4）对胚胎进行后固定。在4°C下轻轻振

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小鼠胚胎感觉轴突预测整个安装成像

来源： Liau, E. S. et al. 利用光片荧光显微镜对小鼠胚胎中运动轴突导向的可视化及轴突分支的定量分析。J. Vis. Exp. (2018)。...

使用光片荧光显微镜观察运动神经元投射及轴突分支

来源：Jeong, S. 在Drosophila中可视化胚胎运动神经元的轴突投射模式。J. Vis. Exp. (2017)本视频展示了轴突投射的可视化方法 果蝇...

Drosophila 胚胎运动神经元轴突投射模式的可视化

神经前体细胞的有丝分裂是神经发生过程中的一个关键参数。目前对神经前体细胞有丝分裂的大部分认识主要基于对固定组织的分析。在胚胎脑切片中进行活体成像是一种多功能的技术，可在受控环境中以高时间和空间分辨率评估有丝分裂过程。...

活体成像小鼠胚胎大脑皮层发育过程中的有丝分裂

哺乳动物的皮肤包含多种结构——如毛囊和神经末梢——这些结构具有独特的空间分布模式。将皮肤作为平铺标本进行分析，可利用该组织的二维几何特性，获得皮肤结构的全层高分辨率图像。...

小鼠皮肤平铺成像及其在毛囊排列模式与感觉轴突形态分析中的应用

本研究详细介绍了一种标准的免疫组织化学方法，用于观察晚期16阶段黑腹果蝇（Drosophila...

在 Drosophila 胚胎运动神经元轴突投射模式的可视化

本文描述了一种用于可视化转基因 Hb9::GFP...

利用光片荧光显微镜观察小鼠胚胎运动轴突导向及量化轴突分支

本文介绍一种用于小鼠脑组织透明化、荧光标记及大规模成像的实验流程，该方法可实现新皮层中细胞类型三维空间组织结构的可视化。...

小鼠新皮层细胞组织的大规模三维成像

透射电子显微镜与宫内转导相结合是一种研究神经系统发育过程中精细超微结构形态变化的有力方法。这种联合技术能够深入揭示神经可塑性相关结构细节的变化及其拓扑表征。...

子宫内转导发育期小鼠脑和脊髓后超微结构神经可塑性参数的评估

本方案旨在演示如何将DNA/DOTAP混合物显微注射到一天龄Xenopus...

Xenopus laevis 胚胎眼芽中DNA的显微注射及完整活体Xenopus蝌蚪中表达GFP的视神经轴突丛的成像

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

活体双光子成像观察小鼠皮肤触觉感觉轴突形态

学习小鼠胚胎感觉轴突全装成像技术，通过固定、染色、脱水及透明化处理，利用tau lacZ报告基因系统评估伤害感受器轴突生长表型，为神经发育与疼痛机制研究提供可靠方法。

小鼠胚胎感觉轴突投射的全组织成像

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